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Détection de la sénescence à l’aide de la lumière réfléchie dans la fraction vasculaire stromale adipeuse

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DOI :

10.3791/70588

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5 juin 2026

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1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une microscopie confocale à lumière réfléchie pour la détection objective et unicellulaire de l’activité bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) dans la fraction vasculaire stromale isolée du tissu adipeux humain. La méthode est compatible avec l’immunocytochimie, intègre des contrôles du pH pour l’évaluation quantitative, et offre en outre une alternative plus sensible et moins subjective à la coloration conventionnelle SA-β-gal.

Résumé

La sénescence cellulaire est un état induit par le stress caractérisé par un arrêt permanent du cycle cellulaire et le développement d’un profil sécrétoire distinctif qui affecte la fonction tissulaire et contribue au vieillissement ainsi qu’aux maladies métaboliques. L’activité β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) est largement utilisée comme marqueur des cellules sénescentes ; cependant, les tests SA-β-gal conventionnels reposent souvent sur une évaluation visuelle subjective et fournissent des informations quantitatives limitées. Ces limitations sont particulièrement évidentes dans les populations cellulaires humaines primaires telles que la fraction vasculaire stromale (SVF) dérivée du tissu adipeux, qui contient un mélange hétérogène de préadipocytes, de cellules immunitaires et de cellules endothéliales. Ici, nous présentons une approche optimisée de microscopie confocale à lumière réfléchie pour la détection quantitative à haute résolution de l’activité SA-β-gal dans les cellules SVF humaines. Ce protocole permet une analyse objective unicellulaire de l’activité SA-β-gal, permet une immunocytochimie simultanée pour la détection multiplexée d’autres marqueurs de sénescence ou de lignée, et intègre des témoins correspondant au pH. En combinant ces caractéristiques, cette méthode offre une approche sensible, reproductible et quantitative pour étudier la sénescence cellulaire dans des populations cellulaires humaines primaires hétérogènes. Il offre une alternative améliorée à la teinture SA-β-galon conventionnelle.

Introduction

La sénescence cellulaire est une réponse multifacette qui peut résulter de nombreux types de stress, notamment des dommages à l’ADN, l’attrition des télomères et l’activation des oncogènes. Elle conduit à un arrêt stable du cycle cellulaire ainsi qu’à une résistance accrue à l’apoptose, en partie grâce à l’induction de protéines anti-apoptotiques 1,2. La sénescence a été associée à une amélioration de la survie cellulaire dans des contextes où la préservation de l’intégrité tissulaire est essentielle, comme la réparation et l’entretien 3,4. Au-delà de son rôle dans l’homéostasie tissulaire, la sénescence contribue également au développement normal en façonnant le motif embryonnaire 5,6 et en servant d’obstacle à la formation tumorale en favorisant l’élimination des cellules endommagées ou potentiellementmalignes 7,8,9. Bien que la sénescence puisse avoir des fonctions bénéfiques, de nombreuses études ont mis en lumière un aspect contrastant dans lequel les cellules sénécentes acquièrent un profil sécrétoire pro-inflammatoire qui peut perturber le métabolisme local, endommager les tissus environnants et même soutenir la progressiontumorale 10,11,12,13.

La sénescence a été détectée chez divers types cellulaires répartis sur plusieurs tissus et est souvent associée au vieillissement, aux maladies, aux dysfonctionnements tissulaires ou au cancer. Dans le foie, la sénescence des cellules stellées hépatiques a montré qu’elle favorise la progression tumorale en modifiant l’homéostasie métabolique via des facteurssécrétés 14,15. Des études portant sur les hépatocytes16 ou les biopsies du foieentier 17 indiquent que la sénescence dans ces cellules peut contribuer à des comorbidités métaboliques telles que la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique et la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement. De plus, la relation entre le diabète de type 2 et la sénescence a suscité une attention significative au cours de la dernière décennie, avec des preuves liant la sénescence à des complications liées au diabète dans les cellules β pancréatiques, les hépatocytes16 et lesadipocytes 18,19,20,21. Ces résultats soulignent l’importance d’identifier avec précision les cellules sénescentes dans les tissus métaboliques, où leur accumulation et leur hétérogénéité contribuent à la progression de la maladie et au ciblagethérapeutique 22.

Les changements de signalisation et d’expression des protéines associés à la sénescence sont souvent spécifiques aux cellules et aux tissus ; cependant, plusieurs caractéristiques sont globalement caractéristiques des cellules sénescentes. L’un des marqueurs les plus utilisés est l’augmentation de l’activité enzymatique de la β-galactosidase à pH 6,0, appelée β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal)23. β-galactosidase est une hydrolase lysosomale présente dans toutes les cellules et est normalement active à un pH acide (~4,5–5,0), où elle contribue à la dégradation des substrats glycosylés. La caractéristique déterminante de la SA-β-gal est la rétention de l’activité de la β-galactosidase dans des conditions de pH sous-optimales. Dans l’analyse classique, les cellules sont incubées avec le substrat synthétique 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) à un pH de 6,0, où l’activité enzymatique est réduite dans la plupart des cellules mais reste détectable dans les cellules sénescentes. Cela conduit à la formation d’un précipité bleu insoluble qui peut être visualisémicroscopiquement 24.

Bien que ce test ait été largement adopté, la détection du précipité X-gal s’est traditionnellement appuyée sur la microscopie en champ clair. La détection en champ clair repose sur l’identification visuelle du précipité bleu et présente donc une sensibilité limitée aux signaux de faible niveau et aux états de sénescence précoces. En revanche, l’imagerie à lumière réfléchie capture la densité optique du précipité X-gal, permettant une détection quantitative sur une plage dynamique plus large. Plus récemment, des substrats fluorogènes ont été développés pour améliorer lasensibilité à 25. Cependant, ces approches mesurent généralement l’activité de la β-galactosidase dans des conditions qui ne préservent pas la définition classique dépendante du pH de la SA-β-gal. En conséquence, ils peuvent augmenter l’intensité du signal mais réduire la spécificité pour la sénescence. En revanche, l’opacité inhérente du précipité X-gal permet sa détection par imagerie confocale réfléchie en lumière réfléchie, offrant une lecture plus sensible et quantitative tout en maintenant la définition enzymatique originale de SA-β-gal26.

Au fil des années, d’autres caractéristiques de la sénescence ont été identifiées, notamment une expression accrue des inhibiteurs de kinases dépendantes de la cycline P16 et P21, ainsi que le facteur de transcription P53, qui régule l’arrêt du cycle cellulaire et d’autres programmesde sénescence 27,28,29,30,31,32,33 . Ces avancées ont conduit à une définition plus robuste de la sénescence, dans laquelle les cellules sont généralement classées en fonction de la présence combinée de plusieurs marqueurs. En pratique, cependant, ces marqueurs sont souvent mesurés selon différentes modalités : les marqueurs nucléaires, tels que P16 et P21, sont généralement détectés par des techniques basées sur la fluorescence, tandis que l’activité SA-β-gal a traditionnellement été évaluée par microscopie en champ clair. Cette séparation a limité la capacité d’évaluer plusieurs caractéristiques de sénescence au sein d’une même cellule. L’imagerie à lumière réfléchie surmonte cette limitation en permettant l’intégration directe de la détection SA-β-gal avec des marqueurs à base de fluorescence au sein d’un seul flux de travail d’imagerie, facilitant ainsi une évaluation plus robuste et biologiquement significative de la sénescence dans des populations cellulaires hétérogènes.

Bien que Dedic et ses collègues abordent plusieurs limites de l’imagerie traditionnelle SA-β-gal, notamment l’amélioration de la sensibilité, l’utilisation de contrôles à pH adapté pour le seuil objectif, et la compatibilité avec l’immunocytochimie, leur méthode confocale à lumière réfléchie a été optimisée spécifiquement pour les adipocytes maturesisolés 26. Cependant, la sénescence dans le tissu adipeux ne se limite pas aux adipocytes34,35, et des informations supplémentaires peuvent être obtenues en examinant la fraction vasculaire stromale (SVF). La SVF comprend des préadipocytes, des populations endothéliales et de fibroblastes, ainsi que diverses cellules immunitaires, qui peuvent toutes subir une sénescence et contribuer au remodelage adipeux, à l’inflammation et à une signalisation métabolique altérée. Caractériser la sénescence au sein de ce compartiment hétérogène est donc important pour relier les processus spécifiques au type cellulaire aux résultats tissulaires et systémiques.

Ici, nous étendons la détection de la lumière réfléchie SA-β-gal aux cellules SVF, permettant son application à plusieurs types de cellules de tissu adipeux. En combinant cette approche avec l’immunocytochimie, la méthode permet une analyse intégrée unicellulaire de l’activité SA-β-gal aux côtés de marqueurs de lignée et de caractéristiques fonctionnelles dans des échantillons humains primaires.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux statuts de la Déclaration d’Helsinki. L’étude a été approuvée par le comité régional d’éthique de Stockholm, DNR 2012/50-31.

1. Préparation des cellules

  1. Utilisez des cellules de fraction vasculaire stromale (SVF) isolées du tissu adipeux humain par digestion de la collagénase.
    REMARQUE : Le rendement cellulaire varie en fonction de la taille de la biopsie et de la composition tissulaire ; cependant, environ 1,0 ×10 6 cellules SVF sont généralement obtenues par 10 g de tissu adipeux.

2. Coloration X-gal et préparation des lames

  1. Fixez les cellules dans 1 mL de paraformoldéhyde (PFA) à 2 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL pendant 20 minutes à température ambiante (RT) sur un bascule.
  2. Centrifugez à 600 × g pendant 10 minutes et retirez le surnageant.
  3. Préparez la solution de coloration X-gal à l’aide du kit de coloration sénescence β-Galactosidase selon les instructions du fabricant.
  4. Divisez la solution colorante en 3 tubes (1 mL chacun) et ajustez le pH à 5, 6 et 8 avec 1 M HCl et 1 M NaOH. Mesurez le pH à l’aide d’un pHömètre calibré.
  5. Ajouter la solution X-gal à 0,5 × 106 cellules pour la condition et incuber pendant 24 heures à 37 °C sans CO2.
  6. Centrifugez à 600 × g pendant 10 minutes et retirez le surnageant.
  7. Lavez les cellules avec du PBS (pH 7), centrifugez à 600 × g pendant 10 minutes, puis retirez le surnageant.
  8. Préparez une solution primaire d’anticorps (CD31 [1:200] ou IgG contrôle [1:333]) dans 5 % de sérum d’âne normal (NDS). Incubez les cellules toute la nuit à 4 °C.
  9. Laver les cellules 3 fois en PBST (0,1 %) pendant 10 minutes à la répression sur un bascule.
  10. Préparez une solution secondaire d’anticorps (anti-souris Alexa Fluor 555 [1:500]) et l’agglutinine germinale de blé (WGA [1:200]) dans 5 % de NDS. Incubez pendant 1 heure au RT sur un rocker.
  11. Centrifugez à 600 × g pendant 10 minutes et retirez la solution secondaire anticorps colorante.
  12. Lavez les cellules 3 fois en PBST (0,1 %) pendant 10 minutes sur un bascule à RT.
  13. Centrifugez à 600 × g pendant 10 minutes et retirez le surnageant.
  14. Resuspendez les cellules dans le montant antifade.
  15. Pipettez la suspension cellulaire sur des lames de microscope.
  16. Laissez le milieu de montage durcir pendant la nuit à la RT pour immobiliser les cellules.
  17. Ajoutez 100 μL de glycérol à 100 %, placez une housse sur le dessus, puis scellez avec du vernis à ongles.

3. Microscopie

REMARQUE : Cellules d’image utilisant un microscope confocal configurées pour la détection de la lumière réfléchie. Le signal lumineux réfléchi doit être collecté à la longueur d’onde d’excitation ou près de celle-ci à l’aide d’un séparateur de faisceau ou d’une configuration de miroir dichroïque fourni par le fabricant. Utilisez un objectif à 30× avec de l’huile de silicone (ouverture numérique 1,05) pour toutes les expériences.

