Une plateforme d’électroporation microfluidique numérique pour l’édition génomique CRISPR à faible entrée et la transfection d’ARNm dans des cellules T en suspension et des modèles de cellules 3D

Résumé

Ce protocole décrit l’édition miniaturisée du génome CRISPR–Cas9 du récepteur TCRα/β dans les lymphocytes T humains primaires à l’aide de la « DMF-ection », une plateforme d’électroporation microfluidique numérique (DMF). La méthode permet une édition génétique parallèle, à faible entrée et avec une viabilité élevée, et est également adaptable pour la délivrance d’ARNm dans des sphéroïdes 3D multicellulaires.

Résumé

L’électroporation microfluidique numérique (DMF) permet une manipulation génétique précise et à faible volume des cellules de mammifères tout en minimisant l’apport cellulaire jusqu’à 100 fois et en préservant la viabilité. Cette étude présente un flux de travail de transfection à haut débit basé sur DMF pour l’élimination médiée par CRISPR du locus TRAC dans les lymphocytes T en suspension humaine primaire et pour la transfection d’ARNm de sphéroïdes HEK293T tridimensionnels. Grâce à des ARN guides CRISPR déposés spatialement et à l’assemblage de ribonucléoprotéines (RNP) sur cartouche, une perturbation efficace du locus TRAC a été obtenue dans les populations de lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ en utilisant seulement 10 000 cellules par condition, avec des viabilités post-édition dépassant 85 %. La caractérisation biophysique utilisant des analyses induites par flux et dispersion de Taylor a révélé que les additifs polymères stabilisent les complexes Cas9–sgRNA dans des conditions de tampon d’électroporation, permettant un montage reproductible à des volumes submicrolitres. Le flux de travail a été adapté aux applications 3D en délivrant de l’ARNm d’EGFP dans des sphéroïdes HEK293T intacts, ce qui a permis une fluorescence robuste et spatialement uniforme sans nuire à la croissance ou à la morphologie des sphéroïdes. Ensemble, ces résultats démontrent que l’électroporation du DMF permet une édition efficace du génome et la délivrance d’ARNm à travers les cellules immunitaires en suspension et les sphéroïdes multicellulaires. Cette plateforme offre une solution évolutive et à faible consommation d’entrées pour des applications en thérapie par cellules CAR-T, génomique fonctionnelle et modèles cellulaires 3D avancés.

Introduction

L’édition génétique dans les cellules humaines primaires est de plus en plus centrale tant dans le développement thérapeutique que dans la recherche fondamentale, y compris dans les applications en immuno-ingénierie, modélisation des maladies rares et génomique^{fonctionnelle.} Bien que l’électroporation permette une édition génomique très efficace, les systèmes conventionnels basés sur des cuvettes nécessitent généralement jusqu’à des millions de cellules par condition, limitant leur utilisation pour les échantillons dérivés du patient et les populations immunitaires^{rares 2}. De plus, ces systèmes sont peu adaptés au criblage à grande échelle en raison des limitations de débit, d’automatisation et de consommation de^{réactifs 3}.

L’électroporation microfluidique est apparue comme une approche prometteuse pour l’édition génomique à faible entrée⁴. Cependant, la plupart des plateformes existantes reposent sur des architectures à flux continu impliquant une manipulation complexe des fluides, une flexibilité limitée dans le mélange des réactifs et des exigences relativement élevées en cellules par condition. En revanche, la microfluidique numérique (DMF) permet la manipulation active de gouttelettes discrètes à l’échelle du nanolitres sur un réseau d’électrodes planes, permettant un contrôle précis de la composition de la réaction, du timing et de la localisation spatiale. Ce format plug-and-play basé sur des gouttelettes convient parfaitement aux flux de travail à faible volume et à haut débit où la conservation des cellules primaires et des réactifs est^{essentielle 5}.

Des travaux récents ont démontré la faisabilité de la livraison intracellulaire basée sur le DMF en utilisant des architectures d’électroporation tri-gouttelettes qui génèrent des champs électriques localisés à faible courant pour une livraison efficace de RNP et d’ARNm tout en minimisant les contraintes thermiques et électrochimiques ^6,7,8. S’appuyant sur cette base, une plateforme d’électroporation DMF de nouvelle génération, appelée « DMF-ection », comprenant 48 sites de réaction adressables de façon indépendante, une compatibilité complète en automatisation et une fabrication de cartouches^{évolutive 9} (Figure 1) a été développée. La cartouche DMF se compose d’une plaque PCB inférieure et d’une plaque supérieure en plastique séparées par un joint, assemblées par des boutons d’alignement dans une seule orientation correcte (Figure 1A). La disposition 48-plex est organisée en huit familles identiques (Figure 1A–H), chacune contenant six sites d’électroporation adressables indépendamment, supportant jusqu’à 48 conditions d’édition parallèle par cartouche (Figure 1B). Les bibliothèques d’ARN guides sont déposées sur la surface du substrat à l’aide d’un distributeur acoustique avant l’assemblage de la cartouche. La précision positionnelle du dépôt a été confirmée sur les 48 sites, avec des positions de chute se regroupant dans une déviation submillimétrique par rapport au point médian de l’électrode (Figure 1C), soutenant un assemblage RNP fiable sur la cartouche. Après chargement, les cellules et les gouttelettes d’électrodes liquides sont actionnées sur la cartouche pour former la géométrie d’électroporation tri-gouttelettes (Figure 1D). Après l’électroporation, les cellules sont déchargées dans des plaques de culture pour la récupération et l’analyse en aval, incluant la cytométrie en flux, le séquençage et la microscopie (Figure 1E). Ce système permet une édition génomique à haute efficacité en utilisant jusqu’à 100 fois moins de cellules que les méthodes standard basées sur des cuvettes, élargissant considérablement l’accès à l’ingénierie génomique dans les applications à faible entrée et à haut débit.

Cette étude évalue les performances de la plateforme en livrant plusieurs cargaisons biomoléculaires, y compris des complexes d’ARNm et de ribonucléoprotéines (RNP) CRISPR–Cas9, assurant ainsi une transfection efficace et une perturbation génique. En plus des lymphocytes T primaires, la DMF-ection fournit un cadre généralisable pour délivrer des acides nucléiques dans des structures multicellulaires complexes. Les sphéroïdes tridimensionnels (3D) et les modèles organoïdes imposent des barrières importantes à la pénétration des réactifs en raison de leur architecture et de leur fragilité, et les approches conventionnelles d’électroporation perturbent souvent la morphologie ou génèrent une livraison hétérogène. Pour évaluer si les mêmes principes miniaturisés d’électroporation utilisés pour l’édition des lymphocytes T s’étendent aux tissus structurés, le flux de travail DMF a été appliqué aux sphéroïdes HEK293T 3D. Ces expériences ont démontré que l’électromouillage à base de DMF peut positionner doucement les sphéroïdes intacts dans les géométries à trois gouttelettes et soutenir une livraison uniforme de l’ARNm tout en préservant la structure et la croissance. Bien que ces résultats soient en dehors du protocole principal des lymphocytes T décrit ici, ils illustrent l’applicabilité plus large de l’électroporation programmable DMF pour les systèmes cellulaires 3D émergents pertinents pour la découverte de médicaments et la modélisation des maladies.

