Article de méthode

Une méthode HPLC-QQQ-MS efficace et rapide pour la quantification des alcaloïdes tropanes dans les plantes médicinales

DOI :

10.3791/70510

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12 juin 2026

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1College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

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Cette étude a développé une chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse quadrupolaire triple (HPLC-QQQ-MS) pour identifier et quantifier les alcaloïdes tropanes (hyoscyamine, anisodamine, scopolamine) chez Anisodus tanguticus. La méthode s’est révélée rapide, précise et fiable pour l’analyse à haut débit des plantes médicinales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anisodus tanguticus est une plante médicinale tibétaine importante. Les alcaloïdes tropanes (TA), tels que l’hyoscyamine, l’anisodamine et la scopolamine, présentent des activités pharmacologiques analgésiques et sédatives significatives, faisant de cette espèce une source naturelle précieuse pour l’extraction de ces composés bioactifs. Cependant, la composition chimique d’A. tanguticus est très complexe. Elle comprend un grand nombre de composés sans structures élucidées, rendant l’identification systématique et la caractérisation structurelle de ses constituants actifs particulièrement importantes. Bien que la chromatographie liquide haute performance (HPLC) ait été largement utilisée pour séparer les extraits de cette plante, de nombreux composants inconnus restent difficiles à identifier avec précision, même avec la correspondance de bases de données spectrales.

Cette étude a établi une méthode analytique basée sur la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse triple quadrupôle (HPLC-QQQ-MS) pour la détermination des alcaloïdes tropanes chez A. tanguticus. La méthode englobe une série de procédures systématiques, incluant la préparation standardisée de l’échantillon, la configuration des paramètres par spectrométrie de masse, la pré-équilibration des LC, l’établissement de la méthode, l’acquisition des données MS, le balayage par spectrométrie de masse multi-étages (MSⁿ) et l’interprétation manuelle des données. Grâce à cette stratégie, nous avons identifié avec succès trois alcaloïdes tropane représentatifs chez A. tangutus : l’hyoscyamine, l’anisodamine et la scopolamine. De plus, elle valide la précision de la méthode établie HPLC-QQQ-MS, confirmant que la méthode est rapide, sensible, réalisable et précise pour la détermination quantitative des alcaloïdes tropanes (TA) chez A. tanguticus. L’approche établie démontre une grande polyvalence et fiabilité, et convient à l’identification et à la quantification à haut débit des alcaloïdes tropanes chez A. tanguticus et d’autres plantes médicinales.

Introduction

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L’efficacité thérapeutique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dépend en grande partie de ses métabolites secondaires, tels que les alcaloïdes, flavonoïdes, terpénoïdes et autres constituantsactifs 1,2,3. Par conséquent, l’analyse qualitative et quantitative précise et sensible des métabolites cibles spécifiques dans ces mélanges complexes est une étape clé pour garantir la qualité de la MTC, élucider la base matérielle de son efficacité et faire progresser la recherchemoderne 3. Cependant, la diversité et la complexité des composants de la MTC, associées aux concentrations extrêmement faibles de nombreux ingrédients actifs clés, posent des défis considérables pour obtenir une détection efficace et précise.

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher représente une source botanique majeure d’alcaloïdes tropane (TAs)4, connu pour sa riche teneur en composés de type tropane pharmacologiquementactifs5. Les alcaloïdes caractéristiques clés incluent l’anisodamine, la scopolamine et l’hyoscyamine, qui partagent un noyau de tropane commun mais présentent des substitutions de groupes fonctionnels distinctes (Figure 1), conduisant à des profils pharmacologiquesdivergents 6,7,8. Bien que leurs similitudes structurelles compliquent la résolution chromatographique, elles offrent également un modèle précieux pour des recherches phytochimiques et métaboliques comparatives. Des études récentes ont étudié la composition chimique et les variations géographiques d’A. tanguticus en utilisant la métabolomique et des approches de pharmacologie enréseau 9,10. Les approches analytiques actuelles pour les métabolites d’A. tanguticus reposent principalement sur la chromatographie liquide haute performance (HPLC)11. Néanmoins, les niveaux d’alcaloïdes tropanes dans le stade A. tanguticus au stade des semis peuvent être aussi bas que 0,01 % (une partie pour dix mille), et les méthodes HPLC conventionnelles sont souvent limitées par une résolution, une sensibilité et un débit analytique limités. Ces limitations entravent la séparation complète des homologues alcaloïdes structurellement analogues et entravent la détection des constituants traces, compromettant ainsi la précision analytique et limitant le soutien aux applications de recherche plus avancées. Ces dernières années, les avancées en HPLC associées à la spectrométrie de masse en tandem ont fourni des outils puissants pour résoudre ces goulets d’étranglement analytiques. La chromatographie liquide haute performance - spectrométrie de masse triple quadrupôle (HPLC-QQQ-MS), en particulier, offre une résolution chromatographique nettement améliorée, une efficacité de séparation et une sensibilité exceptionnelle 12,13,14. Cette technologie s’est imposée comme une plateforme de pointe pour l’étude des métabolites secondaires en MTC, permettant une qualification et une quantification efficaces et précises des analytes cibles traces au sein de matrices biologiquescomplexes 11, 15, 16, 17. En tant que tel, elle offre une base technique solide pour un profilage chimique complet et une évaluation de la qualité de plantes médicinales comme A. tanguticus. Dans cette étude, nous abordons les défis persistants liés à la détection des alcaloïdes tropanes chez A. tanguticus, en mettant l’accent sur l’identification et la quantification précises des constituants de niveau trace. En optimisant systématiquement les conditions chromatographiques et spectrométriques de masse, nous avons développé et validé une nouvelle méthode HPLC-QQQ-MS pour la détermination simultanée de multiples alcaloïdes tropoïdes majeurs. Cette approche optimisée améliore considérablement la sensibilité, la sélectivité et la robustesse méthodologique, surmontant ainsi les limites courantes associées aux tests conventionnels basés sur la spectrométrie de masse — tels que la sensibilité inadéquate, les effets matriciels et les interférences de co-élution — souvent rencontrés lors de l’analyse des composés alkaloïdes traces.

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Protocole

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1. Préparation de l’échantillon

  1. Préparation de solutions standard
    1. Pesez avec précision 10,0 mg chacun des étalons de référence d’hyoscyamine, d’hydrobromure d’anisodamine et de scopolamine hydrobromure à l’aide d’une balance analytique d’un dixième millième, et placez-les dans des fioles volumétriques séparées de 10 mL, respectivement.
    2. Ajoutez du méthanol de qualité chromatographique à la gamme marquée, et dissolvez soigneusement les étalons par traitement ultrasonique pour préparer des solutions standard uniques à une concentration de 1,0 mg/mL.
    3. Transférez les solutions d’origine dans des bouteilles de réactifs bruns, conservez-les à 4 °C dans l’obscurité.
      REMARQUE : Les alcaloïdes utilisés sont hautement toxiques. Prenez des précautions de sécurité lors de la manipulation des échantillons standards. Toutes les solutions étaient préparées fraîchement avant analyse et stockées à 4 °C dans le noir pour éviter leur dégradation.
  2. Préparation de solutions de travail mixtes
    1. Pipeter 100 μL de chaque solution standard mentionnée plus haut dans une fiole volumétrique de 10 mL, puis diluer jusqu’à la ligne marquée avec du méthanol de qualité chromatographique pour préparer une solution intermédiaire standard mixte de 10 μg/mL.
    2. Selon les exigences de la plage linéaire, il faut diluer la solution intermédiaire étape par étape avec du méthanol pour obtenir une série de solutions de travail mixtes.
    3. Prenez respectivement 50 μL, 200 μL et 500 μL. Obtenir des concentrations de 0,5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL et 10 μg/mL. Préparez une fraîcheur avant utilisation.
    4. Transférez 100 μL de la solution intermédiaire de 10 μg/mL dans une fiole volumétrique de 1 mL pour préparer une solution diluée de 1 μg/mL.
    5. Ensuite, transférez 100 μL de la solution de 1 μg/mL dans une autre fiole volumétrique de 1 mL et diluez-la en volume avec du méthanol.
  3. Prétraitement par exemple
    1. Effectuez le lyophilisation des matériaux frais de Sophora flavescens, puis pulvérisez en une poudre homogène à l’aide d’un moulin à grande vitesse.
    2. Tamisez la poudre dans un tamis standard de 0,25 mm. Pèser précisément 20 mg de cette poudre, transférer dans une fiole volumétrique de 100 mL, et ajouter du méthanol de qualité chromatographique presque sur la ligne marquée.
    3. Effectuez une extraction ultrasonique à température ambiante pendant 30 minutes. Après extraction, retirez la fiole volumique, laissez-la refroidir à 25 °C à température ambiante, reconstituez le méthanol chromatographique jusqu’à la ligne marquée de 100 mL, puis mélangez le vortex pendant 2 minutes.
    4. Pipeter 1 mL de l’extrait ci-dessus dans une fiole volumétrique de 100 mL, puis diluer jusqu’à la ligne indiquée avec du méthanol (dilution de 100 fois). Après bien secouée, elle sert de solution mère pour l’injection de HPLC (Figure 2).
      REMARQUE : Lors de l’utilisation de la meuleuse à grande vitesse, il est essentiel de porter des lunettes de protection et un masque anti-poussière ; Contrôlez la quantité et la durée de mouture pour éviter la surchauffe.
  4. Filtration et stockage des échantillons
    1. Préparez une seringue jetable sans aiguille de 1 mL (spécialisée en chromatographie, non adsorptive) et une membrane microporeuse de phase organique de 0,22 μm.
    2. Aspirez 1,2 mL de la solution mère pour l’injection, puis poussez lentement pour la filtration.
    3. Collectez le filtrat suivant dans un flacon d’échantillon de 2 mL avec un insert intérieur, et scellez hermétiquement avec un bouchon.
      REMARQUE : La fréquence du nettoyeur à ultrasons est fixée à 40 kHz. Évitez de desserrer le bouchon de la fiole volumétrique lors de l’extraction afin d’éviter la volatilisation du solvant. Ajustez le facteur de dilution en fonction de la réponse de pic de l’échantillon lors de la pré-expérience pour garantir que la zone de pic cible se situe dans la plage linéaire de la courbe standard. Tous les échantillons doivent être immédiatement conservés au réfrigérateur à 4 °C.

2. Pré-prise HPLC, établissement de méthode et acquisition MS

  1. Préparation des phases mobiles
    1. Préparer la phase mobile A : Mesurer 1000 mL d’eau ultrapure, ajouter 1,0 mL d’acide formique chromatographique (fraction volumique : 0,1 % v/v), et mélanger uniformément à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 10 minutes.
    2. Préparer la phase mobile B : Utiliser directement le méthanol de qualité chromatographique sans traitement supplémentaire.
    3. Verser respectivement les phases mobiles A et B dans des dispositifs de dégazage ultrasonique, et effectuer un dégazage ultrasonore à 40 kHz pendant 15 minutes.
    4. Transférez immédiatement les phases mobiles dégazées vers des bouteilles de solvants après le dégazage, scellez-les et connectez-les aux lignes de solvant A et B correspondantes du système HPLC.
      REMARQUE : Tous les solvants sont de qualité chromatographique et doivent être filtrés à travers une membrane microporeuse de phase organique de 0,45 μm avant utilisation. Surveillez régulièrement la pression du système. Si la fluctuation de pression dépasse ±±5 %, vérifiez la présence potentielle de colonnes bouchées ou de bulles d’air dans le pipeline.
  2. Établissement des conditions HPLC
    1. Utilisez une colonne C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 2,7 μm) pour la séparation chromatographique. Équilibrez la colonne avec méthanol : eau = 80:20 (v/v) pendant 30 minutes avant utilisation, avec un débit de 0,3 mL/min pendant l’équilibre. Réglez la température du four à colonne à 30 °C et commencez à préchauffer 10 minutes à l’avance.
    2. Optimiser un programme d’élution de gradient comme suit : 0–10,0 min, 5 % à 10 % B ; 10,0–15,0 min, 10 % à 35 % B ; 15,0–20,0 min, 35 % à 60 % B ; 20,0–25,0 min, 60 % à 95 % B. Régler le débit à 0,60 mL/min, le volume d’injection à 2 μL, et la longueur d’onde de détection à 210 nm.
  3. Conditions de spectrométrie de masse
    1. Effectuer la détection par spectrométrie de masse (MS) à l’aide d’un spectromètre de masse triple quadrupôle (QQQ) équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation (ESI) fonctionnant en mode ionisation positive (ESI+).
    2. Régler les paramètres de fonctionnement comme suit : pression du nébuliseur : 15 psi ; Tension capillaire : 4000 V ; température du gaz : 300 °C ; et débit de gaz : 11 L/min.
    3. Optimisez systématiquement les paramètres MS/MS pour chaque analyte.
      1. D’abord, identifier les ions précurseurs en infusant directement des solutions standard individuelles en mode SCAN MS2 .
      2. Optimisez la tension du fragmenteur pour chaque ion précurseur jusqu’à l’intensité maximale du signal en utilisant le mode SIM MS2.
      3. Ensuite, on utilise le mode de balayage ionique produit pour déterminer les ions produits caractéristiques. Optimiser systématiquement l’énergie de collision (CE) pour l’ion précurseur afin de maximiser l’intensité du signal produit-ion.
      4. Sélectionnez l’ion produit le plus intense pour la quantification, et utilisez le deuxième ion le plus intense pour la confirmation qualitative.
        REMARQUE : Identifier les ions précurseurs par infusion directe de solutions standard individuelles en mode SCAN MS2. Assurez-vous que la concentration standard de solution est appropriée pour éviter la saturation du signal. Calibrez régulièrement l’instrument pour éviter la dérive des paramètres.
  4. Validation de la méthode
    1. Spécificité
      1. Injectez le solvant vierge (méthanol), la solution de travail standard mélangée et l’extraction d’échantillon séparément, puis comparez les chromatogrammes.
      2. Assurez-vous que les exigences suivantes sont respectées : Aucun pic d’interférence dans le solvant vierge ; Le temps de rétention des composants ciblés dans l’échantillon est cohérent avec celui de l’écart standard (écart ≤ ±±0,1 min) ; Le rapport de surface de pic de l’ion quantificateur par rapport à l’ion qualificateur correspond à celui de l’écart standard (écart ≤ ±±10 %).
    2. Linéarité
      1. Injecter la série de solutions mixtes préparées à l’étape 1.1 (0,1, 0,5, 2, 5, 10 μg/mL) séquentiellement sous les conditions HPLC-MS mentionnées précédemment, avec 3 injections par concentration.
      2. Tracez la courbe standard avec la concentration (x, μg/mL) de chaque composante comme abscisse et la surface de pic moyenne (y) de l’ion quantificateur comme ordonnée. Effectuer une analyse de régression linéaire, nécessitant un coefficient de corrélation (R2) ≥ 0,995.
    3. Précision et exactitude
      1. Précision intrajournalière (répétabilité) : Analysez 6 réplications d’échantillons de contrôle qualité (QC) à trois niveaux de concentration (2 μg/mL, 5 μg/mL et 10 μg/mL) en une journée, et calculez l’écart-type relatif (RSD %).
      2. Précision inter-jours (précision intermédiaire) : Préparer indépendamment des échantillons de contrôle qualité à partir du même lot de matières premières végétales séchées et les analyser par différents opérateurs pendant trois jours consécutifs. et calculer le RSD %. Assurez-vous que le RSD % ≤ 10 % pour les deux.
      3. Évaluer la précision à l’aide d’un test de récupération par pic, et exprimer en taux de récupération ( %). Assurez-vous que le taux moyen de récupération des concentrations faible, moyenne et élevée varie de 85 % à 115 %, avec un taux de RSD ≤ 5 %.
        REMARQUE : La plage linéaire doit couvrir la plage de concentration attendue des composants cibles dans les échantillons réels (y compris les niveaux faibles, moyens et élevés) afin de refléter l’applicabilité pratique. Toutes les expériences de validation ont été réalisées en triple exemplaire, et les résultats ont été exprimés en valeur moyenne.

3. Acquisition de données

  1. Effectuer l’acquisition de données en mode surveillance des réactions multiples (MRM). Consultez le tableau 1 pour les paramètres optimisés de MRM — y compris l’ion précurseur, les transitions ionique produit, la tension du fragmentateur et l’énergie de collision (CE) — pour chaque analyte.
  2. Calculez le temps de permanence pour garantir un nombre suffisant de points de données sur chaque pic chromatographique pour chaque transition tout en maintenant un temps de cycle approprié.

4. Analyse des données

  1. Lancez le logiciel d’analyse qualitative, cliquez sur Fichier > Importer les données, et importez tous les fichiers de données collectés (format .d).
  2. Extraction des chromatogrammes ioniques extraits (EIC) : Dans le module de quantification , sélectionnez Transition MRM, saisissez les paires ion-produit précurseur de chaque composant, et extrayez les EIC correspondantes.
  3. Validation des pics et intégration : Vérifiez la symétrie de pic et la cohérence du temps de rétention (écart ≤ ±±0,1 min par rapport à la norme) des pics cibles dans chaque EIC.
  4. Le logiciel effectue une intégration automatique par défaut ; Si des dérives de base ou des pics interférants existent, ajustez manuellement les paramètres d’intégration (points de début et de fin d’intégration) pour garantir une intégration précise.
  5. Calculez la concentration de chaque composant dans des échantillons inconnus à l’aide de la courbe standard. Cliquez sur Signaler > Générer un rapport, sélectionnez le format Excel pour exporter le rapport. Le rapport inclut le nom du composé, le temps de rétention, la zone de pic, la concentration, le pourcentage de RSD, etc.

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Résultats

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Séparation chromatographique et identification des TA HPLC-QQQ-MS
Un chromatogramme typique de MRM obtenu à partir de l’analyse d’un mélange standard et d’un extrait de racine d’A. tanguticus est présenté dans les figures 3 et 4. Dans les conditions optimisées du HPLC, les trois alcaloïdes tropane cibles : hyoscyamine, anisodamine et scopolamine, ont été séparés avec succès en moins de 20 minutes, dé...

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Discussion

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Avec l’intérêt croissant pour les métabolites secondaires des plantes, les techniques analytiques de détection des alcaloïdes ont suscité une attention significative. Bien qu’un système chromatographique fondamental pour l’analyse des alcaloïdes tropanes (TA) ait étéétabli 18, des avancées récentes, telles que l’adoption de l’électrophorèse capillaire (CE), l’amélioration des performances instrumentales dans GC–MS et HPLC–MS, ainsi que l’identification de nouveaux...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail est soutenu par l’Administration provinciale de la médecine traditionnelle chinoise du Sichuan (n° 2024MS562) et le programme de talents Xinglin de l’Université de Chengdu de la MTC (n° MPRC2022035). Nous avons vraiment apprécié le soutien de l’Institut innovant de médecine et de pharmacie chinoises de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Logiciel Agilent MassHunterAgilent Technologies
Colonne Agilent ZORBAX SB-C18Agilent Technologies880975-902Colonne C18 à phase inverse, 4,6 × 250 mm, 5 μm
Anisodamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd101-31-5HPLC>98%
Acide formiqueSigma-Aldrich5.33002
LyophilisateurEYELA, Tokyo, JaponFDU-2110
Broyeur universel à grande vitesseTaisite Instrument Co., Ltd., Tianjin, Chine6010210100FW-100, 24 000 tr/min, capacité de 100 g, 80 mailles
HyoscyamineChengdu glip Biotechnology Co., Ltd55449-49-5HPLC>98%
MéthanolThermo Fisher Scientific022909.K2
Membrane microporeuse 0,22μmMilliporeSLGV033RB
Système d'eau Milli-Q Direct 8MilliporeSigma, Burlington, MA, USAZRQSVP0JP
Scopolamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd114-49-8HPLC>98%

Références

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