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Article de méthode

Génération et analyse transcriptomique unicellulaire des organoïdes du carcinome hépatocellulaire après un traitement médicamenteux

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DOI :

10.3791/70511

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26 mai 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simplifiée pour générer des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, appliquer un traitement médicamenteux et effectuer un séquençage d’ARN unicellulaire avant et après le traitement afin de caractériser les changements transcriptionnels associés au traitement.

Résumé

Le carcinome hépatocellulaire est une cause majeure de mortalité liée au cancer dans le monde et se caractérise par une forte hétérogénéité intratumorale, qui contribue à des réponses thérapeutiques variables, à la récidive tumorale et à la progression de la maladie. Une compréhension plus approfondie de la façon dont les cellules tumorales évoluent au niveau transcriptionnel avant et après le traitement médicamenteux est donc essentielle pour améliorer les stratégies thérapeutiques. Cependant, les flux de travail expérimentaux pratiques reliant le traitement médicamenteux à base d’organoïdes au profilage transcriptomique unicellulaire en aval restent limités. Dans cette étude, un flux de travail standardisé pour générer des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, appliquer un traitement médicamenteux défini et effectuer un séquençage d’ARN unicellulaire sur des échantillons collectés avant et après le traitement est développé. Le protocole comprend la réactivation et l’expansion des organoïdes, l’évaluation de la qualité avant traitement, l’exposition aux médicaments, la préparation organoïde à la dissociation unicellulaire, la construction de bibliothèques et l’analyse comparative de base des données transcriptomiques unicellulaires. Des précautions techniques cruciales sont prises pour améliorer la reproductibilité et la qualité de l’échantillon. Ce flux de travail permet une caractérisation côte à côte de la composition cellulaire et des changements transcriptionnels associés au traitement médicamenteux dans les organoïdes du carcinome hépatocellulaire. Le protocole est robuste, évolutif et adaptable à différents systèmes organoïdes, offrant une plateforme pratique pour étudier les changements d’expression génique associés au traitement à résolution unicellulaire.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CCH) est le cancer hépatique primaire le plus courant chez l’adulte et une cause majeure de décès liés au cancer dansle monde 1,2,3. Son mauvais résultat clinique est dû à une hétérogénéité intratumorale significative, entraînant une résistance au traitement et unerécidive 4. Une étude récente indique que la diversité développementale et la plasticité de l’état cellulaire, entraînées par des programmes transcriptionnels clés tels que l’axe FOXM1/CEBPB, contribuent à la résistance thérapeutique dans leHCC 5. Ces résultats soulignent la nécessité de comprendre comment les populations de cellules tumorales s’adaptent et transitent entre les états soumis à une pression soutenue sous traitement. Cependant, la plupart des modèles précliniques ne capturent pas adéquatement la nature dynamique et continue de ces transitions d’état associées au traitement, limitant l’investigation mécanistique de l’adaptation tumorale et de l’échec thérapeutique.

Les organoïdes dérivés du patient (PDO) constituent une plateforme utile à cet effet car ils préservent d’importantes altérations génomiques et l’hétérogénéité cellulaire de la tumeurd’origine 6. Les organoïdes du CHC peuvent être maintenus en culture à long terme tout en conservant les caractéristiques clés destissus, ce qui les rend particulièrement adaptés aux études de traitement et de réponse. De plus, des études basées sur des organoïdes ont démontré la faisabilité d’utiliser des organoïdes du cancer du foie pour les tests de médicaments et pour capturer les différences interpatients et intratumorales de sensibilité thérapeutique, soutenant leur valeur en tant que modèles précliniques pour la recherchetraitement-réponse 8,9. Cependant, la plupart des études sur des médicaments à base d’organoïdes reposent encore principalement sur des mesures de viabilité des critères de fin ou se concentrent principalement sur les réponses phénotypiques en masse, fournissant ainsi des informations limitées sur les réponses cellulaires hétérogènes et les changements transcriptionnels associés au traitement. Parallèlement, le développement rapide de stratégies thérapeutiques à ARN pour le CHC souligne encore la nécessité de systèmes précliniques capables de prédire et de disséquer mécaniquement les réponses thérapeutiques à la résolution unicellulaire10.

Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) permet une caractérisation à haute résolution de la composition cellulaire et des états transcriptionnels au sein des modèlesorganoïdes 11. Lorsqu’il est appliqué à des organoïdes collectés avant et après le traitement, le scRNA-seq peut révéler des changements d’expression génique, des variations des populations cellulaires et des réponses hétérogènes qui ne sont pas capturées par des tests en masse. Cette approche représente donc une stratégie pratique et puissante pour étudier le remodelage transcriptionnel associé au traitement dans les organoïdes du HCC. Cependant, un flux de travail pratique et reproductible intégrant la culture organoïde du HCC, le traitement médicamenteux et le séquençage de l’ARN unicellulaire avant et après traitement reste insuffisant. Un tel flux de travail est le plus efficace lorsque l’intégrité organoïde est maintenue lors de l’exposition au médicament et que suffisamment de cellules viables sont récupérées pour le profilage ultérieur d’une seule cellule. Comme pour d’autres approches organoïdes, les limites importantes incluent une représentation incomplète des composants stromal, vasculaire et immunitaire du microenvironnement tumoral, ainsi qu’un biais de sélection potentiel lors d’une culture in vitro prolongée.

Un flux de travail expérimental intégré est décrit pour la génération d’organoïdes HCC, l’application de traitements médicamenteux définis et le traitement des échantillons d’organoïdes pour le séquençage d’ARN unicellulaire avant et après le traitement. Ce flux de travail englobe la réactivation et l’expansion des organoïdes, l’évaluation de la qualité avant traitement, l’exposition contrôlée aux médicaments, et le séquençage en aval de l’ARN unicellulaire d’échantillons appariés. Cette approche fournit un cadre pratique pour comparer, à résolution unicellulaire, les changements associés au traitement dans la composition cellulaire et les programmes d’expression génique chez les organoïdes HCC.

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Protocole

Les études utilisant des tissus humains ont été examinées et approuvées par les comités d’éthique de la recherche de l’Université médicale de Guangzhou (n° d’approbation GYZL-2024-KY31). Toutes les procédures impliquant des spécimens humains ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour la recherche humaine. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients pour l’utilisation de leurs échantillons cliniques à des fins de recherche médicale. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

Ce flux de travail inclut la récupération et l’expansion des organoïdes du carcinome hépatocellulaire cryopréservé, avec des adaptations mineures pour la perturbation thérapeutique en aval et le séquençage de l’ARN unicellulaire. L’objectif est de générer des cultures organoïdes d’une qualité et d’une constance suffisantes pour les expériences ultérieures de traitementmédicamenteux 12.

1. Établissement et expansion des organoïdes dérivés des patients atteints de HCC