Protocole

Les lymphocytes T humains primaires utilisés dans ce protocole ont été obtenus auprès de fournisseurs commerciaux sous le consentement éclairé du donneur et conformément aux directives institutionnelles, éthiques et réglementaires applicables. Toute la manipulation des matériaux biologiques d’origine humaine a été réalisée conformément aux protocoles de biosécurité institutionnels. Les chercheurs mettant en œuvre ce protocole sont responsables de s’assurer que leur utilisation des cellules humaines primaires respecte les exigences du comité d’éthique ou du comité d’éthique local, les réglementations applicables sur la biosécurité, ainsi que toute législation nationale ou régionale pertinente régissant l’utilisation du matériel biologique humain. Aucune information identifiable par le patient n’a été associée au matériel cellulaire utilisé dans cette étude.

1. Préparation et activation des lymphocytes T humains primaires

1. La décongélation a rapidement présauvé les cellules T CD3⁺ humaines primaires dans un bain-marie à 37 °C. Transférez les cellules dans un milieu basal préchauffé pour cellules T et centrifugez à 180 × g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu frais.
2. Déterminez la concentration et la viabilité cellulaires à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
3. Resuspendre les cellules à 1 × 10⁶ cellules/mL dans un milieu de culture de lymphocytes T complété par un stimulus activateur des lymphocytes T CD3/CD28 (selon les instructions du fournisseur) et 200 UI/mL d’IL-2. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Maintenir la densité cellulaire entre 0,5 et 2 × 10⁶ cellules/mL pendant l’activation. Effectuer l’activation dans des plaques à 96 puits U-bottom afin d’optimiser l’efficacité du contact cellule-activateur et de l’activation.

2. Préparation des taches d’ARN guide sur le substrat DMF (spotting par distributeur acoustique)

1. Reconstituer l’ARNsg lyophilisé dans de l’eau sans nucléase à une concentration de stock de 100 μM. Dans un tube séparé, préparez un stock de 100 mg/mL d’acide poly-L-glutamique (PGA, sel de sodium, MW 15 000–50 000 Da) dans de l’eau sans nucléase. Combinez le stock de sgRNA et PGA à un rapport volumique de 5:4 (sgRNA : PGA) qui donne une concentration finale de sgRNA de 55,6 pmol/μL et une concentration finale de PGA de 44,4 mg/mL dans de l’eau sans nucléase. Vortex brièvement et centrifugeuse à 1 000 × g pendant 30 s et aliquotes en volumes à usage unique, et stocke les aliquotes inutilisées à −80 °C pendant jusqu’à 6 mois.
   REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
2. Ajouter le mélange guide-PGA à une plaque acoustique à faible volume mort dans des puits correspondant à la disposition souhaitée du site de réaction.
3. Transférez 40 nL (équivalent à 2,2 pmol sgRNA) du mélange guide-PGA à chaque région de spotting cible du substrat DMF à l’aide d’un distributeur acoustique calibré.
   REMARQUE : À 55,6 pmol/μL, 40 nL délivre 2,2 pmol d’ARNsgRNA par site (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Les guides séchés sont reconstitués lors de la fusion des gouttelettes sur la cartouche ; La resuspension complète est confirmée par une efficacité de montage constante sur plusieurs sites.
4. Dans un cabinet de sécurité biologique, laissez les gouttelettes tachetées sécher complètement à l’air à température ambiante jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide visible (environ 5 minutes).
   REMARQUE : N’utilisez pas de flux d’air forcé ni de chaleur, car cela pourrait déloger ou dégrader l’ARN guide.
5. Assemblez la cartouche DMF.
   1. Dans une armoire de sécurité biologique, alignez la plaque supérieure sur le substrat tacheté en faisant correspondre les éléments asymétriques de fermeture en plastique de la plaque supérieure avec les encoches sur la plaque inférieure. Appliquez une pression uniforme et simultanée le long des bords courts jusqu’à ce qu’un claquement mécanique distinct soit ressenti, confirmant l’engagement complet des blocages.
      REMARQUE : La cartouche est conçue avec une seule orientation correcte ; un assemblage incorrect ne produira pas le snap. Maintenez les substrats par les bords en permanence pour éviter toute contamination ou endommagement des surfaces fonctionnelles et évitez que les substrats ne glissent les uns contre les autres, car cela pourrait rayer les revêtements de surface.
   2. Point de contrôle : Confirmez l’assemblage correct par le clic mécanique.
      REMARQUE : Il n’existe pas d’indicateur électrique pré-run de l’intégrité du revêtement ; toute défaillance fonctionnelle résultant d’un assemblage incorrect est détectée automatiquement et rapportée dans le rapport QC post-exécution.
      Point de pause : Conservez les cartouches assemblées inutilisées dans un emballage scellé avec un dessiccant (sachets de gel de silice) à température ambiante pendant jusqu’à 48 heures.

3. Préparation des cellules

1. Préparez 1 mL de tampon de transfection complet avant chaque utilisation en combinant un tampon d’électroporation compatible DMF avec le tensioactif biocompatible non ionique fourni à un rapport 20:1 (v/v) (tampon d’électroporation : tensioactif), obtenant une concentration finale de tensioactif de 0,05 % (v/v). Mélangez doucement et laissez sur la glace.
   REMARQUE : Le tampon de transfection compatible DMF utilisé ici est un tampon isotonique à faible conductivité (conductivité : 3,5 mS/cm, osmolalité : 305 mOsm/L). Les chercheurs utilisant des tampons alternatifs devraient vérifier la compatibilité avec l’activation du DMF et la viabilité cellulaire. Le tensioactif non ionique biocompatible sert à réduire l’épinglement des gouttelettes ; si le tensioactif fourni n’est pas utilisé, un substitut approprié.
2. Laver les lymphocytes T activés une fois avec un tampon de transfection (sans tensioactif). Centrifugez à 180 × g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans un tampon de transfection complète (contenant du tensioactif) à 1,0 × 10⁷ cellules/mL dans un volume total de 100 μL par cartouche. Reste sur la glace.
3. Juste avant de charger sur la cartouche, ajouter directement la nucléase Cas9 aux 100 μL de suspension des lymphocytes T et mélanger par pipetage doux ; Reste sur la glace.
   REMARQUE : Pour les cellules T primaires, Cas9 est chargé à 42 pmol par volume de cartouche de 100 μL (0,42 pmol/μL). Chaque site d’électroporation traite environ 1 μL de suspension cellulaire, délivrant 0,42 pmol Cas9 par montage. Optimisez cette dose lors de l’adaptation à d’autres types de cellules immunitaires (voir Tableau 1).

