Assemblage et utilisation d’un système de croissance gnotobiotique végétale pour les études d’interaction plante-microbe dans les céréales

Résumé

Ce protocole décrit l’assemblage et l’utilisation d’un nouveau système de croissance gnotobiotique végétale conçu pour accueillir les céréales et validé dans le blé et le maïs. Ce système gnotobiotique végétal permet des expériences contrôlées plante-microbe en offrant des conditions de croissance stériles, une gestion de l’irrigation et une compatibilité avec la diversité des substrats soliques.

Résumé

Le développement d’amendements agricoles à base microbienne qui fonctionnent de manière cohérente sur le terrain nécessite une compréhension des mécanismes moléculaires des interactions plante-microbe. L’étude de ces mécanismes sous-jacents d’interaction exige la capacité de faire croître des plantes dans des conditions environnementales contrôlées et gnotobiotiques (c’est-à-dire que tous les micro-organismes interagissant avec la plante sont connus, qu’il s’agisse de communautés microbiennes délimitées ou naturelles sans germes). Les systèmes gnotobiotiques végétales actuellement disponibles ne conviennent pas à l’étude de grandes plantes d’intérêt agricole, telles que les céréales. De plus, la plupart de ces systèmes ne sont pas capables de gérer l’irrigation. Nous introduisons ici GNOVA, un nouveau système gnotobiotique conçu pour accueillir les céréales capables de gérer l’irrigation. Ce nouveau système est une plateforme accessible composée d’une base imprimée en 3D et de matériaux disponibles dans le commerce. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour assembler le système et la mise en place de l’expérience. De plus, nous présentons une comparaison des performances de GNOVA avec un système de sacs gnotobiotiques. GNOVA a prolongé la croissance des plantes de deux semaines dans le système de sac à 17 semaines pour le blé et 4 semaines pour le maïs. Le taux de germination des deux cultures a également augmenté dans la GNOVA, passant de 66 % à 100 % pour le blé et de 75 % à 100 % pour le maïs. Le blé cultivé dans le GNOVA a développé des motoculteurs, absents chez les plantes du même âge dans le système de sac. Le poids frais du maïs cultivé dans la GNOVA était 594 % supérieur à celui du système de sacs. De plus, la hauteur des pousses et la longueur des racines du maïs étaient respectivement 89 % et 57 % plus élevées dans le système GNOVA que dans les sacs. Le système GNOVA élargit la boîte à outils disponible pour les scientifiques afin d’explorer les interactions plante-microbiote au-delà du stade des semis dans les céréales, en offrant un espace de croissance accru et une gestion de l’irrigation.

Introduction

Les traitements agricoles à base de microbes ont suscité un intérêt considérable ces dernières décennies en raison de leur potentiel à améliorer la productivité des cultures en renforçant la croissance des plantes et leur résilience face au stress environnemental. Parallèlement, les mécanismes moléculaires d’action de ces biostimulants restent mal compris, ce qui peut contribuer à leurs résultats incohérents selon les sols, les lieux et les conditions^{environnementales 1,2}. Promouvoir une meilleure efficacité des traitements existants à base de microbes et le développement de nouvelles technologies nécessite une compréhension plus approfondie des mécanismes moléculaires de l’interaction^{plante-microbe 3,4}. Cependant, la dissection de ces mécanismes reste difficile en raison de la complexité des communautés microbiennes^{naturelles 5,6}. Pour identifier les effecteurs microbiens et les interactions qui favorisent les bénéfices des plantes, nous pouvons réduire la complexité des systèmes naturels en employant des communautés microbiennes synthétiques (SynComs) au sein de systèmes de croissance permettant le contrôle des conditions environnementales et de la communauté microbienne. La gnotobiologie, l’étude des hôtes associés à des communautés microbiennes^{définies 7}, permet aux chercheurs de comparer des hôtes exempts de germes à ceux colonisés par des communautés microbiennes connues afin de relier la fonction microbienne au phénotype⁸ de la plante.