  1. Dégel et récupération des organoïdes cryopréservés
    1. Préparation avant décongélation
      1. Préchauffez un bain-marie à 37 °C. Pré-équilibrer une plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 heure avant le placage.
      2. Préparez à l’avance un milieu de culture organoïde complet et conservez l’extrait de membrane basale (EMC) sur la glace jusqu’à utilisation. La composition complète du milieu de culture organoïde est fournie dans le Tableau Supplémentaire 1.
    2. Dégel des organoïdes
      1. Retirez les cryovials contenant des organoïdes HCC congelés de la réserve d’azote liquide et placez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Agitez doucement la fiole et arrêtez de dégeler quand il ne reste plus qu’un petit cristal de glace.
    3. Retrait du cryoprotecteur
      1. Pipetez doucement la suspension décongelée une fois pour en remettre le contenu.
      2. Transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL contenant 3 à 5 mL de milieu de culture organoïde complet.
      3. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger la pellete.
  2. Incorporation et replacage des organoïdes
    1. Préparation du mélange de récupération
      1. Resuspendez la pellete organoïde dans un milieu de culture organoïde complet. La composition complète du milieu de culture organoïde est fournie dans le Tableau Supplémentaire 1.
      2. Mélangez doucement avec un volume égal de BME glacé pour obtenir le mélange de plaque.
        REMARQUE : Maintenez le mélange sur de la glace pour éviter une polymérisation prématurée.
    2. Plaquage des dômes organoïdes
      1. Distribuez 50 μL du mélange organoïde-matrice dans chaque puits d’une plaque préchauffée à 24 puits.
      2. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre la solidification de la matrice.
      3. Ajoutez 500 μL de milieu de culture organoïde complet, complétés par 20 μM Y-27632, à chaque puits le long de la paroi du puits.
        REMARQUE : Limitez l’utilisation de Y-27632 aux 2 à 3 premiers jours après la décongélation ou la sortie. Assurez-vous que chaque dôme reste compact et fixé au fond du puits, sans s’étendre vers l’extérieur.
  3. Culture organoïde et expansion
    1. Conditions de la culture de récupération
      1. Maintenir les organoïdes à 37 °C avec 5 % de CO2.
      2. Utilisez un milieu contenant 20 μM Y-27632 pendant les 2 à 3 premiers jours après la décongélation.
    2. Remplacement moyen
      1. Remplacez le substrat en culture tous les 3 à 4 jours en utilisant une aspiration douce.
      2. Ajoutez un nouveau substrat le long de la paroi de chaque puits pour éviter de perturber les dômes matriciels.
      3. Maintenir le même calendrier de remplacement du milieu sur tous les puits au sein de la même expérience.
    3. Suivi de la croissance
      1. Surveillez la récupération et l’expansion des organoïdes à l’aide d’un microscope en champ clair avec des réglages d’imagerie cohérents.
      2. Enregistrer des images représentatives à des moments définis pendant la récupération et l’expansion.
      3. Confirmer la récupération réussie lorsque la majorité des structures restent intactes, que les organoïdes présentent une morphologie ronde à ovale avec des bordures lisses, un élargissement progressif observé au fil du temps, et que des débris ou structures effondrées sont minimes.
      4. Excluez les puits contenant moins de 10 organoïdes intacts de l’analyse quantitative en aval.
    4. Critères de passage et d’expansion
      1. On observe des organoïdes de passage après expansion stable.
      2. Confirmer une expansion stable par des augmentations reproductibles de la taille organoïde ou de la surface totale avec morphologie préservée.
      3. Utilisez des critères d’imagerie cohérents entre intervalles, grossissement et inclusion entre les expériences.
      4. Générez des courbes de croissance représentatives basées sur la surface organoïde ou les comptages pour confirmer la stabilité.
    5. Critères pour les expériences en aval
      1. Utilisez des lignées organoïdes présentant une croissance tridimensionnelle stable, sans contamination ni effondrement important, et offrant un rendement suffisant pour des conditions expérimentales parallèles.
      2. Maintenir les cultures pendant au moins 7 à 10 jours après le dégel ou jusqu’à la fin de la récupération et d’un cycle d’expansion.
      3. Avancez uniquement les lignes organoïdes montrant une morphologie cohérente entre les puits réplicatifs.

2. Préparation des organoïdes pour la perturbation thérapeutique

  1. Évaluation de la qualité avant traitement
    1. Évaluation basée sur la morphologie
      1. Confirmez que les organoïdes sont ronds à ovales en morphologie.
      2. Confirmez que les organoïdes présentent des bordures lisses et bien définies.
      3. Confirmez la présence minimale de débris cellulaires dans le dôme.
      4. Excluez les cultures présentant une fragmentation importante, des lumens assombris, un effondrement généralisé ou une contamination évidente.
    2. Évaluation de l’expansion de l’État
      1. Utilisez uniquement des cultures organoïdes ayant terminé leur récupération et entré dans une expansion stable.
      2. Confirmez l’élargissement progressif au fil du temps.
      3. Confirmez une morphologie cohérente à travers les puits réplicatifs.
  2. Replacage des organoïdes pour le traitement médicamenteux
    1. Récupération des organoïdes à partir de la matrice
      1. Dissoudre les dômes organoïdes sur de la glace à l’aide de 1 mL de solution de récupération des cellules glacées par puits pendant 15 à 20 minutes.
      2. Pipettez doucement toutes les 5 minutes pendant l’incubation.
      3. Centrifugez la suspension récupérée à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      4. Resuspendez le pellet dans un milieu de culture organoïde complet.
    2. Normalisation avant le replacage
      1. Standardisez la charge organoïde initiale entre les puits avant le traitement médicamenteux.
      2. Déterminer le nombre cellulaire viable après une dissociation partielle lorsque c’est possible.
      3. Normaliser les échantillons au même nombre de cellules d’entrée par puits.
      4. Placez environ 1 000 à 5 000 cellules viables par puits dans un format à 24 puits.
      5. Si le comptage direct des cellules n’est pas effectué, normaliser en assurant un nombre comparable d’organoïdes morphologiquement intacts par puits et une répartition de taille similaire entre les groupes.
      6. Notez le nombre initial d’organoïdes et la morphologie de base pour chaque bien avant le traitement.
      7. Utiliser les mêmes critères d’inclusion et la même stratégie de placage sur tous les puits au sein d’une même expérience.
    3. Replaque pour traitement médicamenteux
      1. Mélanger des organoïdes récupérés avec une matrice membranaire basale glacée à une concentration finale de 30 % à 50 %.
      2. Distribuez des dômes de 50 μL dans chaque puits d’une plaque à 24 puits.
      3. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation.
      4. Ajoutez 500 μL de culture organoïde complète par puits le long de la paroi du puits.
        REMARQUE : Assurez-vous que chaque dôme reste compact et fixé au fond du puits, sans s’étendre vers l’extérieur. Utilisez le même volume de dôme et la concentration matricielle sur tous les puits de la même expérience.
  3. Guérison avant traitement médicamenteux
    1. Récupération après le replaque
      1. Laisser les organoïdes récupérer pendant la nuit dans des conditions de culture standard.
      2. Le traitement n’est commencé qu’après que la morphologie intacte soit rétablie dans les dômes replacés.
    2. Critères d’entrée pour le traitement de la toxicomanie
      1. Commencer le traitement médicamenteux seulement lorsque les organoïdes restent intacts après le replacage, qu’aucun effondrement généralisé ou débris excessif n’est présent, et que la charge organoïde est comparable entre les puits.
      2. Enregistrer les images de base en champ clair pour tous les groupes expérimentaux avant le traitement.
      3. Maintenir la même charge organoïde initiale, le temps de récupération après le replacage et le temps d’initiation du traitement sur tous les puits témoins et traités.
  4. Considérations de sécurité
    1. Effectuer toutes les procédures impliquant des organoïdes d’origine humaine en utilisant des équipements de protection individuelle appropriés et des pratiques de biosécurité.
    2. Manipulez soigneusement les réactifs enzymatiques de dissociation pour éviter l’exposition de la peau ou des yeux.
    3. Éliminer les déchets biologiques liquides et solides conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.