Composant	Concentration finale par édition
Cas9	0,42 pmol dans ~1 μL de gouttelette
sgRNA	2,1 pmol (depuis le poste de 40 nL)
PGA	44,4 mg/mL de bouillon dans un mélange de taches
Tensioactif	0,05 % (v/v)
Entrée cellule	~10 000 cellules

Tableau 1 : Tableau sommaire des concentrations finales dans chaque gouttelette de transfection.

4. Transfection sur la plateforme DMF-ection

1. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 10 μL du mélange T-cell/Cas9 dans chacun des 8 ports de chargement des cellules, et 10 μL de tampon de transfection complet dans les 16 ports de charge d’électrodes liquides (comme illustré à la Figure 1).
2. Réglez la tension à 500 V, la durée de l’impulsion à 3 ms, et le nombre d’impulsions à 2. Initiez la séquence d’électroporation selon les instructions de la plateforme.
   1. Point de contrôle : Révisez le rapport de contrôle qualité post-course immédiatement après la course. Les défaillances sporadiques (<10 % des sites) ne nécessitent aucune intervention. Si les pannes sont systématiques, remplacez la cartouche par la carte QC fournie, effectuez le contrôle de santé système (~2 min) et contactez le support technique si les problèmes persistent.

5. Déchargement et récupération des lymphocytes T modifiées

1. À l’aide d’un manipulateur de liquides, transférez les cellules électroporées de chaque site de réaction dans une plaque U-bottom de 96 puits contenant 150 μL de milieu basal préchauffé pour cellules T complétées par 200 IU/mL d’IL-2.
2. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂ pour permettre le renouvellement des protéines et les changements d’expression des récepteurs à la surface.

6. Analyse par cytométrie en flux du knockout TRAC

1. Transférez les cellules vers une plaque inférieure conique stérile à 96 puits pour réduire la perte cellulaire entre les lavages. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de cytométrie en flux (1× PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) en centrifugant à 400 × g pendant 5 minutes et en retirant le surnageant en inversant doucement la plaque inférieure conique. Les cellules restent en granule dans la plaque.
2. Préparez un mélange maître de coloration de surface contenant des anticorps anti-CD4, anti-CD8 et anti-TCRα/β dans un tampon de cytométrie en flux aux concentrations recommandées par le fabricant. Ajoutez 25 μL de mélange maître par puits et faites éclore pendant 20 minutes à 4 °C protégé de la lumière. Lavez deux fois avec 1× PBS (sans FBS) en centrifugeant à 400 × g pendant 5 minutes. Resuspendez les cellules dans 100 μL de 1× PBS contenant un colorant de viabilité à 1:1 000 (v/v) et incubez pendant 10 minutes à température ambiante protégée de la lumière.
   REMARQUE : Les plaques coniques inférieures sont efficaces pour pelleter les cellules ; Vérifiez que les cellules sont bien resuspendues à toutes les étapes.
3. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de cytométrie en flux et resuspendez dans 150 à 200 μL par échantillon pour l’acquisition.
4. Configurez le cytomètre avec des lignes laser appropriées et des ensembles de filtres pour les fluorochromes utilisés (par exemple, excitation à 488 nm pour le colorant de viabilité ; 405 nm ou 488 nm pour les marqueurs de surface selon le cas). Régler les tensions à l’aide de contrôles de compensation à une seule teinture et d’un échantillon non coloré. Collectez un minimum de 5 000 événements en direct de singlets par échantillon. Porte séquentielle sur : singlets de diffusion → cellules vivantes (colorant de viabilité négatif) → expression de TCRα/β CD4⁺ ou CD8⁺ →.
   REMARQUE : Dans des conditions standard, le total des événements réels acquis peut varier de 5 000 à plus de 10 000 par échantillon après des pertes lors du lavage et de la coloration, étant donné que les cellules ont eu le temps de proliférer.
5. Déterminer la perturbation du gène TRAC en mesurant la fréquence des cellules TCRα/β-négatives dans les populations CD4⁺ et CD8⁺. Indiquez l’efficacité du knockout en pourcentage de cellules TCRα/β-négatives par rapport à la porte singlet vivante pour chaque sous-ensemble.

Résultats

Résultats attendus
L’électroporation de 10 000 lymphocytes T activés par condition aboutit généralement à une efficacité de knockout TRAC de >85 % avec une viabilité de >95 % 72 h après la transfection. La cytométrie en flux révèle une perte nette de coloration TCRα/β dans la condition de ciblage TRAC par rapport aux contrôles sgARN non ciblants (NTC) et aux contrôles non exposés à des champs électriques. Sauf indication contraire, n représente des exécutions DMF indépendantes effectuées sur des jours différents. Les répliques techniques issues de la même série de cartouche étaient moyennées avant l’analyse statistique et ne contribuent pas indépendamment à n. Toutes les expériences sur les lymphocytes T rapportées ici ont été réalisées avec des cellules cryopréservées provenant d’un seul donneur sain. La variabilité donneur à donneur utilisant la même plateforme est encore^{caractérisée 9}.

Amélioration de la stabilité des ribonucléoprotéines Cas9–sgRNA en conditions d’électroporation grâce aux additifs polymères anioniques
Une exigence fondamentale de conception de la microfluidique numérique est une surface hautement hydrophobe, qui permet aux gouttelettes de glisser librement lors de l’électromouillage. Bien que cette propriété soit essentielle pour le mouvement des gouttelettes et l’actionnement précis, elle pose des défis pour la charge des réactifs. Pour les applications d’écran en tableau, il est crucial que des bibliothèques de charges utiles définies par l’utilisateur puissent être déposées directement sur la surface de la cartouche. Cela permet aux agencements des réactifs de refléter la conception de la bibliothèque de l’utilisateur et garantit que le flux de travail microfluidique numérique peut exécuter sans effort des expériences en réseau sans transfert supplémentaire ni intervention manuelle. La non-dispensation d’un distributeur acoustique par nanolitres convient parfaitement à cette tâche, car elle peut délivrer des volumes de nanolitres avec une grande précision positionnelle à travers de grands réseaux sur diverses surfaces. Cependant, lorsque les gouttelettes frappent une surface hydrophobe de la cartouche, elles rebondissent souvent, perlent ou ne se propagent pas uniformément, ce qui entraîne un dépôt et une récupération incohérents. Cette variabilité est la plus évidente à des volumes intermédiaires de gouttelettes allant de 40 nL à 120 nL (Figure 2A, n = 3 par condition, *** valeur p < 0,01), où l’on suppose que l’énergie cinétique de la gouttelette est suffisamment élevée pour provoquer un rebond, mais que l’adhésion à la surface est insuffisante pour ancrer le liquide. En conséquence, le dépôt direct sur la cartouche à des doses de charge utile plus élevées peut être peu fiable sans modification supplémentaire. Pour atténuer cet effet, des réactifs ont été complétés par le polymère poly-L-glutamique (PGA) biosûr. Le PGA est un polypeptide biodégradable, chargé négativement, largement utilisé comme stabilisateur dans les formulations pharmaceutiques, avec une excellente compatibilité pour les flux de travail de cellules vivantes. On suppose que la colonne vertébrale chargée réduit l’angle de contact des gouttelettes et favorise une propagation plus uniforme, réduisant le rebond et améliorant l’adhérence de surface. Avec la PGA présente, les volumes de fluorescéine déposés étaient linéaires selon l’absorption, et la variance était nettement réduite selon les cartouches. L’analyse statistique a confirmé que la PGA améliorait significativement la reproductibilité à 40, 90 et 120 nL de volumes de spotting (***p < 0,001, ****p < 0,0001), tandis que de très petites gouttelettes (10–20 nL) montraient peu de différence, le rebond étant moins prononcé à basse énergie cinétique.

