Un protocole optimisé pour l’infection à Candida albicans chez Schmidtea mediterranea afin d’étudier la pathogenèse fongique et la défense de l’hôte

Résumé

Ce protocole fournit un guide optimisé et détaillé pour utiliser la planaire Schmidtea mediterranea comme système modèle pour étudier les interactions hôte-pathogène lors d’une infection fongique. La méthode s’appuie sur la procédure précédente d’infection des planaires avec le pathogène fongique humain Candida albicans, fournissant des conseils détaillés pour améliorer la reproductibilité et la cohérence expérimentale.

Résumé

Candida albicans est un agent fongique opportuniste courant qui colonise de manière asymptomatique la plupart des humains. Bien qu’il s’agisse généralement d’une maladie comensale bénigne, la dysbiose causée par l’utilisation d’antibiotiques, un dysfonctionnement immunitaire ou une perturbation de la barrière épithéliale peut déclencher une prolifération fongique et des infections, allant de la maladie muqueuse superficielle à la candidose systémique potentiellement mortelle. De nouveaux modèles d’infection précliniques sont nécessaires pour disséquer la pathogenèse de C. albicans in vivo à travers différents stades d’infection et avec des résultats mesurables différents de l’hôte. Le planaire Schmidtea mediterranea avait déjà été établi comme hôte invertébré pour étudier les interactions hôte-pathogène lors de l’infection par C. albicans . S. mediterranea repose entièrement sur des mécanismes immunitaires innés conservés capables de vaincre l’infection par des micro-organismes pathogènes, y compris les bactéries et les champignons. La remarquable capacité régénérative des planaires et ses populations de cellules souches accessibles font de cet organisme un modèle facile pour analyser les réponses immunitaires précoces, la réparation tissulaire et l’élimination des agents pathogènes in vivo. Ce modèle permet l’analyse simultanée de la virulence fongique et des réponses transcriptionnelles de l’hôte, fournissant des informations précieuses sur la dynamique de l’infection. Ici, un protocole mis à jour avec des modifications détaillées, des procédures standardisées et des étapes optimisées pour infecter S. mediterranea avec C. albicans a été présenté, conçu pour améliorer la reproductibilité et permettre des études systématiques sur la pathogenèse fongique et la défense de l’hôte.

Introduction

Candida albicans est un agent pathogène fongique opportuniste courant qui colonise asymptomatiquement 50 à 70 % des^{humains 1,2,3}. Typiquement, un comensal, inoffensif, C. albicans peut se développer dans des conditions telles que le déséquilibre microbiote, l’utilisation d’antibiotiques, l’immunosuppression, la perturbation de la barrière épithéliale ou la présence de dispositifs médicaux, conduisant à des maladies allant d’infections muqueuses superficielles à une candidose systémique potentiellement^{mortelle 4,5}. Chez les personnes immunodéprimées – y compris celles atteintes du VIH/SIDA, les patients suivant une chimiothérapie ou des thérapies immunosuppressives, les personnes atteintes de maladies chroniques ou celles en soins intensifs – les taux de mortalité peuvent dépasser 70 %, soulignant le fardeau important de la candidose invasive en santé^{publique 6,7,8}. À l’échelle mondiale, les infections fongiques invasives touchent plus de 6,5 millions de personnes chaque année, les coûts directs des soins de santé dépassant aux États-Unis seulement 8 milliards de dollars par an pour les infections liées au candida ^9,10. Malgré la disponibilité des traitements antifongiques, les taux de morbidité et de mortalité associés aux infections à C. albicans sont restés largement inchangés pendant des décennies, soulignant l’urgence de mieux comprendre les interactions hôte-pathogène dans les maladies fongiques.

C. albicans utilise un répertoire diversifié de facteurs de virulence qui soutiennent la colonisation, la persistance et la pathogenèse à travers divers environnements hôtes. Cela inclut l’adhésion aux tissus de l’hôte, l’évasion immunitaire, le remodelage de la paroi cellulaire, la sécrétion d’enzymes hydrolytiques, la plasticité morphologique et la formation de biofilms 11,12,13,14,15,16. Collectivement, ces traits permettent à C. albicans de s’adapter à des niches d’hôtes diverses, de moduler les réponses immunitaires et de résister aux thérapies antifongiques 16,17,18,19,20,21. Expliquer comment ces processus influencent les résultats de l’infection – y compris la morbidité de l’hôte, la mortalité et l’élimination des agents pathogènes – est essentiel pour développer des stratégies préventives et thérapeutiques plus efficaces.

Pour étudier ces dynamiques hôte-pathogène, nous avons établi un système modèle utilisant le planaire Schmidtea mediterranea comme hôte 22,23,24. Ce modèle sert de plateforme polyvalente pour étudier la réponse multisystémique de l’hôte à l’infection fongique, en s’appuyant sur une méthode d’infection basée sur le trempage qui permet une exposition synchrone des animaux à C. albicans. La section suivante présente des procédures mises à jour étape par étape qui affinent ce protocole, améliorent la reproductibilité et facilitent une mise en œuvre cohérente entre les laboratoires.