3. Traitement médicamenteux des organoïdes du CHC

  1. Préparation et traitement des médicaments
    1. Préparation des médicaments
      1. Préparez la solution de stock de lenvatinib dans le DMSO selon les instructions du fabricant.
      2. Diluez la solution d’origine dans un milieu de culture préchauffé immédiatement avant utilisation, jusqu’à la concentration de travail prédéfinie.
      3. Maintenir la même concentration finale de DMSO sur tous les puits (≤ 0,1 %).
      4. Préparez un volume suffisant pour garantir un volume final de traitement égal dans chaque puits.
    2. Traitement des drogues
      1. Ajoutez un milieu contenant du lenvatinib (20 μM) le long de la paroi de chaque puits pour éviter de perturber les dômes matriciels.
      2. Inclure un contrôle de véhicule avec la même concentration finale de DMSO.
      3. Incuber les organoïdes dans des conditions de culture standard pendant la période de traitement prédéfinie.
      4. Remplacer le milieu contenant un médicament toutes les 48 à 72 heures pour les durées de traitement supérieures à 72 heures.
      5. Utilisez le même calendrier de remplacement du milieu pour tous les puits de l’expérience.
      6. Enregistrez des images de base en champ clair avant traitement.
      7. Acquérir des images à intervalles fixes pendant le traitement en utilisant les mêmes réglages de microscope, le même grossissement et les mêmes positions de champ.
  2. Évaluation de la réponse au traitement
    1. Évaluation basée sur la morphologie
      1. Évaluer la réponse au traitement à l’aide des données suivantes basées sur l’image : courbe de croissance de la zone organoïde, diamètre moyen des organoïdes et nombre d’organoïdes survivants.
      2. Utilisez des réglages d’exposition, un grossissement et des seuils d’analyse identiques pour toutes les images.
      3. Mesurez la courbe de croissance de la surface organoïde en calculant la surface organique totale par puits ou champ à chaque moment et en la normalisant à la ligne de base.
      4. Mesurez le diamètre moyen des organoïdes en déterminant le diamètre des organoïdes intacts individuels et en calculant la valeur moyenne par puits.
      5. Déterminer le nombre d’organoïdes survivants en comptant les organoïdes intacts morphologiquement identifiables et en excluant les débris et fragments effondrés.
    2. Mesure optionnelle de la viabilité
      1. Effectuer un test de viabilité par luminescence tridimensionnel au point final du traitement si une évaluation supplémentaire de viabilité en vrac est nécessaire.
      2. Suivez les instructions du fabricant pour l’exécution du test.
  3. Analyse des données
    1. Tracez les courbes de croissance de la zone organoïde au fil du temps.
    2. Comparez le diamètre moyen des organoïdes entre les groupes traités par véhicule et ceux traités par lenvatinib.
    3. Comparez les décomptes d’organoïdes survivants entre les groupes de traitement.
    4. Appliquer des schémas d’acquisition d’images identiques, des critères d’inclusion organoïdaux et des paramètres d’analyse dans tous les groupes afin d’assurer la reproductibilité.