Ensuite, l’ajout d’additifs polymères utilisés dans le flux de travail DMF a été évalué pour leur influence sur le comportement des ribonucléoprotéines (RNP) Cas9–sgRNA dans les conditions tampons à faible volume utilisées pour l’électroporation. À cette fin, la technologie d’analyse de dispersion induite par l’écoulement (FIDA) a été utilisée. FIDA a été choisi car il fournit une mesure précise en phase de solution du rayon hydrodynamique et de l’affinité de liaison, permettant de quantifier les interactions protéine-acide nucléique sous les mêmes conditions tampons utilisées en contexte expérimental. FIDA a démontré que l’ARNsgNG libre présentait un rayon hydrodynamique (Rh) de 3,45 ± 0,26 nm, cohérent avec une petite espèce d’ARN monobrin. La titrage avec Cas9 a produit un complexe RNP stable avec un Rh de 15,32 ± 0,46 nm et une affinité de liaison sub-nanomolaire (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Figure 2).

Pour évaluer l’effet de la stabilisation par polymère, l’acide poly-L-glutamique (PGA) a été ajouté à l’ARN-guide avant la formation du RNP. La présence de PGA a réduit l’affinité apparente entre Cas9 et sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) et a diminué la taille du complexe à environ 10 nm (Figure 2A , panneau de droite). Bien que la diminution de l’affinité suggère des complexes moins étroitement associés, le_{R h} plus petit et plus uniforme indique que la PGA empêche la formation d’assemblages RNP surdimensionnés (Figure 2B).

Ensuite, la stabilité du RNP a été évaluée sous des conditions d’électroporation à l’aide d’une analyse de dispersion de Taylor (Figure 2C). Sans polymère, les mélanges Cas9–sgRNA produisaient de larges Taylorgrammes mal ajustés, signes d’agrégation (Figure 2B). En revanche, l’ajout de 0,0025 mg/mL de PGA a donné des profils de dispersion monodisperse bien définis (^{R 2} = 0,999) avec_{R h} ~ 9,6 nm. Ces résultats démontrent que la PGA empêche l’agrégation et améliore l’uniformité du RNP, soutenant ainsi une électroporation reproductible à l’échelle des nanolitres. Cette stabilisation fournit une justification mécaniste pour les fortes efficacités d’édition observées dans les expériences en aval sur les cellules T.

Efficacité d’édition dépendante de la dose dans les lymphocytes T primaires

Bien que les expériences FIDA aient indiqué que la PGA réduit l’efficacité de l’assemblage RNP, les résultats de l’édition fonctionnelle ont été supposés être moins affectés, puisque l’électroporation est généralement réalisée avec un excès d’ARN-guide par rapport à Cas9. Ainsi, le volume d’entrée PGA–RNP a été évalué pour son impact sur l’efficacité du knockout dans les lymphocytes T humains primaires au niveau du locus TRAC (Figure 2D). Sur quatre cartouches, l’efficacité de montage était constamment élevée (>75–80 %) aux entrées RNP de 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) et 10 nL (0,53 pmol), avec une variabilité minimale entre les sous-ensembles CD4⁺ et CD8⁺ . Même à 5 nL (0,26 pmol), le montage est resté robuste, bien qu’une réduction modérée ait été observée par rapport à des doses plus élevées. À la dose la plus basse testée (2,5 nL, 0,13 pmol), l’efficacité de montage a considérablement diminué, plafonnant autour de ~60 % de TRAC KO. Les contrôles ont confirmé la spécificité du montage : les puits sans électroporation (0V) et les contrôles hors cartouche (OCC) n’ont montré que des knockouts en arrière-plan. La fréquence élevée de TCR-négative observée dans la population CD8⁺ hors cartouche (OCC) reflète probablement une downmodulation de base spécifique au donneur après activation, indépendamment de l’électroporation ou de l’édition génique puisque ces cellules n’ont pas été exposées à la cartouche. Ensemble, ces résultats démontrent que la DMF-ection permet une édition efficace médiée par CRISPR à l’échelle nanolitre, en entrées RNP. Il est important de noter que le montage était comparable entre les cellules T CD4⁺ et CD8⁺ , soulignant l’applicabilité de la plateforme à travers les sous-ensembles des cellules T et suggérant que l’utilisation du RNP peut être réduite de plus d’un ordre de grandeur sans compromettre l’efficacité du knockout.

Perturbation efficace des gènes dans les lymphocytes T primaires CD4⁺ et CD8⁺ utilisant la DMF-ection miniaturisée
Pour valider plus en profondeur la performance du flux de travail DMF-ection, l’élimination médiée par CRISPR–Cas9 du locus TRAC a été évaluée dans les cellules T humaines primaires CD4⁺ et CD8⁺ en utilisant seulement 10 000 cellules activées par condition. Trois groupes expérimentaux étaient inclus : la condition guide de ciblage TRAC (TRAC KO), un groupe témoin non ciblant (NTC) pour prendre en compte les effets non spécifiques de la délivrance RNP, et un groupe témoin hors cartouche (OCC) pour établir l’expression de base de TCRα/β dans des cellules non traitées et non manipulées. Une stratégie standard de gating a été appliquée pour identifier les singlets vivants, suivis des sous-ensembles CD4⁺ et CD8⁺ et de l’expression TCRα/β (Figure 3A). Une perturbation génique à haute efficacité du locus TRAC a été obtenue dans les deux sous-ensembles de cellules T sur 40 passages d’électroporation indépendants. Dans les cellules T CD4⁺, l’efficacité de knockout TRAC a atteint 88,4 ± 4,9 %, contre 3,2 ± 4,7 % dans les NTC et 9,8 ± 5,1 % dans les conditions OCC. Un résultat comparable a été observé dans les cellules T CD8⁺, où TRAC KO a atteint 89,8 ± 4,2 %, contre 4,2 ± 7,4 % (NTC) et 20,2 ± 4,9 % (OCC) (Figure 3B, à gauche). Il est important de noter que l’électroporation n’a produit aucune cytotoxicité substantielle entre les différentes conditions. La viabilité a dépassé 96 % dans tous les groupes, sans différence significative entre les conditions TRAC KO (97,1 ± 1 %), NTC (96,8 ± 1 %) et OCC (97 ± 1 %) (Figure 3B, à droite). Ensemble, ces données démontrent que l’électroporation DMF permet une perturbation robuste et à haute efficacité du TRAC tout en préservant la viabilité cellulaire sur plusieurs passages indépendants. Les lymphocytes T humains primaires ont été obtenus à partir de sources commerciales avec le consentement éclairé des donneurs et conformément aux directives éthiques institutionnelles et des fournisseurs.