Les premiers systèmes gnotobiotiques étaient construits à l’aide de tubes à essai en^{verre 9, 10, 11, 12} et de bocaux¹³. Depuis, nous avons assisté à une expansion rapide de nouveaux systèmes développés pour étudier les plantes de manière gnotobiotique. Les systèmes les plus couramment utilisés aujourd’hui incluent l’utilisation de boîtes de Pétri¹⁴, tubes^{à essai 15 et 16}, bocaux en^{verre 17}, boîtes^{magenta 18}, sacs scellés¹⁹, hydroponie²⁰, FlowPot et GnotoPot²¹, systèmes microfluidiques²² et EcoFABs²³. Malgré ces progrès, la plupart des systèmes sont soit optimisés pour l’imagerie²² ou la collecte^{d’exsudats 17, 20}, soit conçus pour les petites espèces^{modèles 14, 18, 21}. Beaucoup sont des systèmes fermés qui limitent le contrôle de l’irrigation et la durée des expériences. Ces contraintes posent des défis pour l’étude des cultures agricoles plus importantes, telles que les céréales, qui nécessitent un espace supplémentaire, un flux d’air et une gestion de l’eau.

Reconnaissant le besoin d’un système capable d’accueillir des plantes plus grandes et des études plus longues, l’EcoFAB 3.0 a récemment été développé pour étendre la culture gnotobiotique aux plantes^{plus grandes 24}. L’EcoFAB 3.0 offre un volume radiculaire et d’espace de tête plus important, ce qui favorise la croissance du sorgho bicolor jusqu’à 4 semaines, et permet la collecte d’exsudats et l’imagerie^{radiculaire 24}. Même si ce nouveau système est un exemple prometteur d’extension des systèmes gnotobiotiques aux cultures agricoles, il reste nécessaire d’une plateforme accessible et polyvalente, facilement adaptée à l’ensemble des laboratoires et compatible avec un large éventail de flux de travail expérimentaux. Pour cette raison, nous avons développé GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), un système conçu pour accueillir des cultures céréalières dans des conditions gnotobiotiques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour assembler et faire fonctionner GNOVA et démontrons ses performances par rapport à un système de sacs gnotobiotiques couramment utilisé dans notre laboratoire. Avec le développement de ce nouveau système, nous avons amélioré la capacité de cultiver du blé et du maïs dans des conditions stériles en offrant un espace de croissance plus grand et une irrigation intégrée comparé aux systèmes fermés précédents. La performance de la GNOVA est comparable à celle de l’EcoFAB 3.0, élargissant ainsi le répertoire d’outils pour disséquer les interactions plante-microbiome dans les cultures céréalières non modèles. De plus, la polyvalence et l’adaptabilité des gnotobiotiques végétales sont renforcées par la conception simple de GNOVA, l’utilisation de matériaux disponibles dans le commerce et les fichiers objets 3D disponibles, qui permettent aux chercheurs de modifier les matériaux et la conception pour ajuster leurs besoins de recherche et de budget.

Protocole

REMARQUE : Les fichiers d’impression 3D pour la base se trouvent dans les matériaux complémentaires et sont disponibles publiquement dans Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Pour la rapidité et l’efficacité économique, nous recommandons d’imprimer en grande quantité chez des prestataires locaux de services d’impression 3D commerciale.

