Method Article

Génération et analyse transcriptomique unicellulaire des organoïdes du carcinome hépatocellulaire après un traitement médicamenteux

DOI:

10.3791/70511

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May 26th, 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode simplifiée pour générer des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, appliquer un traitement médicamenteux et effectuer un séquençage d’ARN unicellulaire avant et après le traitement afin de caractériser les changements transcriptionnels associés au traitement.

Abstract

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Le carcinome hépatocellulaire est une cause majeure de mortalité liée au cancer dans le monde et se caractérise par une forte hétérogénéité intratumorale, qui contribue à des réponses thérapeutiques variables, à la récidive tumorale et à la progression de la maladie. Une compréhension plus approfondie de la façon dont les cellules tumorales évoluent au niveau transcriptionnel avant et après le traitement médicamenteux est donc essentielle pour améliorer les stratégies thérapeutiques. Cependant, les flux de travail expérimentaux pratiques reliant le traitement médicamenteux à base d’organoïdes au profilage transcriptomique unicellulaire en aval restent limités. Dans cette étude, un flux de travail standardisé pour générer des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, appliquer un traitement médicamenteux défini et effectuer un séquençage d’ARN unicellulaire sur des échantillons collectés avant et après le traitement est développé. Le protocole comprend la réactivation et l’expansion des organoïdes, l’évaluation de la qualité avant traitement, l’exposition aux médicaments, la préparation organoïde à la dissociation unicellulaire, la construction de bibliothèques et l’analyse comparative de base des données transcriptomiques unicellulaires. Des précautions techniques cruciales sont prises pour améliorer la reproductibilité et la qualité de l’échantillon. Ce flux de travail permet une caractérisation côte à côte de la composition cellulaire et des changements transcriptionnels associés au traitement médicamenteux dans les organoïdes du carcinome hépatocellulaire. Le protocole est robuste, évolutif et adaptable à différents systèmes organoïdes, offrant une plateforme pratique pour étudier les changements d’expression génique associés au traitement à résolution unicellulaire.

Introduction

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Le carcinome hépatocellulaire (CCH) est le cancer hépatique primaire le plus courant chez l’adulte et une cause majeure de décès liés au cancer dansle monde 1,2,3. Son mauvais résultat clinique est dû à une hétérogénéité intratumorale significative, entraînant une résistance au traitement et unerécidive 4. Une étude récente indique que la diversité développementale et la plasticité de l’état cellulaire, entraînées par des programmes transcriptionnels clés tels que l’axe FOXM1/CEBPB, contribuent à la résistance thérapeu....

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Protocol

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Les études utilisant des tissus humains ont été examinées et approuvées par les comités d’éthique de la recherche de l’Université médicale de Guangzhou (n° d’approbation GYZL-2024-KY31). Toutes les procédures impliquant des spécimens humains ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour la recherche humaine. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients pour l’utilisation de leurs échantillons cliniques à des fins de recherche médicale. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

Ce flux de travail inclut la récupérat....

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Results

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La figure 1 présente la génération et la caractérisation des organoïdes du carcinome hépatocellulaire (CCH). Dans la Figure 1A, des tissus tumoraux dérivés du patient ont été utilisés pour établir des cultures organoïdes en vue d’analyses histologiques et d’études thérapeutiques. La figure 1B montre des images en champ clair des organoïdes aux jours 1 et 6 après la récupération, démontrant la survie.......

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Discussion

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Pour garantir la reproductibilité, l’efficacité et une analyse transcriptomique monocellulaire de haute qualité, plusieurs étapes techniques de ce flux de travail nécessitent un contrôle attentif. La cohérence lors de la réactivation et de l’expansion des organoïdes HCC dérivés du patient est essentielle, car les variations de densité de semaillement, de composition de la matrice membranaire basale et de timing de la culture peuvent influencer la morphologie organoïde, la croissance et l.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

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Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82303022 ; 82122048 ; 82372714 ; 82203380), la Fondation de recherche fondamentale et appliquée fondamentale du Guangdong (2023A1515011416) et la Fondation de recherche fondamentale et appliquée de Guangzhou (2024A04J6575). Certains éléments schématiques ont été créés à l’aide de Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) et ont été adaptés par les auteurs. Les illustrations schématiques ont été créées à l’aide de Figdraw (https://www.figdraw.com) et adaptées par les auteurs.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-gastrine I humaineMerckG9145
Microtubes de 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
Tampon de lyse des globules rouges 1XThermo Fisher Scientific00-4333-57
Fioles cryogéniques à filetage interne de 2,0 mlNest607001
A8301 (inhibiteur TGFb)Tocris Bioscience2939
Anticorps polyclonal AFPProteintech14550-1-AP
Anticorps anti-albumine [ALB/2144]Abcamab236492
Anticorps anti-HNF-4-alpha [EPR16885] - Grade ChIPAbcamab181604
Anticorps anti-préalbumine [EPR3219]Abcamab92469
Anticorps anti-SOX9 [EPR14335-78]Abcamab185966
Supplément de B27 (503), sans vitamine AThermo Fisher Scientific12587010
Solution de récupération cellulaire, 100 mLCorning354253Réactif utilisé pour dissoudre la matrice membranaire basale et récupérer les organoïdes avant le replacage ou le traitement en aval
CellTiter-Glo® ;   ; Test de viabilité des cellules 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothèque & Kit de billes en gel v3.1Génomique 10xCG000227
Passoire cellulaire de Corning, 40 et mu ; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Costar Lisière à fond plat transparent à 24 puits ultra-bas et attachement multiple, enveloppées individuellement, stérilesCorning3473
Cultrex Facteur de croissance réduit (EMB), Type 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Matrice extracellulaire utilisée pour soutenir la culture organoïde tridimensionnelle et la formation de dômes
DMSOMerckC6164Solvant utilisé pour préparer des solutions de stockage de médicaments et le contrôle des véhicules
Eagle Medium modifié de Dulbecco/F-12 de HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 avancé
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inhibiteur de la tyrosine kinase utilisé pour le traitement organoïde et la perturbation thérapeutique
FBS de la valeur du sérum bovin fœtalGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
Supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosineBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscope motorisé à fluorescence Leica DM6 BLeicaN/A
Supplément N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acétylcystéineMerckA0737-5MG
NicotinamideMerckN0636
Tubes centrifugeurs stériles en polypropylène conique Nunc 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Solution physiologique tamponnée au phosphateGENOM BIOGNM20012Tampon utilisé pour le lavage des organoïdes et la préparation des échantillons pour le traitement en aval
EGF humain recombinantPeprotechAF-100-15
FGF10 humain recombinantPeprotech100-26
HFF humaine recombinantePeprotech100-39
Noggin humain recombinantPeprotech120-10C
Inhibiteur de la rho kinase Y-27632 dihydrochlorureMerckY0503Inhibiteur de ROCK utilisé pour améliorer la survie des organoïdes après dégel ou passage
Milieu conditionné R-spodin1(Broutier et al.)N/ASécrétion des lignées cellulaires
Trypan Blue Stain, filtré à 0,4 % par membrane Préparé dans une saline à 0,85 %Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), sans phénol rougeThermo Fisher Scientific12604013Substitut à la trypsine
Milieu conditionné Wnt-3a(Broutier et al.)N/ASécrétion des lignées cellulaires

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Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

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