Extraction d’ADN de colonne à débit moyen utilisant des racks à 24 puits

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rentable pour accélérer l’extraction d’ADN plasmidique. En utilisant des racks personnalisés imprimés en 3D compatibles avec des rotors à plaques à godets pivotants standards, les chercheurs peuvent traiter jusqu’à 48 colonnes de rotation avec des capuchons ou jusqu’à 116 colonnes de rotation sans capuchons simultanément, réduisant significativement le temps de manipulation par rapport aux méthodes manuelles de microcentrifugeuse.

Résumé

L’extraction par colonne spin-membrane siliceuse est la norme pour une purification d’ADN de haute qualité, mais elle est laborieuse et difficile à mettre manuellement à l’échelle au-delà de petits lots. Les robots automatisés de gestion des liquides existants restent souvent trop coûteux pour les laboratoires de petite et moyenne taille. Cet article présente une approche semi-automatisée et rationalisée utilisant des racks imprimés en 3D conçus sur mesure qui s’adaptent aux rotors de plaques de centrifugation standard.

Le système suggéré permet le traitement parallèle de jusqu’à 116 colonnes de spin commerciales standard. La conception en rack permet une configuration « imbriquée », permettant une clarification simultanée des lysats (via des colonnes de filtration) et une liaison de l’ADN (via des colonnes de silice) en une seule étape de centrifugation. De plus, la conception intègre un réservoir partagé de déchets, éliminant ainsi la nécessité de rejeter le flux de débouché des tubes individuels lors des étapes de lavage.

Cette méthode permet d’obtenir un rendement et une pureté de l’ADN comparables aux protocoles manuels standards, mais réduit le temps total de traitement d’environ 50 à 70 % pour les lots d’échantillons supérieurs à 24 (60 à 90 minutes au lieu de 120 à 180 minutes). Le temps total requis pour les étapes incluant la filtration par lysat, les lavages et le rejet des déchets est réduit de 5 à 10 minutes, quel que soit le nombre d’échantillons traités. Cette approche matérielle open source fait le lien entre les mini-préparations manuelles et l’automatisation coûteuse.

Introduction

L’isolement des acides nucléiques à l’aide de matrices de silice a été élucidé pour la première fois en 1979 par Vogelstein et Gillespie, qui ont établi le principe fondamental d’adsorbation des fragments d’ADN en poudre de verre en présence de fortes concentrations de sels chaotropes, en particulier d’iodure de^{sodium 1}. Cette avancée a offert une alternative plus sûre et plus efficace aux méthodes toxiques d’extraction phénol-chloroforme et aux laborieuses méthodes d’ultracentrifugation au gradient de chlorure de césium qui dominaient l’époque. Par la suite, Boom et ses coauteurs ont considérablement optimisé cette méthodologie en introduisant le thiocyanate de guanidinium (GuSCN) comme principal agent^{chaotrope 2}. Cette innovation a été déterminante, car le GuSCN agit simultanément comme un puissant dénaturant protéique pour la lyse cellulaire et comme un inhibiteur puissant des RNases et DNases, préservant ainsi l’intégrité des acides nucléiques lors des phases initiales d’extraction.

Depuis sa création, cette technologie d’extraction en phase solide — largement appelée la « méthode Boom » — a subi un affinage approfondi. Il a été adapté pour isoler des acides nucléiques issus de matrices biologiques de plus en plus complexes, allant du plasmide^{bactérien 3} et de l’ADN^{génomique 4} à l’ADN mitochondrial eucaryote⁵ et à l’ADN génomique de poids moléculaire élevé. De plus, la technologie a été adaptée à des applications cliniques et médico-légales, notamment l’isolement de l’ADN circulant libre de cellules à partir du^{plasma 6}, l’extraction d’ADN végétal récalcitrant et d’ARN riche en^{polyphénols 7}, ainsi que la purification des acides nucléiques^{viraux 8}. De nombreux kits commerciaux utilisant des colonnes tournantes sont également disponibles.