Manipulation de HEK293T sphéroïdes par microfluidique numérique
Ensuite, le flux de travail d’électroporation microfluidique numérique a été évalué pour des applications avec des structures multicellulaires tridimensionnelles. Les sphéroïdes de HEK293T creux se sont formés en ensemençant environ 100 cellules par puits dans des microplaques à faible attachement et en les cultivant pendant 24 heures pour permettre la formation de sphéroïdes (Figure 4A). Les sphéroïdes formés étaient ensuite collectés, resuspendus et chargés sur la cartouche microfluidique numérique pour l’électroporation. Après traitement, les sphéroïdes étaient déchargés dans une plaque de 96 puits pour l’imagerie en aval et l’analyse de croissance.

Pour obtenir une récupération moyenne d’un sphéroïde par puits après électroporation, un nombre excédentaire de sphéroïdes était intentionnellement chargé sur la cartouche pour compenser la perte de matériau lors de la manipulation et du transfert. Environ 192 sphéroïdes ont été resuspendus dans 100 μL de tampon d’électroporation et chargés sur la cartouche. Chaque famille de réactions a reçu ~9,3 μL de suspension, correspondant à ~18 sphéroïdes, avec des gouttelettes individuelles contenant ~1 μL (1 à 2 sphéroïdes par goutte). Comme environ la moitié des sphéroïdes restaient dans le port de chargement pendant le fonctionnement de la cartouche, cette stratégie de chargement entraînait en moyenne ~1 sphéroïde par site d’électroporation tri-goutte.

L’analyse de la récupération des sphéroïdes a indiqué que 0 à 1 sphéroïdes étaient généralement déchargés par puits après électroporation, correspondant à environ 4 à 6 sphéroïdes récupérés par famille de réactions (Figure 4B à gauche du tableau). Cette récupération est inférieure au maximum théorique et reflète les pertes survenues lors du lavage, de l’aspiration du surnageant et de la rétention des sphéroïdes dans le port de chargement. Ces pertes sont attribuées au petit diamètre sphéroïde (~100 μm) et à la difficulté inhérente à maintenir une distribution uniforme des structures non unicellulaires en suspension. En conséquence, certains sphéroïdes restent répartis de manière inégale ou ne pénètrent pas dans la région des trois gouttelettes. Le chargement d’un excès de sphéroïdes garantissait qu’au moins un sphéroïde était présent dans la plupart des sites d’électroporation, permettant une analyse continue en aval, comme le démontre l’imagerie au microscope du sphéroïde coloré en DAPI dans la cartouche microfluidique (Figure 4B, panneau droit). Une optimisation supplémentaire du procédé peut réduire le nombre de sphéroïdes nécessaires pour obtenir une récupération équivalente. Malgré ces pertes de manipulation, le flux de travail a permis un positionnement doux des sphéroïdes intacts au sein de la géométrie d’électroporation à trois goutteles.

Livraison et viabilité de l’ARNm d’EGFP dans HEK293T sphéroïdes
Une délivrance efficace d’ARNm d’EGFP dans HEK293T sphéroïdes a été observée après électroporation (50 ng d’ARNm de GFP par sphéroïde). La microscopie à fluorescence effectuée 24 heures après électroporation a révélé une expression robuste et spatialement uniforme de GFP dans les sphéroïdes électroporés, alors qu’aucune fluorescence détectable n’a été observée en conditions de contrôle hors cartouche à 0 V (Figure 4C, panneau de gauche). L’analyse quantitative de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) normalisée par surface sphéroïde a confirmé la transfection réussie selon les deux ensembles de paramètres d’électroporation testés (Figure 4C, panneau central). Plus précisément, les sphéroïdes électroporés à 500 V, 2 ms, 2 impulsions ont montré un MFI de 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, tandis que ceux électroporés à 375 V, 6 ms, 1 impulsion ont montré un MFI de 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5. Aucune fluorescence mesurable n’a été détectée dans les conditions témoins (0 ± 0). Les deux conditions d’électroporation ont produit une fluorescence significativement plus élevée que les témoins (p < 0,05), sans différence statistiquement significative entre les paramètres d’impulsion. Pour évaluer si l’électroporation affectait négativement la croissance des sphéroïdes ou l’intégrité structurelle, les diamètres des sphéroïdes ont été mesurés quotidiennement sur 5 jours après le traitement. Les sphéroïdes électroporés ont présenté une cinétique de croissance comparable à celle des témoins non traités, indiquant que la transfection d’ARNm n’a pas altéré la viabilité des sphéroïdes ni la capacité prolifactive (Figure 4C, panneau de droite). Ensemble, ces résultats démontrent que l’électroporation microfluidique numérique permet une livraison efficace d’ARNm dans des sphéroïdes multicellulaires intacts tout en préservant l’intégrité et la croissance structurelles, soutenant la faisabilité d’étendre cette plateforme à des modèles cellulaires tridimensionnels.

Les données sont présentées en moyenne ± écart-type. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec la correction post hoc de Tukey pour les comparaisons multiples, avec un seuil de signification de p < 0,05. Les valeurs N représentent des répliques biologiques indépendantes (donneurs séparés ou séries de cartouches indépendantes) comme spécifié dans la figure.