Les planaires sont des invertébrés libres dotés d’une capacité régénérative exceptionnelle, capables de remplacer rapidement les tissus perdus par blessure ou^{infection 25}. Ils ne disposent pas de système immunitaire adaptatif et reposent entièrement sur des défenses innées conservées – incluant les récepteurs de reconnaissance de motifs, les peptides antimicrobiens, la sécrétion de mucus et les cellules phagocytaires – pour éliminer les agents pathogènes bactériens et fongiques en^{les jours 26, 27, 28, 29}. Parce que l’immunité innée représente la première ligne de défense chez les eucaryotes et reste peu étudiée en dehors des systèmes^{mammifères 27}, les planaires offrent une opportunité d’examiner ces processus in vivo avec une résolution cellulaire et moléculaire. Leur capacité régénératrice est alimentée par des cellules souches pluripotentes adultes, appelées néoblastes, qui constituent environ 30 % des cellules adultes et contribuent à la récupération après^{infection 23,30}. Ces caractéristiques font de S. mediterranea un modèle puissant pour disséquer la virulence des agents pathogènes et la défense de l’hôte à l’échelle génétique, cellulaire, tissulaire et organisme, nous permettant de répondre à des questions souvent difficiles à étudier avec les systèmes mammifères traditionnels.

De plus, la petite taille des planaires (généralement quelques millimètres de long), son faible coût et sa facilité d’entretien^permettent des expériences à grande échelle tout en évitant les contraintes financières, éthiques et réglementaires propres aux modèles vertébrés. Comme C. albicans, S. mediterranea est génomiquement manipulable, avec un génome entièrement séquencé et annoté, et il supporte des techniques moléculaires et cellulaires avancées – incluant le profilage transcriptionnel, l’immunohistochimie et l’histologie à haute résolution, ainsi que l’interférence robuste de l’ARN (ARN)32,33,34,35,36,37,38. Ces outils permettent une analyse parallèle des réponses de l’hôte et des agents pathogènes pendant l’infection.

Plusieurs modèles précliniques alternatifs ont été utilisés pour étudier les infections fongiques. Les hôtes invertébrés tels que Galleria mellonella (papillon de cire), Caenorhabditis elegans (ver rond) et Drosophila melanogaster (mouche des fruits), ainsi que le vertébré Danio rerio (poisson-zèbre), offrent chacun des avantages expérimentaux distincts mais présentent aussi des limites notables. Ces systèmes reposent souvent sur la survie comme critère principal car les infections induisent rapidement la mort de l’hôte, empêchant une évaluation détaillée de la morbidité, de la récupération et des réponses multisystémiques – des caractéristiques que le modèle planaire capture facilement.

Les modèles mammifères tels que Mus musculus (souris), Rattus norvegicus (rat), Oryctolagus cuniculus (lapin) et Cavia porcellus (cochon d’Inde) reproduisent plus fidèlement la physiologie humaine mais sont limités par des coûts élevés, des tailles de cohortes réduites, des exigences éthiques et réglementaires, ainsi que par la difficulté de distinguer les réponses immunitaires innées de celles adaptatives. De plus, des décennies de recherche sur la pathogenèse fongique chez la souris se sont principalement concentrées sur les infections systémiques à un stade avancé 39,40,41,42,43, souvent négligant des événements précoces tels que la perturbation de la barrière épithéliale et la prolifération muqueuse – les voies d’initiation les plus courantes des maladies fongiques ^{chez l’humain} 44,45,46.

L’étude des interactions hôte-pathogène est donc essentielle pour comprendre les processus biologiques sous-jacents à la virulence fongique, à la défense de l’hôte et à la progression de la maladie. Les infections fongiques envahissantes représentent une menace mondiale croissante, avec de multiples espèces manifestant désormais une résistance à toutes les grandes classes de médicaments antifongiques. On estime que plus d’un milliard de personnes sont touchées par des infections fongiques, et des facteurs tels que le changement climatique, l’utilisation généralisée d’antimicrobiens et le nombre croissant de personnes immunodéprimées accélèrent l’apparition de pathogènes résistants^{aux antifongiques} 47,48,49,50. Comprendre comment les champignons pathogènes colonisent et interagissent avec leurs hôtes est essentiel pour développer de nouvelles stratégies préventives et thérapeutiques.

Ce qui suit décrit un protocole d’infection systémique révisé et standardisé pour les interactions S. mediterranea-C. albicans, conçu pour promouvoir la reproductibilité et permettre une investigation systématique de la pathogenèse fongique et des mécanismes de défense de l’hôte. Le protocole original a été suivi dans les publications^{précédentes 22, 23, 24}. Le tableau 1 résume les principales mises à jour intégrées dans cette version révisée, notamment des améliorations des procédures d’inoculation fongique, la réduction des volumes de puits, la définition des critères d’inclusion animale, la détermination des doses infectieuses et létales, ainsi que la mise à jour des recommandations en matière d’élevage. Ce flux de travail fournit des directives détaillées pour la culture de C. albicans, l’infection des planaires par exposition au trempage, et l’évaluation de la virulence fongique et des réponses de l’hôte à l’aide de données qualitatives et quantitatives dans des conditions symptomatiques et à dose létale (Figure 1). Les procédures optimisées présentées ici intègrent des variables identifiées empiriquement comme déterminants clés de la dynamique de l’infection et des résultats de l’hôte, améliorant ainsi la reproductibilité et permettant une évaluation systématique des interactions hôte-pathogène.