Le mécanisme physicochimique sous-jacent à ce processus repose sur la perturbation de la structure de l’eau par des ions chaotropes. En présence d’une forte force ionique et d’un pH faible, les coques d’hydratation entourant à la fois la colonne vertébrale de phosphate d’acide nucléique et la surface de la silice sont retirées (déshydratation). Cela facilite la formation de ponts cationiques — généralement médiés par des cations Na⁺ ou chaotropes — entre les groupes silanol chargés négativement à la surface de la silice et les groupes phosphates de l’acide nucléique. La sélectivité concernant le type d’acide nucléique (ADN vs. ARN) et la longueur des fragments est obtenue grâce à la modulation précise de la chimie tampon. Par exemple, des concentrations spécifiques de sels et des niveaux de pH peuvent favoriser la liaison de longs brins génomiques plutôt que de courts oligonucléotides, ou différencier l’ARN de l’ADN. De plus, les itérations modernes de cette technologie utilisent souvent des surfaces de silice modifiées pour améliorer les isothermes d’adsorption différentiel de certaines espèces d’acides nucléiques.

Le flux de travail canonique pour la purification des acides nucléiques à base de silice se déroule à travers quatre phases distinctes : (1) la lyse, où la matière biologique de départ est homogénéisée et les structures cellulaires sont désintégrées, souvent à l’aide de conditions alcalines ou de détergents (SDS/Triton) ; (2) Clarification, où les débris cellulaires, les protéines précipitées et les polysaccharides sont retirés pour éviter l’obstruction de la colonne ; (3) Liaison, où le surnageant est ajusté avec des sels chaotropes et de l’éthanol pour favoriser l’adsorption à la membrane siliceuse ; et (4) Lavage, où les acides nucléiques liés à la membrane sont rincés avec des tampons à base d’alcool pour éliminer les sels résiduels et les inhibiteurs avant l’élution dans un tampon à faible force ionique.

Bien que la chimie de ce procédé soit robuste, la manipulation mécanique des colonnes de spin individuelles reste un goulot d’étranglement important pour les flux de travail à débit moyen (24 à 100 échantillons), créant un écart entre le traitement manuel et les systèmes automatisés de manipulation des liquides coûteux. Les approches existantes pour simplifier l’extraction manuelle des acides nucléiques à colonnes incluent les collecteurs à vide et les postes de travail robotisés pour la purification^automatisée 9,10,11,12.

Les collecteurs à vide sont généralement disponibles soit en configuration à accès aléatoire équipés de 20 à 24 adaptateurs Luer pour colonnes centrifuges, soit dans une conception destinée à une utilisation avec des plaques à 96 puits. Les collecteurs à vide configurés pour 20 à 24 échantillons accélèrent l’étape de lavage de la colonne lors de la purification de l’ADN par rapport à la centrifugation, car ils éliminent la nécessité de retirer les colonnes du rotor. Bien que cette méthode soit pratique, une contamination croisée peut survenir car la pointe de drainage de la colonne touche l’ouverture Luer du collecteur à vide. Si l’ADN d’une colonne pénètre dans l’ouverture de Luer, il peut être transféré à une autre colonne d’échantillon lors d’une utilisation ultérieure de la variété. Pour prévenir la contamination, les fabricants recommandent des accessoires^{supplémentaires 10,13} ; cependant, cela complique l’assemblage de l’installation d’extraction et est souvent omis.

Les collecteurs à vide conçus pour le format à 96 puits présentent une construction différente et ne sont pas destinés aux colonnes de microcentrifuge mais aux plaques d’extraction d’ADN compatibles à 96 puits, dans lesquelles les puits contiennent une membrane silice. Dans ce cas, l’extraction de l’ADN est réalisée à l’aide de kits d’isolation ADN préemballés au format^{96 puits 14}. Ces kits offrent un haut débit mais leur applicabilité est limitée, car traiter moins de 96 échantillons est souvent peu pratique.

Les postes de travail robotiques automatisés pour l’extraction d’acides nucléiques sont sans aucun doute la méthode la plus pratique pour la purification de l’ADN, car ils nécessitent une implication minimale de l’opérateur, ce qui permet de gagner du temps aux chercheurs et de minimiser les facteurs stochastiques tels que la contamination. Malheureusement, la plupart des stations d’extraction manquent d’universalité et fonctionnent exclusivement avec des kits dédiés. Ces postes de travail sont principalement utilisés dans les laboratoires de diagnostic, mais ils ne sont pas rentables pour la plupart des laboratoires académiques de petite à moyenne taille.