Figure 1. Architecture et flux de travail de la plateforme d’électroporation DMF. (A) Photographie de la cartouche DMF. (B) Schéma annoté de la disposition assemblée de la cartouche 48-plex (image centrale), montrant l’organisation (A–H) de huit familles identiques, chacune contenant six sites d’électroporation adressables indépendamment, avec les ports de chargement d’électrodes liquides, les ports de chargement des cellules, les régions d’anode, de cathode et de nano points indiqués (image encastrée à gauche). Les caractéristiques clés, telles que les ports de chargement, les ports de déchargement et les attaches d’assemblage, sont indiquées. La cartouche est assemblée en ajustant rapidement les deux plaques dans une seule orientation correcte jusqu’à ce qu’un engagement mécanique distinct soit ressenti. Image de droite : carte des distributeurs de liquides montrant les positions codées par couleur pour les ports de chargement (rouge), les ports de déchargement (rose) et les régions cibles de repérage (bleu). (C) Gauche : image montrant la précision positionnelle de la distribution acoustique sur les 48 sites (n = 48), avec les positions de chute tracées par rapport au point médian de l’électrode (mm). Le regroupement serré confirme la précision du dépôt submillimétrique. À droite : images représentatives montrant un point correctement centré avant la réhydratation par la gouttelette cellulaire (en haut) et pendant la réhydratation, où la gouttelette est déplacée d’avant en arrière vers le guide pour être resuspendue (en bas, flèche rouge). (D) Vue de dessus de régions d’électroporation distinctes, montrant le déplacement par étapes des gouttelettes depuis (i) la réhydratation de la charge utile en faisant circuler la gouttelette d’avant en arrière sur l’ARN guide déposé, (ii) le déplacement vers le site d’électroporation, entre l’anode et la cathode, où la gouttelette se relie aux deux gouttelettes d’électrodes liquides flanquantes et est pulsée, et (iii) le tri-largage complet se déplaçant vers son port de déchargement avant la récupération par le manutentionnaire de liquides. (E) Schéma de flux de travail de bout en bout. L’ARN guide est déposé sur le substrat de la cartouche à l’aide d’un distributeur acoustique. Les cellules et la charge utile sont préparées et chargées sur la cartouche à l’aide d’un manipulateur automatique de liquides. L’électroporation est réalisée sur la plateforme DMF. Les cellules sont déchargées dans une plaque de 96 puits et transférées dans un incubateur pour leur récupération. L’analyse en aval est réalisée à l’aide de la cytométrie en écoulement, de la microscopie, du séquençage de nouvelle génération ou d’autres lectures appropriées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Impact de la supplémentation en polymères sur le dépôt et l’assemblage du RNP. (A) La supplémentation en polymères améliore la fidélité des dépôts acoustiques. Absorption de la fluorescéine après dépôt et reconstitution sur quatre cartouches indépendantes, avec ou sans acide poly-L-glutamique. La variance a été réduite à des volumes intermédiaires (40–120 nL) en présence de PGA. 
(B) Impact de la PGA sur l’assemblage de Cas9–sgRNA. Courbes de liaison d’affinité FIDA mesurant le rayon hydrodynamique (Rh) en l’absence (panneau gauche) ou en présence (panneau droit) de PGA. Le sgRNA libre a présenté un Rh de 3,45 ± 0,26 nm, tandis que la titrage Cas9 a donné une taille complexe RNP de 15,32 ± 0,46 nm (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). L’ajout de PGA a réduit la taille du complexe et affaibli l’affinité de liaison de manière dépendante de la concentration. Avec l’ajout de 0,005 mg/mL de PGA, le sgRNA libre a affiché un Rh de 4,31 ± 0,07 nm, tandis que la titration Cas9 a donné une taille du complexe RNP de 10,21 ± 0,38 nm (K_d = 67,7 ± 9,5 nM). Des expériences ont été menées dans un tampon d’électroporation à faible conductivité avec 0,05 % de F-68 pluronique. La fluorescence a été détectée à 480 nm à l’aide du module LED intégré. Un capillaire revêtu de façon permanente (Ø 75 μm, L = 100 cm) a été utilisé pour toutes les expériences. Pour tester l’effet des polymères polyanioniques sur l’assemblage du RNP, la PGA a été ajoutée aux mélanges d’essai à des concentrations de 0,0025 mg/mL et 0,005 mg/mL. Ces conditions ont été sélectionnées pour modéliser la plage utilisée dans la microfluidique numérique, l’électromouillage et les tampons d’électroporation. Pour l’analyse directe de liaison, un sgRNA marqué par FAM de 10 nM ciblant le locus TRAC a été utilisé comme indicateur fluorescent. Des concentrations croissantes de nucléase Cas9 (jusqu’à 500 nM) ont été ajustées par rapport à l’indicateur dans un test CapMix afin de générer des profils de dispersion pour la formation de complexes. Toutes les expériences ont été réalisées à 25 °C, chaque point de données consommant 40 nL d’Indicateur et ~12 μL d’analyte (Cas9). Les expériences ont été menées avec la séquence suivante : (1) rinçage à 0,1 % d’acide phosphorique à 3 500 mbar pendant 30 s ; (2) rinçage avec tampon d’essai à 3 500 mbar pendant 30 s ; (3) remplir le capillaire avec un analyte à 3 500 mbar pendant 20 s ; (4) injection de l’indicateur à 50 mbar pendant 10 s ; (5) mobilisation et mesure avec un analyte à 400 mbar pendant 180 s. Les rayons hydrodynamiques ont été calculés en utilisant la largeur de pic extraite à une hauteur maximale de moitié maximale, et des constantes de dissociation (K_D) ont été déterminés par régression non linéaire en ajustant à un modèle de liaison 1:1. (C) Effet de la PGA sur la stabilité de la PNR. Profils de dispersion taylorienne des complexes Cas9–sgRNA avec et sans PGA, réalisés avec 500 nM nucléase Cas9 et 50 nM marqués sgRNA FAM. En l’absence de PGA, aucun complexe stable n’a été observé, comme l’indique la formation croissante de gros agrégats ainsi qu’une diminution du signal provenant du complexe au fil du temps (à gauche). L’ajout de 0,0025 mg/mL PGA a donné un taylorgramme monodispersé bien défini avec une agrégation minimale mesurant un R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, à droite). La stabilité complexe a été évaluée sous des conditions d’électroporation standard (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) avec ou sans 0,0025 mg/mL de PGA. Les échantillons étaient prémélangés et maintenus à 4 °C dans le plateau d’entrée tandis que les injections étaient effectuées à intervalles de 10 minutes sur plusieurs heures. Les expériences ont été menées avec la séquence suivante : (1) rinçage à 0,1 % d’acide phosphorique à 3 500 mbar pendant 30 s ; (2) rinçage avec tampon d’essai à 3 500 mbar pendant 30 s ; (3) remplir le capillaire avec un analyte (tampon de test) à 3 500 mbar pendant 20 s ; (4) injection de l’indicateur à 50 mbar pendant 10 s ; (5) mobilisation et mesure avec un analyte à 400 mbar pendant 180 s. La formation instable du complexe a été démontrée par la formation de gros agrégats (pics dans le Taylorgram) et la diminution du signal. Les complexes stables ont été identifiés par des Taylorgrammes bien ajustés et monodispersés (R)² > 0,99), et R_h les valeurs étaient extraites des profils ajustés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Efficacité et viabilité de l’élimination alpha/bêta TCR dans les lymphocytes T humains primaires. (A) Stratégie représentative de contrôle de cytométrie en flux pour les singlets vivants, les sous-ensembles de cellules T CD4⁺ et CD8⁺, et l’expression de TCRα/β dans des conditions témoins (sgRNA non ciblant) et expérimentales (TRAC sgRNA). Les cellules ont été transmises séquentiellement sur FSC/SSC, singlets, viabilité et populations CD4⁺ ou CD8⁺ avant l’évaluation de l’expression de surface TCRα/β. (B) Gauche : TCRα/β efficacité d’élimination dans les sous-ensembles de cellules T CD4⁺ et CD8⁺ sur trois conditions : TRAC KO, contrôle non-ciblage (NTC) et contrôle hors cartouche (OCC). CD4⁺ : TRAC KO = 88,4 ± 4,9 % (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7 % (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1 % (n = 18). CD8⁺ : TRAC KO = 89,8 ± 4,2 % (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4 % (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9 % (n = 18). À droite : Viabilité post-électroporation dans toutes les conditions, limitée par des débardeurs. Viabilité : TRAC KO = 97,1 ± 1 % (n = 40), NTC = 96,8 ± 1 % (n = 24), OCC = 97 ± 1 % (n = 18). Les points de données individuels sont indiqués avec la moyenne et la SD. n représente des exécutions d’électroporation indépendantes sur plusieurs cartouches et jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Livraison efficace d’ARNm dans HEK293T sphéroïdes grâce à la DMF-ection. (A) Diagramme de flux de travail décrivant le processus de formation des sphéroïdes et la transfection des sphéroïdes. Cent HEK293T cellules sont chargées par puits dans des microplaques sphéroïdes spécialisées et cultivées pendant 24 heures pour former des sphéroïdes de 100 μm de diamètre. Les sphéroïdes (192) sont déchargés et resuspendus dans 100 μL de tampon de transfection. Cette suspension, avec la charge utile appropriée, est chargée sur la cartouche DMF-ection à pointe de guidage à 9,3 μL par famille. Une fois l’électroporation effectuée, les échantillons sont déchargés dans une plaque de 96 puits pour une analyse en aval. (B) Gauche : Nombre de sphéroïdes déchargés par famille sur la cartouche DMF-ection comparé aux commandes à cartouche hors cartouche pipettées à la main. Au milieu : Image fluorescente du tri-drop, où un carré rouge plus grand délimite le tri-drop, et l’ovale rouge entoure le sphéroïde. À droite : Image fluorescente montrant le port de chargement avec des sphéroïdes chargés (cercles bleus). (C) Panneau gauche : Images en champ clair de sphéroïdes HEK293T intacts avant l’électroporation et images de fluorescence des sphéroïdes 24 heures après l’électroporation de l’ARNm d’EGFP , comparées à 0 V et aux commandes hors cartouche. (D) Panneau supérieur : Quantification de l’intensité moyenne de fluorescence normalisée à la zone sphéroïde pour deux conditions d’électroporation (500 V, 2 ms, 2 impulsions ; 375 V, 6 ms, 1 impulsion). Aucune différence significative entre les conditions électroporées, mais toutes les conditions électroporées diffèrent significativement des commandes 0 V et hors cartouche (500 V 2 ms 2 impulsion : 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 impulsion : 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V : 0 ± 0, contrôle hors cartouche : 0 ± 0 (*p < 0,05). Les images étaient traitées à l’aide du package de traitement d’image^{FIJI 10}. (500 V, 2 ms, 2 impulsions : n = 6 ; 375 V, 6 ms, 1 impulsion : n = 4 ; Contrôle hors cartouche : n = 3 ; 0 V contrôle : n = 3). (D) Panneau inférieur : diamètre sphéroïde après électroporation sur 5 jours à travers les conditions. Le diamètre a été mesuré à l’aide de FIJI à partir d’images à contrat de phase prises à un grossissement de 20x avec un microscope inversé. (500 V, 2 ms, 2 impulsions : n = 6 ; 375 V, 6 ms, 1 impulsion : n = 4 ; Contrôle hors cartouche : n = 3 ; 0 V contrôle : n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ce protocole décrit un flux de travail miniaturisé d’électroporation microfluidique numérique qui permet une livraison intracellulaire efficace dans les lymphocytes T humains primaires à l’aide de gouttelettes à l’échelle nanolitre. Un avantage central de cette méthode est la capacité à réaliser l’édition du génome CRISPR–Cas9 en utilisant seulement 10 000 cellules par réaction, réduisant considérablement les besoins en matière par rapport à l’électroporation conventionnelle. L’architecture basée sur les gouttelettes soutient l’automatisation, garantissant la gestion des réactifs reproductibles et l’assemblage de réactions sur plusieurs sites parallèles.