4. Préparation des organoïdes pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

  1. Sélection et récupération des organoïdes
    1. Évaluation avant dissociation
      1. Certains puits organoïdes présentent une morphologie tridimensionnelle intacte sans effondrement généralisé, contiennent suffisamment de matière pour une capture monocellulaire en aval, et ne présentent aucune contamination évidente.
      2. Prélèvez des organoïdes à des points temporels expérimentaux correspondants entre les échantillons témoins et traités.
      3. Maintenir la même densité de placage, le même calendrier de traitement et les conditions de remplacement du milieu entre les échantillons.
      4. Enregistrez des images en champ clair de chacune sélectionnée bien avant la dissociation en utilisant les mêmes réglages de microscope, grossissement et critères de sélection du champ.
    2. Suppression de la matrice
      1. Aspirez complètement le milieu de culture de chaque puits.
      2. Lavez chaque puits deux fois avec du PBS bien froid pour enlever le milieu résiduel et les débris.
      3. Ajoutez 1 mL de solution de récupération à cellules glacées dans chaque puits.
      4. Incubez sur glace pendant 20 à 30 minutes.
      5. Pipette doucement toutes les 5 à 7 minutes pendant l’incubation pour faciliter la dissolution de la matrice.
      6. Transférez le matériau dissous dans des tubes pré-refroidis à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre ou coupée pour minimiser les contraintes de cisaillement.
      7. On ne procède à la dissociation enzymatique qu’une fois que la matrice est en grande partie dissoute et qu’il reste un minimum de résidus visibles de gel.
  2. Dissociation enzymatique et préparation à la suspension unicellulaire
    1. Dissociation enzymatique
      1. Centrifugez la suspension organoïde récupérée à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      2. Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille.
      3. Resuspendez la pellete dans 1 mL d’enzyme de dissociation cellulaire recombinante.
      4. Incubez à 37 °C pendant 5 à 10 minutes.
      5. Pipeter doucement 8 à 10 fois toutes les 2 à 3 minutes à l’aide d’une pointe P1000 à large calibre pour favoriser la dissociation.
      6. Arrêtez la digestion lorsque la plupart des fragments organoïdes se sont dispersés en cellules uniques et que seuls de petits grappes résiduels subsistent.
      7. Éviter une digestion prolongée pour éviter une viabilité cellulaire réduite, des artefacts transcriptionnels liés au stress et une augmentation de la contamination à l’ARN ambiant.
    2. Trempe et filtration
      1. Ajoutez 4 mL de sérum bovin fœtal glacé contenant 2 % de sérum bovin fœtal pour arrêter la digestion.
      2. Filtrez la suspension à travers un filtre à cellules de 40 μm.
      3. Lavez une fois avec du PBS pour éliminer les enzymes résiduelles, les agrégats et les débris.
      4. Effectuer une lyse des globules rouges si une contamination par les érythrocytes est présente, en suivant les instructions du fabricant.
    3. Préparation des cellules et contrôle qualité
      1. Compter les cellules en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.
      2. Déterminez la viabilité des cellules avant la préparation de la bibliothèque.
      3. Utilisez uniquement des échantillons avec une viabilité ≥ 85 %.
      4. Ajustez la concentration finale de la cellule à 700–1 200 cellules/μL.
      5. Excluez les échantillons présentant des débris excessifs, des cellules mortes abondantes, de grands agrégats visibles ou une dissociation incomplète.
      6. Répétez la filtration avant le chargement si des granulats sont présents.
      7. Le contrôle du procédé et les échantillons traités dans des conditions identiques, incluant l’enzyme de dissociation, le temps de digestion, la fréquence de pipettement, la méthode de filtration, la concentration cellulaire et la stratégie de chargement.
  3. Préparation et séquençage de bibliothèques monocellulaires
    1. Capture unicellulaire et préparation de la bibliothèque
      1. Chargez la suspension monocellule préparée sur une plateforme de capture monocellule à base de gouttelettes selon les instructions du fabricant.
      2. Effectuer la transcription inverse, l’amplification d’ADNc et la construction de bibliothèques en utilisant le flux de travail 3′ à cellule unique correspondant.
    2. Paramètres de séquençage
      1. Des bibliothèques de séquences à une profondeur d’au moins 50 000 lectures par cellule.
      2. Des cellules de charge pour atteindre une récupération d’environ 6 000 à 10 000 cellules par bibliothèque.
      3. Enregistrer la chimie du séquençage, la structure de lecture et les réglages des instruments.
  4. Critères de qualité pour l’analyse en aval
    1. Assurez-vous que la préparation finale présente une forte viabilité cellulaire, un minimum de débris et une faible charge d’agrégats.
    2. Confirmer l’adéquation à l’analyse transcriptomique monocellulaire en aval de l’hétérogénéité cellulaire et des transitions d’état cellulaire.

5. Traitement de base et contrôle qualité des données de séquençage de l’ARN unicellulaire

  1. Traitement primaire
    1. Génération de matrice de comptage
      1. Traiter les données brutes de séquençage en utilisant le pipeline recommandé pour la plateforme sélectionnée.
      2. Générez une matrice de comptage gène par cellule.
      3. Enregistrer la version logicielle, la construction du génome de référence et la publication de l’annotation de transcription.
    2. Évaluation initiale de la qualité au niveau de la bibliothèque
      1. Résumez les métriques de séquençage pour chaque bibliothèque, y compris le nombre total de lectures, le nombre estimé de cellules récupérées, la médiane des gènes par cellule, les UMI médianes par cellule, et la saturation du séquençage (le cas échéant).
      2. Utilisez des réglages identiques du génome de référence et des annotations pour tous les échantillons.
  2. Contrôle qualité au niveau de la cellule
    1. Filtrage des cellules de faible qualité
      1. Évaluer pour chaque cellule le nombre de gènes détectés, le nombre total d’UMI, la proportion de transcrits mitochondriaux et les preuves de doublets ou multiplets.
      2. Excluez les cellules ayant un nombre de gènes extrêmement faible, un nombre d’UMI extrêmement faible ou des fractions de transcrits mitochondriaux anormalement élevées.
      3. Définir des seuils de filtrage en fonction de la distribution des ensembles de données.
      4. Appliquez des seuils identiques entre les groupes de traitement appariés.
    2. Retrait des doublets probables
      1. Identifier les doublets probables en utilisant une méthode de calcul appropriée.
      2. Supprimez les doublets en utilisant un flux de travail de détection compatible avec la plateforme.
      3. Appliquez la même stratégie de détection de doublets sur tous les échantillons.
  3. Normalisation, regroupement et annotation
    1. Normalisation des données
      1. Normaliser la matrice de comptage filtrée en utilisant un flux de travail standard de séquence ARN à cellule unique.
      2. Appliquer des procédures de normalisation identiques sur tous les échantillons.
    2. Réduction de dimensionnalité et regroupement
      1. Effectuer une réduction de dimensionnalité.
      2. Effectuer un regroupement non supervisé pour identifier les principales populations transcriptionnelles.
      3. Visualisez les états des cellules à l’aide d’une méthode d’immersion de basse dimension telle qu’UMAP.
    3. Identification des gènes marqueurs
      1. Identifier les gènes marqueurs à l’aide d’une analyse d’expression différentielle entre groupes.
      2. Attribuer une interprétation biologique aux principaux états cellulaires épithéliaux en fonction de l’expression des marqueurs.
  4. Analyse comparative des conditions de traitement
    1. Intégration des métadonnées
      1. Annoter chaque cellule avec la condition de traitement, la lignée organoïde dérivée du patient et le lot de traitement.
      2. Maintenir une structure de métadonnées cohérente à travers tous les échantillons.
    2. Analyse des changements associés au traitement
      1. Comparez les échantillons témoins et traités.
      2. Identifier le remodelage transcriptionnel associé au traitement.
      3. Identifier les changements dans la composition de l’état cellulaire.
      4. Identifier les populations cellulaires candidates associées à l’adaptation thérapeutique.
      5. Interprétez les résultats en même temps que les données basées sur la morphologie et la viabilité.
  5. Résultats d’analyse des données
    1. Générez une matrice de comptage de type contrôle qualité par cellule.
    2. Générez des visualisations à faible dimension de populations transcriptionnellement distinctes.
    3. Identifier les gènes marqueurs des grands clusters.
    4. Maintenir la cohérence entre tous les échantillons du génome de référence, du flux de prétraitement, des critères de filtrage, de la stratégie de regroupement et des critères d’annotage.
    5. Documentez toute écartation spécifique à l’échantillon par rapport au flux de travail standard.

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Résultats

La figure 1 présente la génération et la caractérisation des organoïdes du carcinome hépatocellulaire (CCH). Dans la Figure 1A, des tissus tumoraux dérivés du patient ont été utilisés pour établir des cultures organoïdes en vue d’analyses histologiques et d’études thérapeutiques. La figure 1B montre des images en champ clair des organoïdes aux jours 1 et 6 après la récupération, démontrant la survie...

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Discussion

Pour garantir la reproductibilité, l’efficacité et une analyse transcriptomique monocellulaire de haute qualité, plusieurs étapes techniques de ce flux de travail nécessitent un contrôle attentif. La cohérence lors de la réactivation et de l’expansion des organoïdes HCC dérivés du patient est essentielle, car les variations de densité de semaillement, de composition de la matrice membranaire basale et de timing de la culture peuvent influencer la morphologie organoïde, la croissance et l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82303022 ; 82122048 ; 82372714 ; 82203380), la Fondation de recherche fondamentale et appliquée fondamentale du Guangdong (2023A1515011416) et la Fondation de recherche fondamentale et appliquée de Guangzhou (2024A04J6575). Certains éléments schématiques ont été créés à l’aide de Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) et ont été adaptés par les auteurs. Les illustrations schématiques ont été créées à l’aide de Figdraw (https://www.figdraw.com) et adaptées par les auteurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
[Leu15]-gastrine I humaineMerckG9145
Microtubes de 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
Tampon de lyse des globules rouges 1XThermo Fisher Scientific00-4333-57
Fioles cryogéniques à filetage interne de 2,0 mlNest607001
A8301 (inhibiteur TGFb)Tocris Bioscience2939
Anticorps polyclonal AFPProteintech14550-1-AP
Anticorps anti-albumine [ALB/2144]Abcamab236492
Anticorps anti-HNF-4-alpha [EPR16885] - Grade ChIPAbcamab181604
Anticorps anti-préalbumine [EPR3219]Abcamab92469
Anticorps anti-SOX9 [EPR14335-78]Abcamab185966
Supplément de B27 (503), sans vitamine AThermo Fisher Scientific12587010
Solution de récupération cellulaire, 100 mLCorning354253Réactif utilisé pour dissoudre la matrice membranaire basale et récupérer les organoïdes avant le replacage ou le traitement en aval
CellTiter-Glo® ;   ; Test de viabilité des cellules 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothèque & Kit de billes en gel v3.1Génomique 10xCG000227
Passoire cellulaire de Corning, 40 et mu ; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Costar Lisière à fond plat transparent à 24 puits ultra-bas et attachement multiple, enveloppées individuellement, stérilesCorning3473
Cultrex Facteur de croissance réduit (EMB), Type 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Matrice extracellulaire utilisée pour soutenir la culture organoïde tridimensionnelle et la formation de dômes
DMSOMerckC6164Solvant utilisé pour préparer des solutions de stockage de médicaments et le contrôle des véhicules
Eagle Medium modifié de Dulbecco/F-12 de HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 avancé
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inhibiteur de la tyrosine kinase utilisé pour le traitement organoïde et la perturbation thérapeutique
FBS de la valeur du sérum bovin fœtalGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
Supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosineBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscope motorisé à fluorescence Leica DM6 BLeicaN/A
Supplément N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acétylcystéineMerckA0737-5MG
NicotinamideMerckN0636
Tubes centrifugeurs stériles en polypropylène conique Nunc 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Solution physiologique tamponnée au phosphateGENOM BIOGNM20012Tampon utilisé pour le lavage des organoïdes et la préparation des échantillons pour le traitement en aval
EGF humain recombinantPeprotechAF-100-15
FGF10 humain recombinantPeprotech100-26
HFF humaine recombinantePeprotech100-39
Noggin humain recombinantPeprotech120-10C
Inhibiteur de la rho kinase Y-27632 dihydrochlorureMerckY0503Inhibiteur de ROCK utilisé pour améliorer la survie des organoïdes après dégel ou passage
Milieu conditionné R-spodin1(Broutier et al.)N/ASécrétion des lignées cellulaires
Trypan Blue Stain, filtré à 0,4 % par membrane Préparé dans une saline à 0,85 %Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), sans phénol rougeThermo Fisher Scientific12604013Substitut à la trypsine
Milieu conditionné Wnt-3a(Broutier et al.)N/ASécrétion des lignées cellulaires

Références

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