Ainsi, il existe une lacune dans la pratique en laboratoire pour les méthodes d’extraction d’ADN à débit moyen capables de traiter entre 12 et 96 échantillons en moins d’une heure. Nous présentons un rack à 24 puits qui permet l’isolement manuel de jusqu’à 48 échantillons à l’aide de colonnes de spin à plafonnement et jusqu’à 116 échantillons à l’aide de colonnes de spin non capuchées. Une centrifugeuse avec un rotor à plaque à seau pivotant et une microcentrifugeuse à angle fixe sont utilisées comme équipements supplémentaires. La procédure de purification de l’ADN plasmidique est présentée comme un exemple d’utilisation de racks à 24 puits, puisque l’isolement de l’ADN plasmidique inclut une étape de clarification pour éliminer les débris des cellules lysées, ce qui rend le processus difficile à automatiser. Néanmoins, ces supports peuvent être utilisés pour pratiquement toutes les méthodes d’extraction d’acides nucléiques en colonne.

Protocole

1. Préparation d’équipements imprimés en 3D

1. Imprimez le rack à l’aide d’une imprimante 3D à filament fondu avec une buse de 0,4 mm. Utilisez du filament générique en PLA, PETG ou ABS avec 100 % de remplissage. Réglez la hauteur de couche à 0,1 mm et activez le lissage de surface. Ajustez les réglages d’impression pour garantir l’étanche et la stabilité mécanique.
   REMARQUE : Les fichiers STL pour les composants de rack sont fournis dans le fichier supplémentaire 1. Suivez les paramètres d’impression spécifiés pour le réservoir de base. Testez le réservoir avant utilisation en le remplissant à 70 % d’éthanol et en centrifugant pendant des périodes croissantes (1, 2, 5, 10 et 30 minutes) afin de confirmer l’absence de fuite ou de dommage structurel.
2. Collez ensemble les composants du réservoir de base pour former une unité scellée.

2. Culture bactérienne et lyse

1. Inoculez les transformants d’E. coli dans 3 à 5 mL de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Incubez toute la nuit (12–16 h) à 37 °C avec des secousses.
2. Prélève les cellules par centrifugation à 2 000 × g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.
   REMARQUE : Les granulés cellulaires peuvent être stockés à −20 °C avant le traitement.
3. Ajoutez 250 μL de tampon de resuspension (tampon P1 avec RNase A) au pellet. Resuspendez complètement par vortex ou pipette.
4. Ajoutez 250 μL de tampon de lyse (tampon P2). Mélangez en inversant doucement le tube 4 à 6 fois.
   REMARQUE : Évitez le mélange vigoureux pour éviter le cisaillement de l’ADN génomique.
5. Ajoutez 350 μL de tampon de neutralisation (tampon N3). Mélangez immédiatement soigneusement par inversion.
   REMARQUE : Un précipité blanc doit se former, indiquant une neutralisation réussie.

3. Assemblage de l’unité de filtration

1. Placez les colonnes de liaison de l’ADN dans la couche porte-colonnes du rack.
2. Placez les couvercles des colonnes dans des fentes désignées pour les sécuriser pendant la centrifugation.
3. Placez les colonnes de clarification/filtre dans la couche de colonnes de filtres directement au-dessus des colonnes de liaison.
   REMARQUE : Si les colonnes filtrantes ne sont pas disponibles, centrifugez le lysat dans des microtubes et transférez le surnageant vers les colonnes de liaison.

4. Clairpage du lysat et liaison ADN

1. Transférez le lysat neutralisé de l’étape 2.5 dans les colonnes de filtration.
2. Placez la crémaillère montée dans un rotor à plaque à godet basculant.
   ATTENTION : Assurez-vous d’un bon équilibrage en utilisant un porte-contrepoids de masse égale et de configuration identique.
3. Centrifugez à 2 000 × g pendant 1 minute à température ambiante.
4. Retirez la grille de la centrifugeuse.
5. Retirez et jetez la couche de colonne de filtres.

5. Lessive

1. Rejetez le flux du réservoir dans un contenant à déchets. Remontez le rack avec des colonnes de reliaison.
2. Ajoutez 500 à 700 μL de tampon de lavage à chaque colonne de liaison à l’aide d’une pipette multicanal.
3. Centrifugez à 2 000 × g pendant 1 minute.
4. Éliminez le flux d’eau du réservoir.
5. Répétez le lavage en ajoutant un tampon de lavage à chaque colonne et en centrifugant à 2 000 × g pendant 1 minute.
   REMARQUE : Les colonnes peuvent être stockées à température ambiante ou à 4 °C après lavage.

6. Séchage et élution

1. Retirez les colonnes de liaison du rack et transférez-les dans des tubes de collecte de 2 mL.
2. Centrifugez à >10 000 × g pendant 1 minute pour sécher la membrane.
3. Transférez les colonnes vers des tubes propres de 1,5 mL.
4. Ajoutez 50 μL de tampon d’élution ou d’eau directement à la membrane. Incubez pendant 1 minute à température ambiante.
5. Centrifugez à >10 000 × g pendant 1 minute pour éluer l’ADN.

7. Optionnel : co-précipitation avec du dioxyde de titane

1. Mélangez le tampon de lyse avec de la poudre de dioxyde de titane dans un rapport volume/masse de 2:1.
2. Ajoutez 250 μL de suspension au dioxyde de titane au lysat. Mélange par inversion.
3. Ajoutez 350 μL de tampon de neutralisation et mélangez soigneusement.
4. Centrifugez à 2 000 × g pendant 1 minute.
5. Collectez le surnageant sans déranger le précipité.
6. Transférez le surnageant dans la colonne de liaison.

Résultats

Variantes de la crémaillère
Nous avons développé quatre versions de racks adaptées à une large gamme de modèles de centrifugeuses, permettant d’utiliser les ressources disponibles dans différents environnements de laboratoire et de répondre aux préférences des utilisateurs. Tous les racks disposent d’un format à 24 puits mais, selon la version, incluent des positions de sièges supplémentaires pour les colonnes. Les dimensions détaillées et la compatibilité sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 2. Une image haute résolution du rack assemblé est fournie dans la Figure Supplémentaire S1.

La version basique en rack (Figure 1) est la configuration la plus productive. Il se compose de quatre parties et a des dimensions de 88 × 130 × 77 mm. Il permet l’utilisation simultanée de jusqu’à 48 colonnes avec des majuscules ou jusqu’à 116 colonnes avec des majuscules. Les composants du rack sont conçus pour faciliter l’utilisation et minimiser les effets indésirables lors de la centrifugation. Les colonnes de spin sont placées dans la couche de colonnes, qui possède des rainures pour insérer les capuchons ; Ces mêmes rainures peuvent aussi accueillir des colonnes sans capuchons. La couche de colonnes repose sur le réservoir. L’ouverture de drainage des colonnes est placée au-dessus de la découpe du réservoir, ce qui aide à réduire les éclaboussures entre les colonnes adjacentes. Le liquide s’écoule par une ouverture au fond de la découpe dans le réservoir. La capacité du réservoir est d’environ 100 mL, permettant deux étapes de lavage avec une charge de colonne élevée. La couche de colonnes de filtre peut être placée au-dessus de la couche de colonnes lorsque nécessaire, avec les colonnes de filtre placées au-dessus et en contact avec les colonnes de liaison. Le capuchon scelle la couche contenant le filtre ou les colonnes de liaison, limitant ainsi le flux d’air lors de la rotation de la centrifugeuse. La version basique à crémaillère est compatible avec les rotors à godets A-2-DWP (par exemple, Eppendorf 5804), rotor 1770 (par exemple, HETTICH Rotina 380), ou des systèmes équivalents.

La version mini rack (Figure 2) convient à une large gamme de rotors à godets centrifugeuses. Il se compose de trois parties et a des dimensions minimales de 82,5 × 128 × 58 mm (avec la couche de colonne de filtres). Il permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes avec majuscules ou jusqu’à 90 colonnes sans majuscules. La géométrie de cette version est similaire à celle de la crémaillère de base, mais les rangées extérieures de positions des colonnes sont supprimées et remplacées par des rainures pour les capuchons des colonnes. La capacité du réservoir varie selon la version imprimée. Le plus petit réservoir (20 mL) peut accueillir une étape de lavage pour environ 30 colonnes ; Des réservoirs plus grands permettent un débit plus élevé. La couche de colonne filtrante présente des bords arrondis pour permettre le mouvement du godet rotor dans les centrifugeuses plus petites. La version mini rack est compatible avec les rotors à godets UC-124 (par exemple, Accumax iFuge UC02) ou des systèmes équivalents. Lorsqu’il est utilisé sans la couche de colonne filtrante, le rack est compatible avec les rotors à godets A-2-MTP (par exemple, Eppendorf 5430) ou leurs équivalents.