Dans des études antérieures, un benchmarking direct de la plateforme DMF-ection par rapport à un système largement utilisé a démontré que la nucléofection conventionnelle produisait moins de 2 % de lymphocytes T GFP positifs à 10 000 cellules par montage, tandis que la plateforme DMF-ection atteignait une efficacité de transfection de >90 % dans les mêmes conditions de faible entrée. Pour un écran en réseau de 192 conditions, la plateforme DMF nécessitait 25 fois moins de cellules et environ 50 fois moins de Cas9 par condition que les méthodes^{conventionnelles 9}. Ces comparaisons mettent en lumière les avantages matériels de l’électroporation miniaturisée DMF pour les applications à faible entrée et criblage

Étapes critiques et dépannage
Plusieurs étapes sont cruciales pour réussir. Un étalonnage précis du manipulateur acoustique de liquide assure un dépôt précis de l’ARN guide sur le substrat de la cartouche, ce qui est essentiel pour un assemblage régulier du RNP. Si le spotting est incohérent ou si les gouttelettes n’adhèrent pas au substrat, vérifiez que le PGA est inclus dans le mélange ARN-guide à la bonne concentration (finale de 5 mg/mL) et que le distributeur acoustique est calibré pour la géométrie spécifique de la plaque source. Un spotting incohérent à des volumes intermédiaires (40–120 nL) est le plus souvent causé par un rebond des gouttelettes sur la surface hydrophobe ; augmenter légèrement la concentration de PGA ou réduire la hauteur de dispensation peut résoudre ce problème.

Maintenir la bonne concentration cellulaire avant la charge est important, car les écarts de densité peuvent altuer la formation de gouttelettes et réduire l’efficacité du montage. Si l’efficacité d’édition descend en dessous de 75 %, vérifiez d’abord que l’activation des lymphocytes T était suffisante (confirmez la régulation à la hausse des CD25 et CD69 par cytométrie en flux avant l’électroporation), et confirmez que Cas9 et sgRNA ont été combinés immédiatement avant la charge plutôt qu’à l’avance.

Les additifs polymères jouent un rôle important dans la stabilisation des complexes Cas9–sgRNA sous les conditions tampon^{d’électroporation 11}. Bien que le PGA réduise l’affinité nominale de liaison, son effet stabilisateur améliore la reproductibilité et prévient l’agrégation à des volumes de nanolitres. Cela représente un paramètre ajustable pour les chercheurs adaptant le flux de travail à d’autres complexes protéine–ARN.