1. Assemblage du système gnotobiotique

1. Lancer l’assemblage des potentiomètres (effectuer une fois avant une utilisation expérimentale répétée).
   1. Fermez le fond du pot en plaçant le cercle en treillis métallique en acier inoxydable sur une extrémité du tube en polycarbonate et en fixant le cercle à l’aide du collier de serrage (Figure 1A).
   2. Forez les ouvertures d’irrigation en créant une ouverture d’irrigation de 1/4 de pouce (6,35 mm) à 1,5 cm du bord supérieur de l’extrémité ouverte du tube en polycarbonate. Percer deux fentes de 1/8 de pouce (3,18 mm) à 3 cm de la première ouverture, avec une fente à 1 cm du bord et l’autre à 2 cm de la fente supérieure.
      REMARQUE : Si nécessaire, des lignes de tuyau supplémentaires peuvent être ajoutées autour du bord supérieur du pot en suivant les mêmes étapes.
   3. Installez le tuyau d’irrigation en insérant une courte section de tuyau en silicium par l’ouverture de 1/4 de pouce.
   4. Fixez le tube en passant le collier à travers les deux fentes de 1/8 de pouce (Figure 1B). Insérez le lure mâle de l’insertion 1 dans le tube en silicium qui s’étend à l’extérieur du potentiomètre (Figure 1C).
      REMARQUE : La pointe de tuyau du raccord 1 doit être exposée.
   5. Préparez les canons de seringues en remplissant un baril vide de laine de verre et en fermant l’extrémité avec un petit morceau de papier aluminium (Figure 1C).
   6. Fixez un court morceau de tube en silicium à l’extrémité Luer Lock du tube de la seringue (Figure 1C).
   7. Préparez deux canons de seringues identiques. Fixez un des canons de seringue préparés à la pointe de tuyau exposée de l’emplacement 1 sur le tube qui s’étend hors du pot (Figure 1D).
   8. Pause : Les pots assemblés peuvent être stockés pour un usage expérimental ultérieur.

Figure 1 : Ensemble de la casserole. A) Fond de la casserole fermé avec une grille métallique et une pince de tuyau. (B) Un port d’irrigation au bord supérieur du pot. (C) La conduite d’irrigation se termine par une pointe de tuyau exposée du raccord 1 avec un canon de seringue préparé. (D) Pot assemblé avec une conduite d’irrigation fermée Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation du pot pour l’expérience (à réaliser avant chaque nouvelle expérience)
   1. Tapisser le fond du pot avec deux cercles pré-découpés en fibre de verre pour tuyaux (Figure 2A).
   2. Préparez le substrat du sol en mélangeant deux parties d’argile avec une partie de sable. Ajoutez 840 mL de substrat au pot.
   3. Couvrez les casseroles avec un bouchon en plastique et fixez-les avec du ruban adhésif (Figure 2B).
   4. Des casseroles remplies par autoclave en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes. Laissez refroidir toute la nuit avec des bouchons en plastique sur les casseroles. Re-autoclave en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes. Laissez refroidir complètement. Gardez les pots couverts avec un bouchon en plastique.
      REMARQUE : D’autres substrats de sol peuvent être utilisés, mais la quantité nécessaire par pot doit être optimisée à l’avance. GNOVA a également été testé avec 800 mL d’argile à 100 % et 1 L de sable à 100 %. D’autres substrats de sol peuvent nécessiter plus de cycles d’autoclave ou différents réglages pour une stérilisation complète.
      ATTENTION : Il faut être prudent lors du retrait des casseroles de l’autoclave, car le matériau sera chaud et les colliers de serrage pourraient se desserrer. Assurez-vous que les pinces de serrage sont bien serrées une fois refroidies avant de prendre les casseroles.
   5. Insérez des pots refroidis dans la base imprimée en 3D. Placez le pot rempli de terre à l’intérieur de la base imprimée en 3D. Tenez le pot par la base, pas par les piliers d’ouverture, car ils sont la partie la plus fragile.
   6. Faites passer le tuyau d’irrigation par l’une des ouvertures inférieures de la base imprimée en 3D (Figure 2C).
      REMARQUE : Ne faites pas d’autoclave sur la base de support imprimée en 3D, car cela pourrait faire fondre la pièce. Les expériences nécessitant des températures supérieures à 60 °C peuvent nécessiter un filament alternatif résistant à la chaleur (voir Tableau des matériaux).
   7. Gardez les pots à température ambiante après l’autoclavage, et ne retirez pas le bouchon en plastique ni la seringue préparée avant la configuration finale de l’expérience.