La version sans réservoir (non couverte) (Figure 3) convient aux utilisateurs ayant une expérience limitée de l’impression 3D, car le réservoir est remplacé par un récipient externe tel qu’une boîte à pointe de pipette. Cette version se compose de trois parties et mesure 79 × 115 × 61,5 mm. Il permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes avec des majuscules ou jusqu’à 78 colonnes sans capuchons. La géométrie est similaire à celle des versions précédentes mais ne comporte pas de réservoir intégré. À la place, un contenant approprié est utilisé pour la collecte des déchets. Les couches de colonnes et de filtres ont moins de positions d’assis, et la couche filtrante comprend des sièges coniques pour éviter toute interférence avec le mouvement du rotor. La base est conçue pour s’adapter à des conteneurs standards et peut être stabilisée à l’aide d’entretoises latérales. La compatibilité dépend du conteneur sélectionné mais inclut les rotors à godets A-2-DWP (par exemple, Eppendorf 5804), rotor 1770 (par exemple, HETTICH Rotina 380) et rotors à godets UC-124 (par exemple, Accumax iFuge UC02).

La version à crémaillère de condensateurs (Figure 4) est la configuration la plus simple et est utilisée avec des plaques profondes de 5 mL ou 10 mL à 24 puits profonds. Il se compose d’un seul composant avec des dimensions de 73 × 109 × 4 mm et permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes. Cette version est compatible avec tout rotor de centrifugeuse supportant le format de plaque correspondant.

Rendement et pureté
L’extraction d’ADN a été réalisée sur des cultures d’E. coli en utilisant à la fois le protocole manuel standard de microcentrifugation et la méthode basée sur le rack. L’analyse spectrophotométrique a montré que la qualité de l’ADN extrait à l’aide des racks était comparable à celle obtenue avec la méthode standard. Les rapports typiques A260/A280 variaient entre 1,8 et 1,9 pour les deux approches. Le rendement total des plasmides (μg) n’a montré aucune différence significative entre la méthode conventionnelle et l’extraction utilisant les configurations de crémaillère (Figure 5) ; les données brutes sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 2. La conformation plasmidique a également été préservée, avec des distributions similaires de formes relâchées, linéarisées et super-enroulées (Figure 6).

Analyse de la contamination croisée
Pour évaluer une contamination croisée potentielle, une expérience en damier a été réalisée. Les colonnes étaient chargées alternativement avec une solution de bromure d’ethidium à haute concentration (simulant de l’ADN à haut titre) et de l’eau. Après centrifugation à 2 000 × g, la distribution du colorant était confinée à la zone de déchets directement sous les colonnes chargées, et aucun signal visible n’a été détecté dans les puits adjacents ni sur les extrémités des colonnes voisines (Figure 7). Ces observations indiquent que la conception en crémaillère réduit la probabilité d’éclaboussures et de transfert de colonne transversale dans les conditions testées.

Pour évaluer davantage la contamination, une PCR en temps réel a été réalisée en utilisant un amplicon comme agent contaminant (voir Fichier Supplémentaire 2). L’amplification n’a été détectée que dans des éluates provenant des colonnes auxquelles l’amplicon avait été ajouté (Figure 8). Dans les conditions testées, aucune contamination croisée n’a été détectée ; cependant, les performances peuvent varier selon le flux de travail et le type d’échantillon.