  1. Sélectionnez le réglage du séparateur de faisceau T90/R10 dans le logiciel du microscope.
  2. Utilisez une excitation de 633 nm et collectez la lumière réfléchie entre 635 et 645 nm.
  3. Acquérez le signal Hoechst en utilisant une excitation de 405 nm.
  4. Acquérez le signal WGA en utilisant l’excitation 488 nm.
  5. Acquérez le signal CD31 en utilisant une excitation de 555 nm.
  6. Fixez la taille de pas Z à l’optimale système (0,74 μm) et définissez une pile Z basée sur le signal membranaire pour capturer le volume complet de la cellule.
  7. Acquérir des images en utilisant les mêmes réglages d’acquisition pour tous les échantillons. Sauvegarder les fichiers dans le format natif du microscope (par exemple, .oir) sans compression.

4. Analyse d’images

REMARQUE : Analysez les images à l’aide d’ImageJ et CellProfiler.

  1. Séparez les canaux dans ImageJ pour générer des piles Z pour chaque canal (405, 488, 555, 633).
  2. Générez des projections d’intensité sommée en utilisant la fonction Z Project et exportez sous forme de fichiers TIFF 16 bits.
  3. Importez des images dans CellProfiler (version 4.2.8) pour automatiser la segmentation cellulaire et la quantification de l’intensité de lumière réfléchie par cellule (Figure 1 et Figure 2 supplémentaires).
  4. Exportez les mesures d’intensité vers un tableau Excel pour une analyse en aval.

5. Score SA-β-gal

  1. Définir le seuil de positivité SA-β-gal comme l’intensité moyenne de la lumière réfléchie de la condition de pH 8 plus trois écarts-types.
  2. Classez les cellules en état de pH 6 dont les valeurs d’intensité sont supérieures à ce seuil comme SA-β-gal positives.

Résultats

La coloration SA-β-gal réfléchie par lumière des cellules SVF humaines a produit des motifs clairs et reproductibles dans les trois conditions contrôlées par le pH. La coloration CD31 a été incluse pour identifier les cellules endothéliales au sein de la SVF, permettant ainsi de distinguer ces cellules des autres populations. Bien qu’un petit nombre de cellules CD31 positives ait été présent, le marqueur a confirmé la présence de cellules endothéliales et démontré la compatibilité de la méthode avec des échantillons primaires hétérogènes.

La condition de pH 5 a généré un signal fort dans la plupart des cellules, cohérent avec une activité endogène de bêta galactosidase élevée à pH acide (Figure 1Aa–Ac). Au pH 6, la condition utilisée pour évaluer l’activité SA-β-gal, l’intensité de coloration a été réduite par rapport au pH 5, et seul un sous-ensemble de cellules a montré un signal au-dessus du fond (Figure 1Ba–Bc). Ce changement d’intensité et de fréquence du signal est cohérent avec la dépendance attendue du pH du test et permet d’identifier des cellules présentant une activité SA-β-galactosidase conservée dans des conditions sous-optimales. La condition de pH 8 produisait un signal lumineux réfléchi minimal, la plupart des cellules étant proches ou en arrière-plan (Figure 1Ca–Cc). Cette condition a été utilisée pour définir le seuil de positivité SA-β-gal, indiqué par la ligne pointillée rouge dans la Figure 1A c,Bc,Cc.

Pour l’analyse quantitative, le seuil d’activité SA-β-gal a été défini comme l’intensité lumineuse réfléchie moyenne de la condition de pH 8 plus trois écarts-types. Les cellules en état de pH 6 dont les valeurs d’intensité dépassent ce seuil ont été classées SA-β-gal positives. Cette approche fournit une coupure objective et basée sur les données, qui prend en compte le signal de fond et minimise la classification des faux positifs.

Pour évaluer la sensibilité à la détection et la compatibilité avec l’immunocytochimie, l’imagerie à lumière réfléchie et en champ clair a été comparée dans toutes les conditions de pH. Au pH 5 (Figure 2Aa–Ad), la lumière réfléchie a révélé un fort précipité X-gal, tandis que le champ lumineux n’a détecté que les dépôts les plus proéminents. À pH 6 (Figure 2Ba–Bd), la lumière réfléchie a identifié des cellules positives SA-β-gal qui n’étaient pas détectables de manière fiable par le champ clair, où le signal paraissait faible ou diffus. Au pH 8 (Figure 2Ca–Cd), la lumière réfléchie détectait un signal minimal, compatible avec une faible activité enzymatique, tandis que le champ clair n’a pas révélé de précipité détectable. Ces observations indiquent que l’imagerie à lumière réfléchie améliore la détection du précipité X-gal, en particulier aux niveaux d’activité intermédiaire et faible.

Le test SA-β-gal à lumière réfléchie a également été réalisé sur une plaque à 96 puits (Figure supplémentaire 3). Cette configuration entraînait une augmentation du signal de fond due à la réflexion sur la surface plastique, réduisant le contraste entre les cellules positives et négatives. Les imperfections de surface, telles que les rayures, augmentent encore la réflexion de fond (Figure 3 supplémentaire, flèches noires). En conséquence, l’analyse quantitative était moins fiable que l’imagerie sur des bâtons de verre couverts. Si un format de plaque est requis, des plaques à fond en verre sont recommandées pour une détection optimale du signal.

Ensemble, ces résultats montrent une séparation claire entre la condition de pH 5 fortement positive, le signal intermédiaire au pH 6, et le fond minimal au pH 8. Ce schéma est cohérent avec le comportement attendu du test et soutient l’utilisation de l’imagerie à lumière réfléchie pour la détection de l’activité SA-β-gal dans des populations cellulaires primaires hétérogènes.

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Figure 1 : Détection de la lumière réfléchie SA-β-gal dépendante du pH dans les cellules SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) et l’imagerie à lumière réfléchie (Ab, Bb, Cb) détectent le précipité X-gal dans des conditions de pH 5, 6 et 8. Le signal est le plus fort au pH 5, réduit au pH 6, et minimal au pH 8. La quantification de l’intensité de la lumière réfléchie (Ac, Bc, Cc) montre la répartition de l’activité de la β-galactosidase sous chaque condition. Chaque point représente une seule cellule, et la ligne pointillée rouge indique le seuil utilisé pour classer les cellules SA-β-gal-positives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Comparaison de la lumière réfléchie et de la détection SA-β-gal en champ clair dans les cellules SVF. Des images zoomées de cellules SVF colorées à X-gal aux pH 5, 6 et 8 montrent la coloration WGA (Aa, Ba, Ca), la coloration CD31 (Ab, Bb, Cb) pour identifier les cellules endothéliales, l’imagerie à lumière réfléchie (Ac, Bc, Cc) pour détecter le précipité X-gal, ainsi que des images correspondantes en champ clair (Ad, Bd, Cd). L’imagerie à lumière réfléchie détecte les précipités X-gal dans toutes les conditions, tandis que le champ clair révèle principalement des dépôts d’intensité plus élevée et offre une détection limitée à des niveaux de signal plus faibles. La coloration CD31 est observée dans des conditions de pH 5 et pH 6, permettant d’identifier les cellules endothéliales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 1 complémentaire : Aperçu du pipeline CellProfiler. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 complémentaire : Flux de travail pour la segmentation des noyaux et des cellules. Images représentatives de (A) noyaux colorés à Hoechst et (B) segmentation correspondante des noyaux. (C) Segmentation cellulaire basée sur la coloration membranaire. (D) Superposition des noyaux et des frontières cellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Imagerie SA-β-gal réfléchie dans une plaque à 96 puits au fond plastique. (A) coloration WGA et (B) imagerie à lumière réfléchie de cellules SVF colorées en X-gal dans une plaque standard à fond plastique à 96 puits. Un signal de fond accru est observé par rapport à l’imagerie sur verre, ce qui correspond à la réflexion de la lumière sur la surface plastique, ce qui réduit le contraste lors de la détection SA-β-gal. Les rayures de surface (flèches noires) augmentent encore le signal de fond (B). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La β-galactosidase associée à la sénescence est l’un des marqueurs les plus utilisés pour identifier les cellules sénescentes ; cependant, les méthodes traditionnelles de détection en champ clair sont limitées par une faible sensibilité et un haut degré de subjectivité. L’imagerie à lumière réfléchie des cellules SVF colorées à X-gal offre une approche plus sensible et reproductible pour mesurer l’activité SA-β-gal au niveau de la cellule individuelle, tout en restant compatible avec la coloration par anticorps fluorescents. En optimisant cette méthode pour la SVF, l’activité SA-β-gal peut être détectée aux côtés de marqueurs spécifiques à la cellule tels que CD31, permettant d’analyser des populations cellulaires primaires hétérogènes sans besoin de tri cellulaire.

Plusieurs paramètres techniques sont essentiels pour une mise en œuvre fiable. Une calibration précise du pH de la solution de coloration X-gal est essentielle, car de petites déviations peuvent modifier l’activité enzymatique et affecter la détection du signal. Le pH-mètre doit être calibré immédiatement avant l’utilisation avec des tampons standards (par exemple, pH 4,0 et pH 7,0), et le pH de la solution colorante doit être vérifié après la préparation. De plus, l’acquisition par Z-stack doit capturer l’ensemble du volume de la cellule, car une couverture incomplète conduit à une sous-estimation de l’intensité de la lumière réfléchie. Les paramètres d’imagerie, y compris la puissance du laser et le gain du détecteur, doivent être optimisés pour maximiser le signal sans saturation et rester cohérents entre les échantillons.

Comparé aux tests alternatifs de sénescence, l’imagerie à lumière réfléchie présente plusieurs avantages. La détection SA-β-gal en champ clair repose sur l’identification visuelle du précipité et présente donc une sensibilité limitée et n’est pas facilement compatible avec l’analyse multiplexée. En revanche, l’imagerie à lumière réfléchie détecte la densité optique du précipité X-gal tout en préservant la définition enzymatique dépendante du pH de la SA-β-gal. Cela permet la détection simultanée de l’activité SA-β-gal ainsi que des marqueurs à fluorescence, permettant d’évaluer la sénescence à l’aide de multiples caractéristiques au sein de cellules individuelles.

Malgré ces avantages, la méthode présente des limites. L’imagerie à lumière réfléchie détecte la densité optique du précipité X-gal mais ne peut pas distinguer de manière définitive ce signal des autres structures intracellulaires denses, rendant les conditions contrôlées par le pH essentielles. La condition de pH 8 fournit une base de référence pour la lumière réfléchie de fond et permet la distinction entre signaux spécifiques et non spécifiques. L’approche nécessite également un microscope confocal doté de capacités appropriées de détection de la lumière réfléchie, ce qui peut ne pas être disponible sur tous les systèmes. De plus, les propriétés de surface d’imagerie peuvent affecter la qualité du signal : les plaques à fond plastique augmentent le fond grâce à la réflexion et réduisent le contraste, tandis que les surfaces vitrées offrent une détection plus fiable.

Cette méthode s’appuie sur les travaux de Dedic et al., qui ont établi l’imagerie à lumière réfléchie pour la détection de SA-β-gal chez les adipocytes matures, et étend l’approche à un éventail plus large de typescellulaires 26. L’application à des SVF fraîchement isolés démontre que la détection par lumière réfléchie du précipité X-gal est compatible avec la diversité des populations cellulaires humaines primaires. La capacité à combiner la détection SA-β-gal avec des marqueurs de lignée tels que CD31 permet également l’analyse de sous-populations définies au sein de tissus hétérogènes.

Bien que la variabilité entre donneurs soit attendue dans les échantillons humains primaires, l’objectif de cette étude est d’établir la mise en œuvre technique de la méthode plutôt que de caractériser la variabilité biologique. Les applications futures sur plusieurs échantillons biologiques ou conditions expérimentales devraient intégrer des analyses statistiques appropriées. De plus, la validation dans des modèles d’induction de sénescence établis et l’intégration avec des marqueurs de sénescence orthogonaux affineront encore l’interprétation de l’activité SA-β-gal dans les populations cellulaires complexes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Liv Eidsmo et Keira Melican pour leur accès aux biopsies de tissus humains, ainsi que Lena Appelsved pour son aide au traitement des échantillons. Cette étude a été soutenue par des subventions accordées à KLS du Conseil suédois de la recherche (2022-01236), du Programme stratégique de recherche sur le diabète à l’Institut Karolinska (C5471162), de la Fondation Novo Nordisk (C5475033), du Vallee Foundation Scholar Award (C5471234), de la Mark Foundation Aspire Grant (C5477023), de la Société Suédoise du Cancer (22 2420), du Programme de Recherche Stratégique sur les cellules souches et la régénération à l’Institut Karolinska (C5472022) et de la Fondation Knut et Alice Wallenberg (2020.0118 ; 2023.0536).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

Références

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

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