Figure 2 : Illustration du pot préparé. (A) Fond du pot doublé d’un emballage en fibre de verre pour un tuyau. (B) Le dessus de la casserole fermé avec un bouchon en plastique. (C) Pot vide intégré dans le design final imprimé en 3D de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Préparation du cylindre de verre (à effectuer avant chaque nouvelle expérience)
   1. Couvrez une extrémité du cylindre en verre avec un filtre DW4 pré-découpé et fixez-le à l’aide du ruban vinyle (Figure 3A).
   2. Tournez le cylindre en verre pour qu’il fasse face à l’autre extrémité ouverte et attachez un anneau en coton à l’intérieur du tube, à 14 cm du bord. Fixez l’anneau en coton avec du ruban chirurgical (Figure 3B).
   3. Fermez l’extrémité inférieure du cylindre avec une enveloppe de stérilisation à l’aide de deux élastiques (Figure 3B).
   4. Autoclave les cylindres de verre préparés sur un cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes avant utilisation. Une fois autoclave, conservez les cylindres en verre stériles à température ambiante jusqu’à ce que nécessaire sans retirer l’enveloppe.

Figure 3 : Ensemble cylindre en verre. (A) Extrémité supérieure du cylindre en verre fermée avec un filtre DW4 et du ruban vinyle. (B) Extrémité inférieure du cylindre de verre équipée d’un anneau en coton et fermée avec une enveloppe de stérilisation et des élastiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Préparation du filtre d’irrigation (à effectuer avant chaque événement d’arrosage, à l’exception des étapes 1.4.4–1.4.6, qui ne doivent être faites qu’une seule fois)
   1. Assemblez le porte-filtre en plaçant la membrane filtrante PES (Figure 4A.4) entre le porte-filtre (Figure 4A.5) et le disque filtrant (Figure 4A.3).
   2. Orientez le côté lisse de la membrane filtrante vers la direction de sortie, en veillant à ce qu’elle fasse face au sommet du porte-filtre (Figure 4A.1).
   3. Placez le joint torique (Figure 4A.2) dans le dessus du porte-filtre (Figure 4A.1). Fixez le dessus du filtre au porte-filtre. Serre seulement à la main.
   4. Fixez les connecteurs. Insérez le mascule de la raccorde 2 dans la prise supérieure du porte-filtre.
   5. Fixez un court morceau de tube en silicone à l’extrémité du tuyau du filtre (Figure 4B). Insérez le mâle lure d’un raccord 1 à l’extrémité de l’autre baril de seringue préparé de l’étape 1.1.6 (Figure 4B).
   6. Connectez le filtre au raccord de la pointe du tuyau sur le baril de seringue préparé.
   7. Autoclave les filtres assemblés en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes. Serrez les filtres une fois refroidis et avant utilisation.
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer tous les filtres nécessaires et de les autoclave dans une boîte fermée en polypropylène. Une fois autoclaves, les filtres d’irrigation peuvent rester stériles à température ambiante jusqu’à utilisation, tant que la seringue préparée n’est pas retirée.

Figure 4 : Assemblage du support de filtre. (A) Pièce du porte-filtre démontée : 1. Sommet du porte-filtre, 2. Joint torique, 3. Disque filtrant, 4. Membrane filtrante, et 5. Porte-filtre. (B) Porte-filtre assemblé avec un baril de seringue préparé correspondant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Mise en place de l’expérience

1. Préparez et stérilisez les solutions et matériaux au moins un jour avant la mise en place de l’expérience.
   1. Préparez 0,5X un milieu de croissance de plantes Murashige et Skoog en suivant les instructions du fabricant. Milieu d’autoclave en cycle liquide à 121 °C pendant 30 minutes.
   2. Autoclave le distributeur démonté sur le bouchon de bouteille en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes. Autoclave : 1 L d’eau déionisée en cycle liquide à 121 °C pendant 30 minutes.
   3. Boîte de Petri en verre autoclave, béchers de 500 mL, passoires à thé et pinces à épiler, en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes par jour à l’avance.
      REMARQUE : Sauf indication contraire, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement laminaire en utilisant une technique aseptique.
2. Stériliser les graines en surface.
   REMARQUE : Le protocole de stérilisation des graines en surface dépendra de l’espèce végétale à utiliser. Le système gnotobiotique a été testé avec le blé et le maïs en utilisant les protocoles de stérilisation des semences suivants.
   ATTENTION : Portez une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation de l’eau de Javel et de l’hypochlorite de sodium, car ces substances peuvent être irritantes ou corrosives pour la peau et les yeux. L’éthanol est inflammable ; Ne pas utiliser près de flammes nues.
   1. Stérilisation des graines de^{blé 25}
      1. Remplissez deux gobelettes avec 150 mL d’éthanol à 95 % v/v, un gobelet contenant 150 mL d’eau de Javel ménagère non diluée, et deux gobelets avec 150 mL d’eau.
      2. Placez les graines de blé dans la passoire à thé. Agitez doucement la passoire à thé avec des graines dans un des gobelets contenant 95 % d’éthanol V/V pendant une minute.
      3. Transférez les graines dans un nouveau passoire à thé. Agitez doucement les passoires à thé avec des graines dans de l’eau de Javel pendant 10 minutes.
      4. Transférez les graines dans un nouveau passoire à thé. Agitez doucement les passeurs à thé avec des graines dans l’autre bécher avec 95 % d’éthanol v/v.
      5. Agitez doucement les passoires à thé avec des graines dans de l’eau déionisée stérile pendant 30 secondes. Agitez doucement les passoires à thé avec des graines dans l’autre bécher avec de l’eau déionisée stérile pendant 2 minutes. Placez les graines stériles dans une boîte de pétri vide et stérile.
   2. Stérilisation des graines de^{maïs 26}
      1. Placez les graines de maïs dans un tube conique de 50 mL. Remplissez le tube conique avec de l’éthanol à 70 % v/v. Inversez doucement le tube conique pendant 3 minutes.
      2. Découper 70 % d’éthanol et remplir le tube conique de graines avec 2 % d’hypochlorite de sodium. Inversez doucement le tube conique pendant 3 minutes.
      3. Découper l’hypochlorite de sodium à 2 % et rincer les graines avec de l’eau déionisée stérile. Déverser l’eau et rincer les graines quatre fois. Placez les graines de maïs dans une boîte de Petri stérile.
3. Ajoutez l’inoculum microbien au milieu lorsque cela est applicable.
   REMARQUE : Aucun inoculum microbien n’a été appliqué lors de l’optimisation et des tests de stérilité du système gnotobiotique.
4. Assemblez les distributeurs de bouchons et fixez-les aux bouteilles de support.
   REMARQUE : Comme il s’agit d’un système ouvert, nous recommandons d’avoir un récipient pour collecter le média de flux direct. Nous avons constaté que l’utilisation d’une plaque de cuisson fonctionne bien et permet un mouvement facile, mais cela nécessite de la vider fréquemment.
5. Retirez le bouchon en plastique de la casserole et versez 378 mL de médium dans la casserole.
   REMARQUE : Cela correspond à environ 70 % d’espace poreux rempli d’eau (WFPS), qui doit être ajusté lors de l’utilisation d’autres substrats de sol. Utilisez 360 mL pour l’argile et 358 mL pour le sable.
   1. Semez la graine stérilisée à la profondeur appropriée à l’aide d’une pince à épiler stérile.
   2. Semez le blé à une profondeur de 1/2 pouce et le maïs à une profondeur de 1 pouce. Sinon, semez des semis pré-germés stériles dans la GNOVA. Utilisez des graines pré-germées pour les tests de croissance du maïs.
   3. Remettez le bouchon en plastique sur le dessus du casserole.

3. Assemblage final et opération expérimentale

1. Transférez le pot et le cylindre en verre dans une chambre de croissance. Tiens le cylindre en verre avec le fond vers le bas, près du pot.
2. Retirez rapidement le bouchon en plastique du pot et le film de stérilisation du cylindre en verre. Baissez le cylindre en verre sur le dessus, en le posant sur le rebord de la base imprimée en 3D.
   REMARQUE : Une flamme (par exemple, un brûleur Bunsen portable) peut également être placée à côté de la casserole lors de l’assemblage final du système de croissance afin de réduire davantage le risque de contamination.
   ATTENTION : Assurez-vous qu’en travaillant avec une flamme nue, aucun autre matériau inflammable ne soit à proximité. Faites attention à la position de la flamme par rapport à votre corps pour éviter les brûlures.
3. Faites pousser les plantes entre 4 et 17 semaines, selon l’espèce, en utilisant des conditions de croissance spécifiques à chaque espèce.
4. Cultivez le blé à des températures jour/nuit de 22 °C/16 °C et le maïs à 27 °C/23 °C. La photopériode pour les deux plantes est de 12 h uniquement sous des néons.

4. Irrigation

1. Fixez un long tube en silicone au distributeur de bouteilles.
2. Maintenez la stérilité lors de l’arrosage à l’aide d’une flamme portable. Si une flamme portable n’est pas envisageable, effectuez une irrigation à l’eau de Javel pour maintenir la stérilité.
3. Irrigation à l’aide d’une flamme portable.
   ATTENTION : Travaillez avec prudence autour de la flamme ouverte pour éviter les blessures corporelles et les dommages aux installations.
   1. Placez la flamme près de la conduite d’irrigation. Retirez le baril de la seringue de la conduite d’irrigation et du porte-filtre. Gardez toutes les extrémités des tubes dans la zone de flamme.
   2. Fixez le porte-filtre à la conduite d’irrigation. Reliez les deux canons de seringues entre eux. Connectez l’autre long tube en silicone sur le distributeur de bouteille à l’orifice inférieur du porte-filtre.
   3. Distribuez 150 mL de substrats Murashige et Skoog 0,5X. Séparez les deux canons de seringue.
   4. Détachez le tube en silicium du porte-filtre et remplacez-le par un seul fût de seringue.
4. Irrigation à 10 % d’eau de Javel
   REMARQUE : Nous recommandons d’utiliser cette stratégie d’irrigation dans de grandes expériences (n > 50) pour augmenter le débit pendant l’arrosage.
   ATTENTION : Portez une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation de l’eau de Javel.
   1. Distribuez une solution d’eau de Javel à 10 % en V/V dans deux petits béchers en plastique et placez-les près de la ligne d’irrigation. Retirez le baril de la seringue de la conduite d’irrigation et du porte-filtre.
   2. Immergez toutes les extrémités du tube dans la solution d’eau de Javel à 10 % jusqu’à ce que ce soit nécessaire. Secouez l’excès de solution d’eau de Javel. Fixez le porte-filtre à la conduite d’irrigation du pot.
   3. Connectez l’autre long tube en silicone du distributeur de bouteille à l’orifice inférieur du porte-filtre.
   4. Distribuez 150 mL de substrats Murashige et Skoog 0,5X. Détachez le tube en silicium du porte-filtre.
      REMARQUE : Le volume d’irrigation est de 120 mL pour le sable et 360 mL pour l’argile.
   5. Remplacez le filtre dans la conduite d’irrigation par un fût à seringue après avoir secoué l’excès d’eau de Javel.
      REMARQUE : Si le volume d’irrigation change, il faut prévoir environ 20 mL de milieu pour amorcer la conduite d’irrigation.
5. Irriguer les pots une fois par semaine. Ajustez le volume et la fréquence d’irrigation en fonction de l’objectif de l’expérience et du substrat du sol utilisé. Si vous utilisez 100 % de sable, augmentez la fréquence d’irrigation à deux fois par semaine.

5. Récolte

REMARQUE : Ce protocole de récolte a été suivi lors des tests et de l’optimisation du système gnotobiotique. Le protocole de récolte doit être modifié pour s’adapter à des objectifs de recherche spécifiques et au volume d’échantillons traités.

1. Préparez et stérilisez toutes les solutions et matériaux au moins un jour avant la récolte.
   1. Autoclave : 4 L d’eau déionisée et 500 mL de 0,145 M NaCl, dans un cycle liquide à 121 °C pendant 30 minutes par jour à l’avance.
   2. Ciseaux et pinces autoclave en cycle sec à 121 °C pendant 30 minutes par jour à l’avance.
      REMARQUE : Sauf indication contraire, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement laminaire en utilisant une technique aseptique. Si la stérilité n’est pas nécessaire pour la collecte des échantillons, toutes ces étapes peuvent être effectuées en dehors d’une hotte à écoulement laminaire.
2. Transférez les systèmes gnotobiotiques de la chambre de croissance au laboratoire et placez-les près de la capot à flux laminaire.
3. Retirez le cylindre en verre du pot et placez rapidement le pot dans la hotte à flux laminaire. Retirez le pot de la base imprimée en 3D.
4. Maintenez la plante à la base et versez le substrat de terre dans un pot. Secouez doucement les gros touffes de substrat de terre des radics.
   REMARQUE : Les échantillons de substrat de sol peuvent être collectés et traités selon l’objectif spécifique de recherche à cette étape de la récolte. Le protocole brièvement décrit ici était utilisé pour tester la stérilité des sols.
5. Récolte du sol pour le comptage des^{bactéries du sol 27} en utilisant une seule plaque de dilution en série²⁸.
   1. Remplir les puits d’une plaque à 96 puits avec 270 μL de 0,145 M NaCl. Laisse la première rangée vide. Ajoutez 1 g de substrat de sol à un tube conique de 15 mL avec 9 mL de 0,145 M de NaCl.
   2. Vortex à vitesse maximale pendant 5 minutes. Transférer 30 μL de l’échantillon dans un puits vide de la plaque à 96 puits.
   3. Préparez sept dilutions en série de chaque échantillon en pipettant 30 μL de chaque échantillon dans le puits en dessous contenant 270 μL de solution de NaCl.
   4. Mélangez bien en faisant du pipette entre chaque transfert.
   5. Préparez un spotting de dilution en série sur une seule plaque de chaque échantillon en plaquant 10 μL de chaque dilution en série sur une seule plaque R2A.
   6. Inclinez les plaques pour répartir les gouttes. Incubez les plaques à température ambiante.
   7. Compter les unités formant des colonies (UFC) et calculer l’UFC/g du sol.
6. Séparez les pousses des racines à l’aide de ciseaux stériles. Record du poids de tournage frais.
7. Nettoyez les racines en les secouant doucement dans un bécher avec de l’eau déionisée. Séchez les racines sous sécher et enregistrez un poids frais.
   REMARQUE : Le matériel en surface et en souterrain peut être collecté à ce stade et traité selon la méthodologie la plus appropriée à l’analyse en aval d’intérêt.

Résultats

Nous avons développé GNOVA, un nouveau système gnotobiotique pour plantes, qui permet l’environnement stérile et contrôlé nécessaire pour examiner les interactions plante–microbe. Ce nouveau système offre 24,4 pouces (62 cm) d’espace vertical pour les pousses et un pot de 1,3 L compatible avec plusieurs substrats de sol. Le système entièrement assemblé mesure environ 3 pieds de haut (92,4 cm) et 4,57 pouces (11,6 cm) de large (figure 5A–C). Comparé à d’autres systèmes, il possède la plus grande capacité verticale pour la croissance des pousses et la deuxième plus grande chambre racinaire (Tableau Supplémentaire 1). GNOVA ne nécessite que 0,0135^m2 de surface dans la chambre de croissance, rendant ainsi ce système compact et maniable. Ce système peut être utilisé dans des chambres de croissance à pénétration avec un dégagement vertical de 1,22 m. Tous les composants de ce système, à l’exception de la base imprimée en 3D, sont autoclavables et compatibles avec des autoclaves de dimensions de 24 pouces × 24 pouces × 36 pouces (largeur × longueur × hauteur ; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Cela simplifie la configuration expérimentale en contournant la stérilisation manuelle des pièces individuelles. De plus, la plupart des composants de ce système sont réutilisables, ce qui maintient le coût d’utilisation par expérience à environ 6 USD après le coût initial de mise en place de 54 USD par unité (Tableau Supplémentaire 2). Les conditions environnementales au sein de GNOVA ont été déterminées en suivant la température et l’humidité relative du système avec une plante de maïs vieille d’une semaine pendant trois jours. La température à l’intérieur de GNOVA était, en moyenne, de +1,3 °C supérieure à celle de la chambre de croissance (Figure supplémentaire 1). Les différences de température au sein du système et de la chambre étaient plus importantes pendant le cycle lumineux (moyenne de +2,5 °C) que pendant le cycle sombre (moyenne de +0,4 °C). L’humidité relative dans la GNOVA était en moyenne de 63 %, contre 34 % dans la chambre de croissance.