Figure 1 : Version de base du schéma d’assemblage de rack. Vue CAO explosée montrant le (A) capuchon, (B) la couche de colonne du filtre, (C) la couche de support de colonne et (D) le réservoir de base. Le rack se compose de quatre parties de dimensions de 88 × 130 × 77 mm et permet l’utilisation simultanée de jusqu’à 48 colonnes avec des capuchons ou jusqu’à 116 colonnes sans capuchons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Version miniature du schéma d’assemblage de rack. Vue CAO explosée montrant la couche de colonne du filtre (B), la couche de support de colonne (B) et (C) le réservoir de base. Cette version est géométriquement similaire à la version de base, mais les deux rangées latérales de sièges de colonnes sont retirées et remplacées par des rainures pour les capuchons de colonnes. Il se compose de trois parties, a des dimensions minimales de 82,5 × 128 × 58 mm (avec la couche de colonnes filtrantes), et permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes avec des majuscules ou jusqu’à 90 colonnes sans capsules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Version sans réservoir (non couverte) du schéma d’assemblage de la crémaillère. Vue CAO explosée montrant la couche de colonne de filtre (B), la couche de support de colonne, (C) la base et (D) la boîte à pointe de pipette. Cette version remplace le réservoir intégré par un récipient externe tel qu’une boîte à pointe de pipette. Elle se compose de trois parties, a des dimensions de 79 × 115 × 61,5 mm, et permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes avec des majuscules ou jusqu’à 78 colonnes sans capuchons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Version à condensateur des racks à 24 puits. Vue de dessus (à gauche) et vue du bas (à droite). C’est la version en rack la plus simple, utilisée avec des plaques de 5 mL ou 10 mL à puits profonds à 24 puits. Elle se compose d’une seule pièce de dimensions de 73 × 109 × 4 mm et permet l’utilisation de jusqu’à 48 colonnes avec ou sans capuchons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Comparaison du rendement et de la pureté de l’ADN. Analyse spectrophotométrique du rendement plasmidique (μg/mL). Aucune différence statistiquement significative dans le rendement total des plasmides n’a été observée entre la méthode conventionnelle et l’extraction utilisant les configurations de rack. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Comparaison de la qualité de l’ADN. Les formes d’ADN ont été visualisées par électrophorèse sur gel d’agarose. Les formes détendue, linéarisée et super-enroulée de l’ADN sont similaires entre l’extraction manuelle standard et l’extraction sur rack. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Évaluation de la contamination croisée. Vue du réservoir de déchets après centrifugation, montrant des bassins de déchets distincts sans chevauchement. Les colonnes étaient chargées d’une solution de bromure d’ethidium à haute concentration (simulant de l’ADN à haut titre) et d’eau. Aucun colorant n’a été observé dans les puits « d’eau » adjacents ni sur les extrémités des colonnes voisines après centrifugation, ce qui indique une réduction des éclaboussures et du transfert entre colonnes dans les conditions testées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Analyse de la contamination croisée à l’aide de la PCR quantitative. Les courbes d’amplification des échantillons contenant l’agent contaminant sont indiquées en rouge, tandis que celles contenant uniquement de l’eau sont indiquées en vert. L’amplification n’a été détectée que dans des échantillons contenant l’agent contaminant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Fichiers de modèles 3D pour les conceptions de racks. Cet ensemble de fichiers contient des fichiers STL pour toutes les configurations de rack, y compris la version base en rack, la version mini rack (avec plusieurs variantes de hauteur de réservoir), la version sans réservoir, et la version à support de condensateurs. Des composants individuels (par exemple, réservoir de base, couche de support de colonne, couche de colonne de filtre et capuchon) sont fournis pour l’impression 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Données et méthodes de soutien. Cet ensemble de fichiers contient la table de compatibilité des centrifugeuses, la procédure détaillée de test de contamination croisée, les ensembles de données de rendement ADN brut et les fichiers de sortie des instruments PCR associés à l’analyse de contamination. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1 : Version basique en rack (entièrement assemblée). Image haute résolution de la configuration de base du rack entièrement assemblée, illustrant la structure générale et l’agencement des composants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole répond à l'« écart de débit » dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. Bien que les plaques filtrantes à 96 puits soient plus rapides, elles peuvent présenter des capacités de liaison plus faibles ou des concentrations finales réduites comparées aux colonnes de spin^{individuelles 14}. En adaptant les colonnes de rotation standard à un format rotor-plaque, cette méthode combine le haut rendement des colonnes avec la rapidité des flux de travail basés sur plaques.

Les racks sont les plus avantageux lors du traitement de plus de 12 échantillons. La principale innovation du protocole est l’utilisation de racks à 24 puits, qui simplifient et accélèrent l’extraction d’acides nucléiques à base de colonnes en employant un réservoir partagé pour l’élimination des solutions surnageantes et de lavage. Lors de l’utilisation des racks, le temps nécessaire pour effectuer ces étapes pour 14 à 116 échantillons est comparable à celui requis pour 2 à 12 échantillons. De plus, l’effort de l’opérateur est réduit, car les étapes répétitives telles que le retrait des tubes individuels, le transfert des colonnes, la mise au débarret des solutions de lavage et l’ouverture des bouchons sont minimisées. Parce que les composants originaux du kit (solutions et colonnes de spin) restent inchangés, une qualité d’ADN comparable est attendue et est confirmée par les résultats présentés.

L’impression 3D des racks à 24 puits est possible avec l’équipement standard, mais peut nécessiter de l’expérience pour les versions basique et mini. Les versions sans réservoir et à rack de condensateurs sont plus simples et peuvent être produites avec une expérience d’impression minimale. Un aspect clé dans la modélisation par dépôt fusionné est la formation de micro-espaces entre les couches, ce qui peut compromettre l’étanche à l’eau sous centrifugation. Les tests ont indiqué qu’un remplissage à 100 %, une épaisseur de paroi du réservoir de 7 mm et une hauteur de couche de 0,1 mm assurent une étanche suffisante. Le chauffage du plateau d’impression et l’application du lissage de surface amélioraient encore les performances d’étanchéité. En revanche, les méthodes de scellement post-impression utilisant des résines époxy ou des solvants organiques n’étaient pas efficaces, car la déformation lors de la centrifugation entraînait fissures et fuites. Une épaisseur de paroi insuffisante peut également entraîner une défaillance structurelle et une perte d’étanche, pouvant entraîner un déséquilibre des centrifugeuses. Par conséquent, il est recommandé de tester avant utilisation des composants imprimés.

Les versions à quatre crémaillères conviennent à une large gamme de centrifugeuses à rotors à godet, permettant aux utilisateurs de choisir la configuration qui correspond le mieux à leurs besoins en équipement et en débit. La version basique en rack offre le débit le plus élevé mais nécessite des centrifugeuses plus grandes et une meilleure qualité d’impression. La version mini réduit les besoins en taille de centrifugeuse mais réduit aussi le débit. La version sans réservoir simplifie la fabrication et est compatible avec les contenants couramment disponibles tels que les boîtes à pointes de pipette, bien que la compatibilité dépende de la géométrie du contenant. La version cap-rack est la configuration la plus simple mais ne peut pas être utilisée avec des colonnes de filtres.

Les colonnes filtres qui ne lient pas les acides nucléiques peuvent être moins facilement disponibles que les colonnes de liaison^{standard 9}. En leur absence, des étapes supplémentaires de clarification peuvent être nécessaires, augmentant ainsi le temps global de traitement. Sinon, on peut utiliser des pointes de pipette filtrant (1000 μL) ou le protocole au dioxyde de titane.

Les racks d’extraction fonctionnent comme un complément mécanique aux flux de travail d’extraction ADN^{standard 9} et ne modifient pas la composition du tampon ni la chimie des colonnes (sauf dans la variante au dioxyde de titane). Par conséquent, aucun impact substantiel sur la qualité de l’ADN n’est attendu, ce qui est cohérent avec l’électrophorèse en gel d’agarose et permet de comparer des formes plasmidiques et des quantités similaires par rapport à la méthode standard.

Bien que l’utilisation d’un réservoir partagé de déchets introduise un risque potentiel de contamination croisée, cela n’a pas été observé dans les conditions testées. Une caractéristique clé de conception est la géométrie « cheminée » des sorties de colonnes, qui maintient la séparation entre les extrémités de la colonne et la surface du liquide résidu. Pour préserver cette séparation, le réservoir ne doit pas être surchargé, et il est recommandé de vider après chaque écoulement complet.

Une limitation de la méthode est la vitesse maximale des rotors à godet oscillant (généralement 2 000 × g). Bien que suffisante pour les étapes de liaison et de lavage, cette vitesse n’est pas suffisante pour un séchage complet de membrane. Par conséquent, une dernière étape de centrifugation à grande vitesse dans une microcentrifugeuse à angle fixe est nécessaire. Malgré cette étape supplémentaire, les gains de temps globaux restent importants pour les lots dépassant 24 échantillons.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	PETG ou PLA recommandé
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Rotor à angle fixe
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Plateau rotor à cuvettes oscillantes
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Fait partie des Colonnes de filtration
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Fait partie des Colonnes de filtration
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065