Dépannage
Échec du pontage de gouttelettes
Examinez le rapport de contrôle qualité instrumental après chaque expérience. L’absence de courant détecté indique un pontage défaillant, soit dû à un manque de gouttelettes ou à un manque de fusion, et est automatiquement signalée par le système. Les sites affectés ne peuvent pas être récupérés dans la même course. Si les pannes sont sporadiques (<10 %), aucune action n’est requise ; Répartir les réplications sur plusieurs cartouches pour minimiser l’impact. Si les pannes sont systématiques, exécutez la carte QC et le contrôle de santé du système, et contactez le support technique si les problèmes persistent.

Spotting incohérent du sgRNA
Après la délivrance, confirmez visuellement que toutes les gouttelettes attendues sont présentes, centrées dans les limites des électrodes et exemptes de gouttelettes satellites. Inclure le PGA dans le mélange d’ARN guide pour prévenir la polydispersion. Pour les gouttelettes manquantes, vérifiez le rapport de fonctionnement du distributeur et redistribuez si nécessaire. Pour une mauvaise formation du ménisque, maintenir un minimum de 5 μL par puits, faire tourner brièvement la plaque, puis taper doucement sur une surface plane. Travaillez sur la glace et scellez les plaques lorsqu’elles ne sont pas utilisées pour éviter l’évaporation.

Efficacité de montage réduite
Si une efficacité d’édition réduite est observée, dépannez dans l’ordre suivant : (1) valider les conditions de livraison à l’aide de l’ARNm P EGFavant de procéder à la RNP ; (2) confirmer que le courant de la QC mesuré correspond aux valeurs attendues ; (3) densité des cellules titratées, ARN guide et concentration de Cas9 ; (4) confirmer une viabilité élevée des cellules immédiatement avant le chargement ; (5) vérifier l’intégrité du réactif et les conditions de stockage ; (6) confirmer que la méthode de lecture est appropriée à la densité cellulaire et à la cible d’intérêt.

Adaptation de la plateforme à des types cellulaires et modèles alternatifs
Pour d’autres types de cellules immunitaires primaires, comme les cellules NK ou les lymphocytes T régulateurs, les paramètres d’électroporation nécessiteront une optimisation. La taille des cellules est un déterminant important du seuil de champ électrique nécessaire à la perméabilisation membranaire : les cellules plus petites nécessitent des intensités de champ plus élevées, tandis que les cellules plus grandes sont perméabilisées à des tensions plus faibles — une relation bien documentée en biophysique de l’électroporation. Comme point de départ pour les types de cellules plus petits que les cellules CD3⁺ activées, il faut maintenir ou augmenter légèrement la tension (500–550 V) tout en gardant une durée d’impulsion courte (2–3 ms) afin d’éviter un stress thermique excessif. Pour les cellules plus grandes, réduire la tension à 350–400 V, et moduler la durée de l’impulsion sans dépasser 10 ms. De plus, la micro-optimisation au niveau du donneur est une pratique courante en électroporation, et les paramètres validés dans les cellules saines du donneur peuvent ne pas se traduire directement dans le matériel malade ou dérivé du patient. Les cellules de donneurs présentant des cancers hématologiques, une infection chronique ou une immunodéficience présentent fréquemment des propriétés biophysiques modifiées, et l’efficacité et la viabilité de l’édition doivent être réévaluées pour chaque nouveau donneur, en particulier lorsqu’il s’agit d’échantillons non sains ou cliniques. La viabilité cellulaire doit être évaluée à 24 h et 72 h après électroporation et les paramètres doivent être ajustés de manière itérative. La dose de Cas9 peut également devoir être augmentée de 1,5 à 2× par rapport au protocole T-cell si l’efficacité de délivrance RNP est réduite.

Pour les modèles 3D plus grands ou plus denses, comme les organoïdes dépassant 200 μm de diamètre, le joint de la cartouche peut nécessiter des modifications pour s’adapter à une taille de structure accrue et des barrières de diffusion. Les utilisateurs tentant de telles applications devraient envisager de pré-dissocier les couches cellulaires externes pour améliorer la pénétration des réactifs ou d’appliquer plusieurs conditions d’impulsion en séquence. Contactez l’auteur correspondant pour obtenir des conseils sur l’adaptation de la géométrie des gouttelettes et des paramètres d’impulsion pour des structures dépassant le diamètre sphéroïdien de 100 μm validé ici.

Pertinence translationnelle
Le potentiel de traduction de ce flux de travail va au-delà du simple knockout. La plateforme a été appliquée à la réparation dirigée par l’homologie d’un construct GFP de 4 kb et d’un CAR anti-HER2 fonctionnel au lieu TRAC dans les lymphocytes T primaires, ainsi qu’à un écran CRISPR en réseau à 45 cibles identifiant de nouveaux régulateurs de l’épuisement des cellules T^{CD4⁺ 9}. Ces applications illustrent un parcours allant de l’optimisation au niveau du protocole à la découverte fonctionnelle dans des modèles cellulaires primaires cliniquement pertinents. Néanmoins, des limites importantes subsistent : les résultats fonctionnels tels que les taux de perturbation alléliques par séquençage, la sécrétion de cytokines et l’engraftement in vivo n’ont pas été évalués dans le protocole actuel et représentent les étapes suivantes nécessaires à la traduction thérapeutique. De plus, bien que la plateforme supporte 48 réactions parallèles par cartouche, la parallélisation multi-cartouche sera nécessaire pour les écrans plus grands.

Limitations
Comme pour toute plateforme miniaturisée, certaines contraintes pratiques doivent être reconnues. Le phénotypage en aval doit être adapté à la petite échelle de réaction ; L’acquisition par cytométrie en flux peut nécessiter des étapes supplémentaires de concentration ou un regroupement des puits réplicés pour obtenir un nombre suffisant d’événements. Les réglages d’électroporation de la plateforme peuvent également nécessiter une optimisation pour les types de cellules à forte sensibilité aux champs électriques, et les utilisateurs doivent considérer les paramètres publiés comme des points de départ plutôt que comme des valeurs universellement fixes. Enfin, la coloration formelle de viabilité à des points temporels post-électroporation prolongés n’a pas été réalisée pour le flux de travail sphéroïde présenté ici ; Le suivi de croissance basé sur le diamètre a été utilisé comme mesure de substitution de l’intégrité structurelle et représente une orientation importante pour la caractérisation future.

Dans l’ensemble, la DMF-ection, une méthode de transfection non virale, offre une approche puissante et flexible pour l’édition du génome et la délivrance d’ARNm dans des environnements à faible entrée et à haut débit. Sa compatibilité avec les lymphocytes T primaires, les modèles 3D structurés et la manipulation automatisée des liquides élargit les opportunités en ingénierie de la thérapie cellulaire, le dépistage multi-condition CRISPR et la génomique fonctionnelle miniaturisée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol