Validation de l’intégration et de l’expression aléatoires des transgènes chez les parasites d’Eimeria

Summary

Nous présentons ici une méthode standardisée pour valider l’intégration et l’expression de gènes étrangers chez les parasites transgéniques d’Eimeria . En intégrant des analyses génomiques et protéiques, ce flux de travail confirme l’insertion et l’expression stables des gènes. Cette approche facilite le développement d’Eimeria transgénique pour la recherche et les applications vaccinales.

Abstract

La validation des parasites transgéniques Eimeria est essentielle pour confirmer une intégration génomique stable et l’expression des gènes exogènes. Ce protocole décrit un flux de travail complet pour vérifier l’insertion des transgènes et l’expression des protéines chez Eimeria tenella. La procédure commence par une extraction d’ADN génomique à partir d’oocystes sporulés, suivie d’une amplification par PCR pour vérifier de manière préliminaire la présence du fragment cible. Pour confirmer davantage l’intégration génomique, un reséquençage du génome entier est réalisé afin d’identifier les sites d’insertion et d’évaluer la stabilité de la structure intégrée dans le génome du parasite. L’expression des protéines est ensuite examinée par le Western blotting de lysats préparés à partir de sporozoïtes purifiés, permettant la détection de la protéine recombinante cible. De plus, la localisation intracellulaire est visualisée par un test d’immunofluorescence indirecte (IFA) utilisant des cellules hôtes infectées. Ensemble, ces tests fournissent un cadre robuste et reproductible pour valider les lignées transgéniques d’Eimeria . Ce flux de travail permet une confirmation fiable de l’intégration génomique et de l’expression des protéines, soutenant ainsi les applications en aval dans la manipulation génétique, la génomique fonctionnelle et le développement de vaccins ciblant les parasites d’Eimeria .

Introduction

La coccidiose, causée par les espèces d’Eimeria, représente l’une des maladies parasitaires les plus significatives économiquement chez la volaille, entraînant une réduction de la prise de poids, une mauvaise conversion des aliments et des pertes financières mondiales estimées à des milliards de dollars chaque^{année 1, 2, 3}. La manipulation génétique des parasites Eimeria est devenue un outil puissant tant pour la recherche fondamentale que pour le développement de^{vaccins 4,5,6}. La transfection stable permet l’intégration et l’expression de gènes exogènes, tels que les rapporteurs fluorescents ou les antigènes protecteurs, permettant la visualisation en temps réel du développement parasitaire et l’évaluation ciblée des candidats^{vaccins 7,8,9}.

Une publication précédente de Duan et al. a fourni un protocole standardisé pour la nucléofection et la propagation in vivo de l’Eimeria transgénique, établissant une méthode efficace pour générer et enrichir les lignées parasites^{recombinantes 10}. Cependant, il n’existe actuellement aucun flux de travail unifié pour confirmer l’intégration génomique stable et l’expression fonctionnelle des transgènes. Une telle validation est essentielle pour garantir l’authenticité, la stabilité et la reproductibilité des lignées transgéniques utilisées pour les études biologiques en aval ou les applications vaccinales.

Cet article présente un protocole complet, étape par étape, pour valider l’intégration et l’expression des transgènes chez Eimeria tenella, en utilisant une lignée transgénique d’E. tenella exprimant l’antigène VP2 (Et-VP2) du virus de la maladie boursale infectieuse (IBDV) sous forme de^{modèle 11}. Le plasmide d’expression p5′AMic2linkerVP2m3′A, portant le gène VP2 et un reporter mCherry, a été transfecté dans des sporozoïtes sauvages d’E. tenella (Et-WT). Les oocystes fluorescents rouges ont été isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et transmis en série chez des poulets sans coccidie. Ce flux de travail démontre des procédures pour l’extraction d’ADN génomique, l’analyse préliminaire d’intégration basée sur PCR, le reséquençage du génome entier pour identifier les sites d’insertion, le Western blotting pour vérifier l’expression des protéines, et le test d’immunofluorescence indirecte (IFA) pour visualiser la localisation intracellulaire de la protéine recombinante. Ensemble, ces méthodes fournissent un cadre reproductible et complet pour confirmer l’authenticité des lignées transgéniques d’Eimeria , permettant leur utilisation fiable dans la recherche en génomique fonctionnelle et le développement de vaccins.

Protocol

Toutes les expériences animales impliquant des poulets ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Chine (numéro d’approbation : CAU20160628-2). Toutes les procédures d’élevage et expérimentales ont été menées conformément aux directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Chine et conformes aux Principes directeurs internationaux pour la recherche biomédicale impliquant les animaux. Des poulets White Leghorn mâles spécifiques de sept jours sans agents pathogènes spécifiques (SPF) ont été utilisés dans cette étude. Les oiseaux ont été maintenus dans des conditions d’élevage standard, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau tout au long de la période expérimentale. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Extraction d’ADN génomique à partir d’oocystes sporulés d’Eimeria spp.

1. Transférez 1 mL d’une suspension d’oocystes (≥1 × 10⁷/mL) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez un volume égal de billes en verre de 1 mm correspondant à la pellete d’oocyste. Perturbez les oocystes à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire en battant vigoureusement la bille à 60 Hz pendant 5 minutes jusqu’à ce que les parois de l’oocyste soient complètement brisées et que le contenu soit libéré.
2. Collectez le mélange (hors billes de verre) dans un nouveau tube et centrifugez à 12 000 x g pendant 1 minute. Écartez le surnageant, ajoutez 500 μL de tampon CTAB et 40 μL de protéinase K, puis incubez le mélange à 60 °C pendant 30 minutes.
3. Ajoutez 500 μL de phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1), un vortex pendant 10 s, puis centrifugez à 12 000 x g pendant 5 minutes. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
   REMARQUE : Boucher et jeter fermement le tube contenant la couche organique pour éviter la contamination de l’environnement. (Optionnel) Si la contamination protéique reste élevée, répétez l’étape 1,3 1 à 2 fois supplémentaires.
4. Ajoutez 500 μL de chloroforme : alcool isoamylique (24:1), un vortex pendant 10 s, puis centrifugez à 12 000 x g pendant 5 minutes. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajoutez un volume égal d’isopropanol. Mélangez par inversion jusqu’à ce que des précipitations d’ADN apparaissent.
   REMARQUE : Des précipitations à −20 °C pendant ≥1 h ou pendant la nuit augmentent le rendement.
5. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 minutes pour pelleter l’ADN. Lavez la pellete avec 70 % d’éthanol, centrifugez à 12 000 x g pendant 5 minutes, puis jetez le surnageant. Retirez soigneusement le liquide résiduel à l’aide d’une pompe à vide et faites sécher le granule à l’air à température ambiante ou à 37 °C.
6. Dissoudre la granule d’ADN séchée dans un tampon contenant de la RNase_{ddH 2}O ou TE. Incubez à 37 °C pendant ≥1 heure ou à 4 °C pendant la nuit pour retirer l’ARN résiduel. Conservez l’ADN purifié à −20 °C.
   REMARQUE : Pour une conservation à long terme, les granulés d’ADN non dissous peuvent être stockés directement à −20 °C ou −80 °C. Évaluer l’intégrité et la concentration de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose avant les applications en amont.

2. Vérification par PCR de la présence du construct Et-VP2 dans le génome du parasite

1. Des paires d’amorces de conception (Tableau 1) pour vérifier l’intégration génomique du construct Et-VP2.
   REMARQUE : Les séquences d’amorces ont été conçues avec Primer-BLAST, avec des paramètres typiques de 18 à 24 pb de longueur d’amorce, une température de fusion d’environ 55 à 60 °C, et une formation minimale de la structure secondaire. La spécificité de chaque paire d’amorces a été ensuite vérifiée par rapport au génome d’Eimeria tenella afin d’éviter une amplification non spécifique.
2. Préparez un mélange réactionnel de 50 μL contenant 25 μL de 2× Taq Master Mix, 21 μL de ddH₂O, 1 μL de amorces avant et arrière, et 2 μL de gabarit d’ADN.
3. Effectuer l’amplification en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 minutes ; 30 cycles à 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 minute ; suivie d’une prolongation finale à 72 °C pendant 10 minutes.
   REMARQUE : Assurez-vous que tous les réactifs sont bien mélangés avant le cycle thermique. Utilisez des modèles d’ADN fraîchement préparés pour obtenir une efficacité d’amplification optimale.

3. Reséquençage de la lignée parasite transgénique (Et-VP2)

1. Soumission d’exemples et construction de bibliothèque
   1. Soumettez une suspension d’oocyste de 1 mL (≥1 × 10⁷/mL) à un prestataire commercial de services de séquençage pour une analyse de reséquençage de nouvelle génération.
   2. Après évaluation de la qualité de l’ADN génomique, fragmentez l’ADN par perturbation mécanique à l’aide d’échographies. Purifiez l’ADN fragmenté, effectuez la réparation des extrémités, ajoutez une base d’adénine (A) aux extrémités 3′, et liguez les adaptateurs de séquençage.
   3. Sélectionnez les fragments d’ADN de la taille souhaitée en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose et effectuez une amplification PCR pour construire la bibliothèque de séquençage.
   4. Soumettez la bibliothèque construite à un contrôle qualité. Effectuer un séquençage par extrémités jumelées sur la plateforme Illumina NovaSeq en utilisant une longueur de lecture de 150 pb. Maintenir une profondeur de séquençage de 100× pour garantir la précision des données, générant au moins 6 Go de données brutes avec un score de qualité minimum de Q20 >90 %.
      REMARQUE : Manipuler tous les réactifs et échantillons d’ADN en utilisant des techniques aseptiques pour prévenir la contamination. Vérifiez que les paramètres de séquençage respectent les métriques de profondeur et de qualité requises avant de procéder à l’analyse des données.
2. Analyse des données
   1. Filtrez les données brutes de séquençage à l’aide du logiciel Fastp (v0.23.2) selon les critères^{suivants 12} :
      1. Retirez les séquences d’adaptateurs.
      2. Fixez le seuil de basse qualité à Q20 et supprimez les lectures dans lesquelles les bases de faible qualité représentent plus de 30 % de la longueur totale de lecture.
      3. Supprimez les lectures plus courtes que 50 pb.
   2. Aligner les lectures contrôlées de qualité au génome de référence d’E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) à l’aide du logiciel Bowtie2 (v2.4.5)¹³. L’aléatoire des données de séquençage de nouvelle génération est évaluée en fonction de la profondeur de couverture et de l’uniformité.
   3. Assurez-vous que les lectures de séquençage sont alignées sur la séquence vectorielle transgénique. Retirez les lectures qui ne cartographient pas la région de l’ADN-T pour obtenir des lectures chimériques, où une extrémité correspond à l’ADN-T et l’autre au génome de référence E. tenella .
   4. Sur la base des séquences des lectures chimériques, effectuez un alignement avec ToxoDB (version 64) pour déterminer l’emplacement précis des sites potentiels d’insertion de T-ADN. Analysez la profondeur de séquençage à travers les régions homologues entre le vecteur et le génome d’Eimeria (c’est-à-dire les régions régulatrices 5′ et 3′) à l’aide du logiciel Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Identifier les sites potentiels d’intégration du plasmide transgénique dans le génome d’E. tenella et les vérifier par PCR à l’aide du système de réaction décrit à l’étape 2.1.
      REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser de manière cohérente les versions du logiciel et les paramètres tout au long de l’analyse afin de maintenir la précision et la reproductibilité des données.

4. Butade Western des protéines transgéniques d’Eimeria

1. Collectez une suspension PBS contenant au moins 5 × 10⁶ sporozoïtes dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL et centrifugez à 2500 x g pendant 5 minutes. Reposez le pellet dans un tampon de lyse RIPA de 100 μL et incubez sur la glace pendant 1 heure. Ajoutez 20 μL de tampon de 6× protéines et chauffez le mélange à 100 °C pendant 10 minutes.
2. Préparez les gels SDS-PAGE à l’aide d’une plaque en verre de 1,5 mm. Ajustez la concentration d’acrylamide en fonction du poids moléculaire de la protéine cible. Lors de la polymérisation, superposez le gel séparateur d’eau distillée pour garantir une surface uniforme avant d’ajouter le gel d’empilement.
3. Centrifugez le lysat à 10 000 x g pendant 5 minutes et chargez 40 μL de surnageant dans chaque voie d’échantillonnage. Chargez 10 μL de marqueur de protéine dans une voie séparée, et remplissez les voies restantes avec 40 μL de tampon de chargement à 1× en tant que témoins.
4. Effectuer l’électrophorèse en tampon de 1× courant à 70 V pendant 20 minutes, suivi de 120 V pendant 60 à 90 minutes, jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel.
5. Retirez le gel selon la taille attendue de protéines. Préactivez une membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 minute et assemblez le sandwich de transfert dans l’ordre suivant : éponge, papier filtre, gel (côté cathode), membrane PVDF, papier filtrant, éponge. Retirez toute bulle d’air et transférez les protéines à 70 V pendant 3 h dans un tampon de transfert.
6. Lavez la membrane trois fois avec du PBST (5 min chacun) et bloquez avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Lavez la membrane deux fois avec du PBST pour éliminer la solution résiduelle de blocage.
7. Incuber la membrane avec des anticorps primaires dilués dans un tampon d’anticorps : anti-Flag polyclonal de souris (1:2000) et anti-GAPDH monoclonal de souris (1:2000). Couver pendant 1 heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C avec des secousses douces. Prélever la solution d’anticorps et laver la membrane cinq fois avec du PBST (5 min chacun).
8. Incubez la membrane avec de l’IgG anti-souris conjugué à HRP (1:2000) pendant 1 h à température ambiante. Lavez la membrane cinq fois avec du PBST (5 min chacun).
9. Préparez un substrat ECL en mélangeant des volumes égaux de solution A et B. Appliquez le substrat uniformément sur la membrane et détectez les signaux protéiques à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescente.
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes impliquant des échantillons de protéines sur glace, sauf indication contraire. Manipulez les substrats de méthanol et ECL dans une hotte à fumée tout en portant des gants et des lunettes de protection.

5. Essai d’immunofluorescence indirecte intracellulaire (IFA) de l’Eimeria transgénique

1. Purification des sporozoïtes à l’aide d’une colonne chromatographie
   1. Reliez la colonne de chromatographie à une pompe péristaltique et ajustez le débit à 50–60 Hz. Lavez la colonne avec de l’eau distillée et une solution de glycine.
   2. Ajoutez la suspension en cellulose DE-52 à la colonne tout en ajoutant continuellement une solution de glycine jusqu’à ce que le lit de cellulose atteigne environ 1 cm de hauteur.
   3. Chargez les sporozoïtes purifiés par la méthode Percoll sur la colonne. Maintenez un débit de 30 à 40 Hz à l’aide d’une solution de glycine et collectez le flux dans un tube centrifugeuse de 50 mL.
   4. Surveillez l’éluat en déposant des gouttes sur une lame en verre pour une observation microscopique. Lorsque pas de sporozoïtes n’est détecté, arrêtez la pompe. Centrifugez la fraction collectée à 2 500 x g pendant 5 minutes, jetez le surnageant, puis resuspendez la pellete dans PBS.
      REMARQUE : Effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles afin d’éviter la contamination microbienne. Éliminer la glycine et les déchets de Percoll conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.
2. Infection sporozoïte des cellules HFF
   1. Semez 1 × 10⁶ sporozoïtes dans des plaques à 24 puits contenant des monocouches de cellules HFF. Ajouter de la pénicilline-streptomycine à une concentration finale de 1× (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine), mélanger doucement, puis incuber à 37 °C pendant 4 à 6 heures pour permettre l’invasion. Retirez le médium, lavez une fois avec 1 mL de PBS, puis jetez le surnageant.
   2. Retirez soigneusement les bâtons de verre des puits à l’aide de pinces stériles et transférez-les sur une nouvelle plaque à 24 puits. Fixez les échantillons dans 1 mL de paraformel à 4 % pendant 30 minutes, lavez une fois avec 1 mL de PBS, puis jetez le surnageant.
   3. Perméabiliser les cellules avec 1 mL de 0,25 % de Triton X-100 pendant 30 minutes. Lavez une fois avec 1 mL de PBS et jetez le surnageant.
   4. Bloquez les échantillons avec 1 mL de BSA à 3 % pendant 30 minutes. Lavez une fois avec 1 mL de PBS et jetez le surnageant.
   5. Diluer l’anticorps anti-Flag monoclonal de souris (1:200) dans 3 % de BSA. Placez des gouttes d’anticorps dilué sur un film de scellement et inversez les couches de couverture (côté cellule vers le bas) sur les gouttes. Incubez les couvercles dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 1 heure. Laver trois fois avec 1 mL de PBS (5 min chacun).
   6. Diluer l’IgG anti-souris conjugué FITC (1:200) et Hoechst 33258 (1:100) dans 3 % de BSA. Placez des gouttes de mélange colorant sur un film de scellement et inversez les gaines de couverture sur les gouttes. Incubez dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 1 heure, puis lavez cinq fois avec 1 mL de PBS (5 min chacun).
   7. Montez les gaines de couverture en plaçant un support antidécolorant de 5 μL sur une lame en verre. Inversez la housse (côté cellule vers le bas) sur la chute, évitant les bulles d’air, et scellez les bords. Conservez les lames montées dans une chambre humidifiée à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
      REMARQUE : Manipulez le paraformoldéhyde et le Triton X-100 dans une hotte chimique tout en portant des gants et une protection oculaire. Les formulations de réactifs utilisées dans cette procédure sont listées dans le tableau 2.

Results

L’analyse par PCR génomique a confirmé la présence du fragment cible chez les parasites transgéniques, tandis qu’aucune bande correspondante n’a été détectée chez le groupe de contrôle sauvage (Figure 1A). Le reséquençage du génome complet a également démontré que le plasmide linéarisé était stable intégré dans le génome du parasite, et que le site d’intégration prédit a été validé par amplification PCR à travers la région de jonction (F...

Discussion

Ce protocole établit un flux de travail complet pour valider l’intégration génomique, l’expression des protéines et la localisation intracellulaire des gènes exogènes dans le transgénique E. tenella. Plutôt que de s’appuyer sur un seul test, l’approche combine des preuves génomiques et protéiques, garantissant que l’insertion des transgènes est à la fois confirmée structurellement et exprimée fonctionnellement.

Plusieurs étapes critiques de ce protoco...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milieu de montage antifade	MCE	HYK1042	Milieu de montage fluorescent pour prévenir le photoblanchiment
BSA (3 %)	Beyotime	ST023	Tampon de blocage et tampon de dilution d’anticorps pour IFA ; Bloquez à température ambiante pendant 30 minutes
Chloroforme : alcool isoamylique (24:1)	Sigma	C0549	Réactif pour éliminer le phénol résiduel lors de l’extraction d’ADN génomique
Poulets sans coccidie	Boehringer-Ingelheim	SPF	Utilisé pour le passage in vivo et l’amplification de souches transgéniques ; approuvé par le Comité d’éthique (numéro d’approbation : CAU20160628-2)
CTAB (bromure de cétyltriméthammonium)	Merck KGaA	H5882	Composant du tampon d’extraction d’ADN génomique ; formulation : 3 g de CTAB + 12,27 g de NaCl + 15 mL 1 mol/L de Tris-HCl + 6 mL 0,5 mol/L d’EDTA, ajusté à un volume final de 150 mL avec ddH2O
DE-52 Cellulose	Solarbio	C8350	Milieu de chromatographie par échange d’ions pour la purification des sporozoïtes ; traité séquentiellement avec du NaOH, du HCl et de l’eau distillée, puis équilibré avec une solution de glycine
Substrat ECL (Solution A + Solution B)	thermofisher	32106	Réactif de détection chimiluminescent ; mélanger des volumes égaux de la solution A et B avant utilisation
FITC - IgG anti-souris conjugué pour la chèvre	Sigma	AP124F	Anticorps secondaire fluorescent pour l’IFA, rapport de dilution 1:200
Perles de verre	Sigma	Z250473-1PAK
Glycine Solution	Sigma	67419	Tampon d’équilibrage et d’élution pour les colonnes chromatographiques ; formulation : 0,75 g de glycine + 7,9 g de NaCl dissous dans 500 mL d’eau distillée, pH ajusté à 7,4-7,6, autoclavé
Hoechst 33258	Sigma	94403	Réactif de coloration nucléaire, rapport de dilution 1:100 ; Utilisé pour la localisation IFA
IgG anti-souris conjugué HRP	Sigma	12-349	Anticorps secondaire contre le Western blotting, rapport de dilution 1:2000
Plateforme de séquençage Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine)		Plateforme de séquençage de nouvelle génération ; séquençage par extrémités appariées (longueur de lecture de 150 pb), profondeur de séquençage 100 fois, génération &ge ; 6 Go de données brutes (T20>90 %)
Centrifugeuse à basse vitesse	CENTRIFUGEUSE BEILI DE L’ÈRE DE PÉKIN	DT5-2
Anticorps anti-drapeau monoclonal de souris	Sigma	F1804	Anticorps primaire, ratio de dilution 1:200 ; utilisé pour la détection IFA de protéines de fusion marquées par drapeau
Anticorps monoclonal anti-GAPDH de souris	Sigma	G8795	Anticorps primaire, ratio de dilution 1:2000 ; utilisé comme contrôle de charge pour le Western blotting
Lait écrémé (5 %)	Beyotime	P0216	Tampon de blocage pour le blot occidental ; bloquez à température ambiante pendant 1 h ou 4°rés ; C pendant la nuit
Paraformoldéhyde (4 %)	Merck KGaA	30525	Solution de fixation cellulaire ; fixer à température ambiante pendant 30 minutes
PBS	Solarbio	P1010
Pénicilline-Streptomycine (100 fois)	Yeasen	60162ES76	Antibiotique pour la culture cellulaire ; inhibe la contamination microbienne
Percoll (matériel à gradient DG)	GE Healthcare	17-0891-09
Phénol : chloroforme : isoamyl alcool (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Réactif pour l’élimination des protéines lors de l’extraction d’ADN génomique
Tampon de charge protéique (6 et fois)	Beyotime	P0015F	Tampon de charge par électrophorèse protéique ; formulation : 100 mM Tris (pH 6,8), 4 % SDS, 2 mM EDTA, 2 % de glycérol, 6 M d’urée ; mélange avec 50 & mu ; L 2 M DTT et 50 & mu ; L 5 % de bleu de bromophénol avant utilisation
Protéinase K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg dissous dans 10 mL de ddH2O, utilisés pour la digestion des protéines lors de l’extraction d’ADN génomique
PVDF Membrane	thermofisher	88518	Membrane de transfert de protéines ; activé avec du méthanol pendant 1 minute avant utilisation
Tampon de lyse RIPA	Yeasen	20101	Tampon de lyse pour l’extraction de protéines sporozoïtes
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg dissous dans 2,5 mL 0,01 mol/L de NaAc, chauffés à 100°rés ; C pendant 10-15 minutes, pH ajusté à 7,4 avec 1 mol/L de Tris-HCl ; utilisé pour le retrait d’ARN à partir d’échantillons d’ADN
Réactifs gel SDS-PAGE (acrylamide, bis-acrylamide, tris, SDS, APS, TEMED)	Biographie	101	Des réactifs pour la préparation du gel SDS-PAGE ; La concentration d’acrylamide est ajustée selon le poids moléculaire de la protéine cible
Hydrate de taurodéoxycholate de sodium	Sigma	T0875
solution)
Taq Master Mix (2 fois)	Vazyme	P112-01/02/03	Prémix d’amplification PCR contenant de la polymérase Taq, des dNTP, etc.
Triton X-100 (0,25 %)	Merck KGaA	9036	Solution de perméabilisation cellulaire ; Incuber à température ambiante pendant 30 minutes
Trypsine	Solarbio	T8150
Mélangeur à vortex	Pékin Nord TZ-Biotech	HQ-60-II
Thermostat à bain-marie	Instruments de subvention (Cambridge)	GD120,GM0815010