Protocole

Ce protocole s’appuie sur les méthodes^{précédentes 22, 23, 24} et établit des procédures claires et standardisées pour améliorer la reproductibilité et permettre une investigation systématique de la pathogenèse fongique et des réponses de l’hôte dans S. mediterranea. Les principaux ajustements du protocole incluent des critères d’inclusion et d’exclusion des animaux prédéfinis, une préparation microbienne standardisée et une évaluation complète des critères d’évaluation de l’hôte.

Toutes les procédures doivent être réalisées selon des techniques appropriées de biosécurité stériles et aseptiques de niveau 2. Les équipements de protection individuelle (EPI) standard de laboratoire, comprenant des gants, une blouse de laboratoire et des chaussures fermées, doivent être portés en permanence. Les procédures impliquant le planaire S. mediterranea ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour l’utilisation éthique des invertébrés.

Toutes les améliorations du protocole sont résumées dans le Tableau 1. Tous les réactifs, équipements critiques, ainsi que les recettes de milieux, tampons et immunocoloration sont listés dans le Tableau des Matériaux et le Tableau 2.
REMARQUE : Toutes les procédures impliquant le modèle animal invertébré S. mediterranea doivent être menées afin d’assurer les plus hauts standards de bien-être animal. S. mediterranea doit être logée dans des conditions optimisées simulant des habitats naturels. Les expériences doivent être conçues pour minimiser la douleur ou la détresse potentielle afin d’assurer un traitement éthique tout au long de l’étude.

1. Culture fongique

1. Informations sur la souche de C. albicans
   1. La souche standard de laboratoire de C. albicans SN250⁵¹ a été utilisée comme souche sauvage pour toutes les expériences, et est disponible au public au Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). SN250 est dérivé de l’isolat clinique SC5314, initialement prélevé à partir d’une hémoculture d’un patient atteint de candidose^{disséminée 52}.
   2. Les souches de C. albicans sont maintenues en stocks de glycérol à 25 % à −80°C.
2. Culture de souches de C. albicans pour une infection
   1. Stries provenant de la cryogénie
      1. À l’aide d’un applicateur stérile, tracez la souche désirée du stock à −80°C sur des plaques d’agar d’extrait de levure de peptone (YPD) (extrait de levure à 1 %, 2 % de peptone, 2 % de glucose ; pH 6,8).
      2. Incubez statiquement à 30°C pendant 72 heures.
3. Préparation des cultures nocturnes
   1. Inoculez une colonie unique dans un YPD liquide de 4 mL dans des tubes de culture borosilicatés stériles (18 mm × 150 mm) à l’aide d’un bâton applicateur stérile.
   2. Inclure un tube témoin négatif contenant un YPD non inoculé dans des conditions identiques.
   3. Bouchez légèrement les tubes pour permettre l’aération et incubez toute la nuit (16 h) à 30 °C avec un secouement à 220 tr/min (orbitale) dans un incubateur secouant.
      REMARQUE : Si une croissance microbienne se produit dans le témoin négatif, abandonnez l’expérience et recommencez avec un nouveau média et une technique stérile.
4. Récolte et lavage des cellules
   1. En utilisant une technique aseptique, transférez les cultures sur des tubes centrifugeuses marqués de 15 mL.
   2. Faites des cultures à la centrifugeuse pendant 5 minutes à ~3 000 × g pour pelleter les cellules.
   3. Retirez soigneusement le surnageant YPD sans déranger la pastille.
   4. Resuspendez le pellet dans de l’eau planaire (voir le tableau 2 pour la composition) dans un volume égal à celui du YPD utilisé.
   5. Mélangez soigneusement en vortex.
   6. Répétez les étapes 1.4.2-1.4.4 deux fois de plus pour éliminer complètement le milieu de croissance.
   7. Après le lavage final, remettez la pelote cellulaire en suspension dans de l’eau planaire fraîche en vortex.
5. Quantification de la concentration cellulaire de C. albicans
   1. Dilution pour la mesure de la OD
      1. Préparez trois tubes microcentrifuge stériles de 1,7 mL avec une dilution 1:20 (culture de 50 μL + 950 μL d’eau planaire) ou un facteur de dilution alternatif choisi. Mélangez soigneusement.
      2. Préparez un tube blanc contenant 1000 μL d’eau planaire.
   2. Spectrophotométrie
      1. Réglez le spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀).
      2. Blanchissez le spectrophotomètre avec de l’eau planaire.
      3. Mesurez_{le OD 600} pour chaque échantillon dilué et enregistrez les valeurs.
      4. Faites la moyenne des trois lectures et multipliez par le facteur de dilution pour déterminer le OD₆₀₀ de la culture du stock. Convertir OD₆₀₀ en concentration cellulaire.
         REMARQUE : Le facteur de conversion de densité optique doit être déterminé empiriquement pour chaque spectrophotomètre. D’après l’instrumentation spécifique utilisée, un OD₆₀₀ de 1 correspond à environ 2 ×10 cellules^{de C}. albicans/mL⁵³.
6. Détermination des concentrations expérimentales en inoculations
   1. Préparez la concentration d’inocule souhaitée pour chaque condition expérimentale.
      REMARQUE : Effectuez au moins trois réplications biologiques pour déterminer la dose effective pour la colonie planaire, en particulier pour les points infectieux ou mortels. Un calcul représentatif pour la préparation des concentrations d’inoculations infectieuses et létales est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1.

2. Espèces planaires et entretien

1. Espèces planaires et entretien
   1. Utilisez la lignée clonale asexuée CIW4 de la planaire S. mediterranea pour toutes les expériences.
   2. Maintenir les colonies planaires dans des contenants plastiques de qualité alimentaire contenant entre 1 500 et 2 000 mL d’eau planaire à 1 ×.
   3. Gardez les contenants dans l’obscurité à 20 °C, avec les couvercles fermés lâchement pour permettre l’échange de gaz.
   4. Ne traitez pas les planaires avec des antibiotiques.
2. Entretien et alimentation de la colonie
   1. Donnez des colonies à la purée de foie de bœuf fraîchement filtrée une fois par semaine.
   2. Nettoyez les contenants deux fois par semaine.
   3. Maintenir la densité des planaires à 200 à 400 animaux par contenant. Les travaux antérieurs démontrent des procédures détaillées de préparation et d’entretien à long terme^{des colonies 31}.
3. Conditionnement pré-expérimental
   1. Avant l’infection expérimentale, privez les planaires pendant 7 à 12 jours afin de standardiser les conditions métaboliques et de taille.
   2. Utilisez des groupes de 5 à 10 animaux par puits pour chaque condition expérimentale. Assurez-vous d’avoir un nombre égal d’animaux dans toutes les conditions, y compris les témoins positifs et négatifs.
4. Sélection de la taille de l’animal
   1. Sélectionner des planaires d’environ 5 mm de long, correspondant à ~5 × 10 5^{cellules hôtes} par^{animal 54}.
   2. Évitez d’utiliser des planaires de moins de 5 mm, car des animaux de cette taille peuvent inclure des individus avec des blastèmes ou un développement incomplet pouvant produire des résultats incohérents.
   3. Évitez d’utiliser des planaires de plus de 5 mm, car les animaux plus grands sont moins adaptés à l’immunocoloration par fluorescence.
   4. Utilisez des planaires d’environ 5 mm de longueur lors de l’établissement des conditions de dose infectieuse (DI₅₀) et de dose létale (LD₅₀).
      REMARQUE : Pour faciliter une sélection de taille cohérente, imprimez une grille de référence de 5 mm × 5 mm et placez-la dans une pochette de liaison en plastique sous le récipient planaire transparent. Assurez-vous que les planaires sont complètement étendus avant de mesurer la longueur.
5. Critères de santé et d’inclusion
   1. ÉTAPE CRITIQUE : Examinez toutes les planaires sous un stéréomicroscope avant utilisation.
   2. Excluez les animaux présentant des dommages ou blessures visibles, y compris les conditions suivantes :
      1. Présence de blastèmes (tissus dépourvus de pigmentation) ou développement incomplet de la pigmentation.
      2. Pigmentation anormale, comme des régions nettement plus foncées.
      3. Tissu manquant ou endommagé.
      4. Lésions ou cicatrices.
      5. Plaies ouvertes.
      6. Anomalies ou déformations morphologiques.
      7. Toute maladie chronique ou non cicatrisée.
   3. Excluez les animaux présentant des anomalies développementales.
      1. Régions de la tête ou de la queue bifurquées ou dupliquées.
      2. Morphologie corporelle difforme ou asymétrique.
      3. Nombre incorrect de photorécepteurs (une seule paire bilatérale est acceptable).
      4. Pharynx anormalement positionné.
      5. Ciliation défectueuse entraînant une altération de la motilité ou un comportement de glissement irrégulier.
   4. N’incluez que les animaux d’environ 5 mm de long, entièrement développés et exempts de blessures ou anomalies visibles.
6. Préparation des assiettes
   1. Transférer des planaires saines remplissant tous les critères d’inclusion dans 2 mL d’eau planaire fraîche par puits dans une plaque de polystyrène de 6 puits non traitée en culture tissulaire.
      REMARQUE : Transférer les animaux un jour avant l’infection afin de permettre l’adaptation au nouvel environnement et à la densité de population.
   2. Attribuez des puits aux conditions expérimentales suivantes :
      1. Témoins négatifs : animaux non infectés ou traités simulés.
      2. Témoins positifs : animaux infectés par le type sauvage C. albicans.
   3. Retirez et remplacez toute l’eau par 2 mL d’eau planaire douce pour garantir l’uniformité entre les puits.

3. Installation de l’infection

1. Préparer l’inoculation (voir le Fichier Supplémentaire 1 pour le calcul de l’échantillon)
   1. En utilisant la technique aseptique, retirez doucement toute l’eau de la plaque à 6 puits en inclinant la plaque vers l’utilisateur.
   2. Ajoutez le volume calculé d’eau planaire à chaque puits.
      REMARQUE : Procédez un puits à la fois pour éviter que les animaux ne sèchent.
   3. Ajoutez le volume calculé de la culture de C. albicans à chaque puits.
      REMARQUE : Évitez d’exposer les animaux à l’air pendant de longues périodes, car le séchage peut provoquer du stress et modifier les résultats de l’infection.
2. Conditions expérimentales d’incubation des plaques
   1. Placez la plaque inoculée à 6 puits dans un endroit sombre et statique à température ambiante.
   2. Maintenir les plaques expérimentales dans une zone séparée des colonies planaires non infectées afin d’éviter la contamination croisée.
   3. Notez la date et l’heure de l’inoculation (désignées comme 0 h).
      REMARQUE : Évitez les zones très fréquentées ou sujettes aux vibrations (par exemple, tiroirs, surfaces d’instruments ou plans de travail très fréquentés), car le mouvement peut stresser les animaux et dérouter les conséquences.
   4. Incubez les planaires avec C. albicans pendant jusqu’à 72 heures, selon l’objectif souhaité.
3. Resuspension des cellules fongiques
   1. À chaque point temporel, reposez doucement les cellules de C. albicans installées sans déranger les planaires.
      REMARQUE : Le temps (heures [h] ou jours [d] après l’infection) fait référence au temps écoulé depuis l’exposition initiale (temps 0).
   2. À 24 heures après l’infection (hpi)
      1. À l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3 mL, inclinez légèrement la plaque vers l’utilisateur.
      2. Aspirez l’eau planaire et versez-la doucement dans une zone du puits exempte d’animaux pour mélanger la couche fongique déposée.
      3. Répétez cette étape 5 à 10 fois par puits pour briser la couche fongique déposée, évitant ainsi le contact direct avec les planaires.
      4. Observez la colonisation fongique sur un fond sombre pour une meilleure visibilité avant et après les étapes de resuspension.
      5. Resuspendez les puits de contrôle non infectés dans des conditions identiques.
   3. À 48 hpi
      1. Répétez la procédure de resuspension décrite ci-dessus.
      2. Effectuer toutes les étapes de resuspension dans ± 1 heure à partir du moment désigné.
4. Fin d’exposition (72 hpi)
   1. À 72 ch, transférez doucement les planaires vers une nouvelle plaque à 6 puits contenant 2 mL d’eau planaire fraîche par puits.
   2. Minimisez le transfert de la culture fongique en utilisant le plus petit volume possible de liquide.
   3. Une fois les animaux transférés, retirez toute l’eau et remplacez-la par de l’eau planaire fraîche.
      REMARQUE : Manipulez les animaux et les fragments de tissu avec délicatesse pour éviter des blessures mécaniques ou des contraintes supplémentaires.

4. Évaluation du point final de l’hôte

1. Enregistrement des résultats de l’hôte
   1. Commencez à évaluer les résultats de l’hôte à un jour après l’infection (dpi) et continuez quotidiennement jusqu’à l’objectif expérimental souhaité.
   2. Quantifier les dommages causés à l’hôte en utilisant le système standardisé de notation 0–3 (Figure 2).
      Score 0 : Aucun changement par rapport aux témoins non infectés (en bonne santé, asymptomatique).
      Score 1 : symptôme(s) léger(s).
      Score 2 : symptôme(s) sévère(s).
      Score 3 : Mort.
2. Critères pour l’évaluation des symptômes de l’hôte
   1. Score 0 (Asymptomatique) :
      1. Identifier les animaux présentant une morphologie, une pigmentation, un comportement et une réactivité normaux sans changement observable par rapport aux témoins non infectés.
   2. Score 1 (Léger) :
      Attribuez un score léger lorsqu’au moins un des symptômes suivants est observé par rapport aux témoins asymptomatiques.
      1. Vitesse de déplacement réduite ou comportement de vol anormal en plané.
      2. Perte partielle ou totale de la réponse phototaxique.
      3. Contractions corporelles prolongées ou répétitives.
      4. Pigmentation anormale ou non uniforme (régions plus claires ou plus foncées).
      5. Régression du tissu de la tête ou de la queue.
   3. Score 2 (Sévère) :
      Attribuer un score sévère lorsqu’un ou plusieurs des symptômes suivants sont présents pendant que les animaux sont en vie.
      1. Pellicule oculaire ou perte d’un ou des deux yeux.
      2. Perte totale de tête ou lésions notables des tissus antérieurs.
      3. Perte tissulaire majeure dans la région pré-pharyngée.
      4. Fragmentation en plusieurs régions du corps (céphalique, pharyngée ou segments postérieurs).
      5. Plaies ouvertes avec ou sans sécrétion de mucus ou fuite interne.
      6. Lyse tissulaire partielle entraînant une perte d’intégrité structurelle.
      7. posture corporelle en « C », paralysie ou altération sévère de la motilité.
   4. Score 3 (Mort) :
      Identifier le décès en se basant sur un ou plusieurs des critères suivants.
      1. Lyse complète des tissus ou de l’animal entier.
      2. Perte totale de réponse aux stimuli.
      3. Échec à la récupération ou à la régénération.
         REMARQUE : La figure 2 fournit des images représentatives et des caractéristiques définissantes pour chaque score afin d’assurer une classification cohérente des phénotypes de l’hôte.

5. Détermination de la survie de l’hôte après exposition fongique

1. À 3 dpi, transférez doucement les planaires vers une nouvelle plaque à 6 puits contenant 2 mL d’eau planaire fraîche par puits, évitant ainsi le transfert de culture fongique résiduelle.
2. Observez les animaux à l’aide de la microscopie optique (≥ objectif 10x).
3. Consignez les résultats de l’hôte à l’aide de la feuille de notation standardisée fournie dans le Fichier Supplémentaire 2.
4. Détermination des animaux vivants
   1. Identifier les animaux vivants en se basant sur un ou plusieurs des critères suivants.
      1. Phototaxie négative.
      2. Réponse à une perturbation douce de la pipette de transfert.
      3. Structure corporelle intacte.
      4. Fixation stable à la plaque.
5. Détermination des animaux morts
   1. Identifier les animaux morts en se basant sur un ou plusieurs des critères suivants.
      1. Lyse complète ou désintégration (débris résiduels uniquement).
      2. Corps transparent ou éventré.
      3. Absence de mouvement ou de réponse aux stimuli.
      4. Échec de régénération (absence de formation de blastema).
6. Retrait des animaux morts
   1. Retirez les animaux morts et les débris seulement après avoir confirmé leur non-viabilité à la microscopie.
   2. ÉTAPE CRITIQUE : Retirez immédiatement les animaux morts pour éviter la contamination croisée ou la modification des mesures de survie.
   3. Si des débris ou des résidus fongiques subsistent, transférez à nouveau les animaux survivants sur une plaque fraîche contenant de l’eau planaire propre afin d’empêcher la réensemencement de C. albicans ou la formation de biofilm.
      REMARQUE : Placez des plaques à 6 puits sur un fond sombre lors de l’inspection visuelle afin d’améliorer le contraste et de faciliter l’évaluation du phénotype.

6. Évaluation de la charge fongique

1. Quantification des unités formatrices de colonies (UFC)
   1. Aux moments d’infection souhaités, prélever les planaires (5 à 10 animaux par condition par jour). Incluez des contrôles non infectés/simulés appariés et des contrôles infectés de type sauvage.
   2. Rincez doucement les puits deux fois avec 2 mL d’eau planaire fraîche pour éliminer les cellules de fond de C. albicans .
   3. Transférez les planaires dans des tubes microcentrifuges stériles et marqués de 1,7 mL ou 5,0 mL et retirez toute eau résiduelle.
   4. Ajoutez 300 μL d’eau planaire fraîche à chaque tube.
   5. Homogénéisez les animaux à l’aide d’un pilon stérile jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros fragments (environ 30 à 45 s).
   6. Effectuer des dilutions en série de l’homogénéate (par exemple, 1:10, 1:100, 1:1000).
   7. Plaque de 100 à 200 μL de chaque dilution sur des plaques d’agar YPD complétées par 50 μg/mL chacune d’ampicilline, rifampicine, streptomycine et néomycine. Étalez uniformément à l’aide de billes de verre stériles ou d’un écarteur de cellules stériles.
   8. Laissez les assiettes debout sur le plan de travail pendant 5 à 10 minutes après le dressage pour permettre l’absorption du liquide dans l’agar.
   9. Préparez des plaques triple pour chaque dilution et condition.
   10. Incubez les plaques à 30 °C pendant 48 heures.
   11. Comptez les UFC et multipliez par le facteur de dilution.
   12. Normaliser les valeurs d’UFC au nombre de planaires pour calculer la moyenne des UFC par planaire et par condition. Par exemple, si 100 colonies sont observées à une dilution de 10× à partir d’un homogénéat de 5 animaux, la valeur calculée est de 200 UFC par animal.

7. Coloration immunofluorescence anti-Candida

1. Considérations générales sur la coloration
   1. Effectuez toutes les étapes avec un léger balancement orbital (100–140 tr/min) à température ambiante, sauf indication contraire. Voir le Fichier Supplémentaire 1 pour les détails sur les anticorps et les sources des réactifs.
      ATTENTION : Le formaldéhyde, le dodécyle sulfate de sodium (SDS) et le peroxyde d’hydrogène sont des substances chimiques dangereuses et doivent être manipulées conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité. Le formaldéhyde est toxique et classé comme cancérogène ; La SDS est un irritant ; Et le peroxyde d’hydrogène est un puissant oxydant qui peut provoquer des brûlures. Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants en nitrile, chaussures fermées et lunettes de sécurité). Effectuer des procédures impliquant des réactifs volatils dans une hotte chimique certifiée et éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles de santé et sécurité environnementale.
2. Collecte d’échantillons
   1. Collectez des animaux de chaque condition expérimentale et de chaque moment temporel.
   2. Transférer les animaux dans des fioles de scintillation marquées de 20 mL contenant 2 mL d’eau planaire.
   3. Retirez tout le liquide, rincez une fois avec 2 mL d’eau planaire fraîche, puis tout liquide une fois de plus.
3. Fixation et perméabilisation
   1. Sacrifiez les animaux dans 7,5 % de N-acétylcystéine (NAC) en 1× PBS pendant 3 minutes.
   2. Retirez la solution et fixez les animaux dans du formaldéhyde à 4 % de PBSTx à 0,3 % pendant 15 minutes.
   3. Rincez les échantillons deux fois avec 1× de PBS.
   4. Perméabiliser les échantillons dans une FDS à 1 % pendant 15 minutes.
   5. Rincez les échantillons trois fois avec 1× PBS.
4. Blanchiment
   1. Échantillonner de l’eau de Javel à 6 % de peroxyde d’hydrogène dans 1× PBS sous une lumière LED vive pendant 4 à 12 heures.
      REMARQUE : Si le blanchiment ne peut pas commencer immédiatement, conservez des échantillons fixes dans 1× PBS à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine ou déshydratez les échantillons dans du méthanol à 100 % pour un stockage à long terme.
5. Blocage et incubation des anticorps
   1. Transférer les animaux sur des plaques à 24 puits contenant 1× PBS.
   2. Bloquez la liaison non spécifique à 2,5 % de PBS-TB (PBS contenant Triton X-100 et albumine sérique bovine) pendant 4 heures à température ambiante ou 8 heures à 4 °C.
   3. Incuber des échantillons avec un anticorps anti-Candida primaire (1:500 dans PBS-TB) pendant 4 h à température ambiante ou 8 h à 4 °C.
   4. Retirez les anticorps primaires et lavez les échantillons huit fois toutes les 20 minutes avec 0,3 % de PBSTx (total ~2,5 h).
   5. Incuber des échantillons avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à Alexa-568 (1:800 dans PBS-TB) pendant 4 heures à température ambiante ou 8 heures à 4 °C.
      REMARQUE : Protégez les échantillons de la lumière pour éviter le photoblanchiment. Les solutions d’anticorps peuvent être réutilisées.
   6. Retirez les échantillons d’anticorps secondaires et lavez huit fois toutes les 20 minutes avec du PBSTx à 0,3 %.
6. Montage optionnel sur la glissière
   1. Placez les animaux sur une lame de microscope avec tous les animaux orientés vers le haut.
   2. Retirez l’excès d’eau à l’aide d’une pipette de transfert.
   3. Absorbez soigneusement le reste du liquide sur les bords à l’aide d’un essuie-tout.
   4. Ajoutez 150 à 175 μL de substrat de montage Gelvatol (Tableau 2 pour la composition) goutte dans la goutte jusqu’à ce que les animaux soient complètement couverts.
   5. Placez soigneusement une housse sur l’échantillon, évitant les bulles d’air.
   6. Laissez le Gelvatol solidifier pendant au moins 2 heures avant l’imagerie.
   7. Conservez les toboggans dans un endroit frais et sombre pour une conservation à long terme.
7. Imagerie
   1. Imagez les échantillons en utilisant l’excitation jaune-vert (~578 nm) et observez l’émission orange-rouge (~603 nm).
   2. Utilisez une lentille objectif 2x pour visualiser les motifs de coloration des animaux entiers.

8. Dépannage

1. Si les résultats de l’infection sont incohérents, effectuer une courbe dose-titration en utilisant le type sauvage SN250 ou une autre souche de référence par incréments de 5 à 10 ×^{10 7} cellules/mL.
2. Effectuer au moins trois réplications biologiques contenant 5 à 10 animaux par groupe.
3. Inclure des groupes témoins négatifs et positifs pour identifier les problèmes potentiels tels que la contamination croisée, l’échec de la technique aseptique, les problèmes de viabilité des souches ou une mauvaise santé animale de base.
4. Après avoir terminé l’expérience de titrage dose, le pool se réplique pour déterminer la survie médiane par groupe.
5. Analyser les différences de survie à l’aide de l’analyse par paires logarithmique de Mantel–Cox.
6. Utilisez l’analyse de survie de Kaplan–Meier pour évaluer les différences de temps avant la mort entre souches ou traitements.
7. Pour les conditions de dose sublétale ou infectieuses, il faut analyser les résultats symptomatiques de l’hôte (par exemple, phénotypes légers ou sévères ou colonisation fongique) plutôt que la survie.
8. Comparez les réponses de l’hôte entre groupes de dose afin de déterminer la plage de doses infectieuses ou létales appropriées pour les expériences ultérieures.

Résultats

Un protocole mis à jour pour infecter les planaires avec C. albicans (Figure 1) et quantifier systématiquement les résultats de l’hôte (Figure 2) est présenté. Ce flux de travail affiné permet une évaluation robuste de multiples paramètres d’infection, notamment la morbidité (gravité symptomatique de la maladie), la survie (létalité), la charge fongique (UFC) et la dynamique spatiale-temporelle de la colonisation des ag...

Discussion

La variation de la dose infectieuse de C. albicans de type sauvage produit des différences reproductibles et dépendantes de la dose dans la morbidité chez S. mediterranea, soulignant la sensibilité du modèle à l’évaluation quantitative de la virulence fongique. Ce protocole décrit des stratégies pour établir des doses infectieuses et létales de base dans les colonies planaires maintenues en laboratoire et présente des critères pour confirmer une infection systémique réu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifuge de 1,7 mL   ;	VWR/Genemate	490004-436-BOXOF500	Clear, boîte de 500 pièces
Fioles de scintillon de 20 mL	Fisher Scientific	12-100-006	Flacons en verre transparent pour l’immunocoloration
Plaques de polystyrène non traitées à 24 puits	Fisher Scientific	08-772-51	Immunocoloration
Tubes microcentrifuges de 5,0 mL   ;	Eppendorf/Sigma Aldrich	EP0030119487-200EA	Clear, boîte de 200 pièces
Plaques de polystyrène non traitées à 6 puits	Fisher Scientific	08-772-49	Tests d’infection
Agar	VWR	89405-066	Grade bactériologique pour le milieu YPD
Sticks applicateurs	Thermo Fisher/Puritain	22-029-491	C. albicans culture
BioRender	BioRender Inc.	N/A	Logiciel de conception de figures utilisé pour générer des illustrations schématiques
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Eau planaire/1x Montjuï ; C Salts
Candida albicans anticorps polyclonaux anti-Rabbit, IgG	Thermo Fisher	PA1-27158	Immunocoloration
Tubes centrifugeuses	VWR	89039-664	< en > C. albicans récolte
Tubes de culture en verre borosilicate 18x150mm	VWR	47729-583	C. albicans culture
Cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127	Pour mesurer la densité optique des cultures
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D16-3	Moyen YPD
Glycérol	Fisher Scientific	G33-4	Qualité en biologie moléculaire pour compléter le stockage cryogénique de C. albicans  ;
Outil de graphisme et de visualisation de données	GraphPad/Prism		Logiciel statistique et outil de visualisation. Version 10.6.1.
Outil de graphisme	R		Logiciel statistique. Version 4.4.3.
Shaker incubateur	Eppendorf	EPM1282-0004-1EA	New Brunswick Innova 44/44R pour C. albicans culture
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Sigma	M8266-100G	Pour l’eau planaire & nbsp ; (1x Montjuï ; C salts)
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506-500G	Pour l’eau planaire & nbsp ; (1x Montjuï ; C salts)
Lames de microscope	VWR	16004-368
Microscope multizoom	Nikon		Nikon AZ100  ;
N-acétyl-L-cystéine	Sigma Aldrich	A7250-50G	Réactif mucolytique et sacrificiel  ; Fixation
Paramaldéhyde, solution à 16 %, grade de biologie moléculaire	Sciences de la microscopie électronique	15710	Réactif fixateur
Moteur sans fil de pilon à pellets	Fisher Scientific	12-141-361	Homogénéisation planaire
Peptone, grade bactériologique	HIMEDIA/VWR	89129-480	Moyen YPD
Pilons	Fisher Scientific	12-141-368	Granule jetable sans RNase pour l’homogénéisation planaire
Plaques de Petri, 100 x 15 mm	VWR	25384-342
Poly (alcool vinylique)	Sigma-Aldrich	P-8136  ;	Pour le Gelvatol
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma Life Science	P9541-500G	Milieu planaire/eau  ; (1x Montjuï ; C salts)
Anticorps secondaire anti-lapin, IgG, Alexa Fluor 568	Fisher Scientific	A-11011	Immunocoloration
SN250	Centre de Stocks de Génétique Fongique		Espèce sauvage C. albicans souche (https://www.fgsc.net/)
Azidée de sodium	Fisher Scientific	S227-100	Pour le Gelvatol
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG	Milieu planaire/eau  ; (1x Montjuï ; C salts)
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma Life Science	S3014-500G	Milieu planaire/eau  ; (1x Montjuï ; C salts)
Spectrophotomètre	Agilent	26354	Microplaque BioTek Epoch 2 pour mesurer la densité optique
Incubateur statique	Fisher Scientific	15-015-2634	C. albicans culture
Pipettes de transfert	Fisher Scientific	13-711-9CM	Pipettes graduées jetables et stériles pour transférer des planaires
Tris Base	Sigma-Aldrich	252859	Pour le Gelvatol
Extrait de levure	Thermo Fisher	212750	Moyen YPD