Figure 5 : Rendus du système GNOVA. (A) Modèle 3D de la conception finale de la base de support (B) Coupe transversale du modèle 3D de la base de support (C) Coupe transversale du modèle 3D de GNOVA entièrement assemblé Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour garantir la stérilité du système, nous avons mené un essai de quatre semaines sur des systèmes non irrigués et irrigués sans plantes. La contamination sur le cylindre de verre a été déterminée par prélèvement au-dessus et en dessous de l’anneau de coton via un cotonnage direct par cotonnage. Aucune croissance microbienne détectable au-delà de trois colonies (c’est-à-dire une seule colonie par tiers de surface échantillonnée) n’a été observée au-dessus de l’anneau de coton, tant pour les échantillons non irrigués (n=4) que pour les échantillons irrigués (n=6) (Figure supplémentaire 2A). Sous l’anneau cotonnier, une croissance a été observée dans une réplique non irriguée, tandis qu’aucune croissance n’a été détectée dans les systèmes irrigués (Figure supplémentaire 2B). Cela suggère un faible potentiel de contamination provenant du cylindre de verre, car la croissance microbienne n’était présente que dans des répliques limitées sous l’anneau de coton, qui n’est pas en contact avec la plante. La contamination du sol a été évaluée en observant des dilutions en série sur les plaques R2A (Figure 2C supplémentaire). Aucune croissance microbienne substantielle n’a été détectée dans l’une ou l’autre des conditions, à l’exception d’une seule réplique irriguée avec un nombre d’unités formant une colonie non marquable issue de dilutions sérieuses (c’est-à-dire < 30 colonies). En plus des tests de stérilité, nous avons réalisé une comparaison des performances du blé et du maïs cultivés dans GNOVA selon notre protocole standard de croissance gnotobiotique de deux semaines dans un système^{de sac 19}. Pour comprendre l’effet de la petite taille et du manque d’irrigation sur la performance des plantes, nous avons étendu les périodes de croissance dans le sac pour correspondre à celles de GNOVA. Même si la teneur initiale en eau du sol utilisée lors de la mise en place des deux systèmes était correspondante, GNOVA recevait une fertigation hebdomadaire, alors que les sacs ne l’étaient pas. Pour toutes les comparaisons, nous utilisons le système de sacs comme référence, car c’était la configuration gnotobiotique initiale de notre laboratoire. Le blé et le maïs ont tous deux atteint 100 % de germination dans le GNOVA, tandis que dans le système de sac, le blé n’a atteint que 67 % (n = 3) et le maïs 75 % (n = 8) (Figure 6).

Figure 6 : Germination du blé (n = 3) et du maïs (n = 8) dans le système GNOVA (violet) et le système en sacs (vert). Le résultat de germination de chaque réplication est représenté par des points sur l’axe y, soit comme « Pas de germination » soit « Germé » pour chaque système gnotobiotique. Les barres représentent le taux de germination ( %) de chaque espèce végétale au sein de différents systèmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Un test de croissance pour le blé et le maïs a également été réalisé afin de déterminer la période maximale viable de croissance et la performance des plantes dans le GNOVA. Même si notre protocole standard de sac ne prévoit que deux semaines de croissance, nous avons prolongé la période de croissance au sein des sacs au-delà de deux semaines pour une meilleure comparaison entre les deux systèmes. Après deux semaines, le blé cultivé dans GNOVA (n=3) avait déjà atteint le stade de croissance de Zadock (GS) 13 (Figure 7A), alors qu’il restait dans le sac à GS11. À la cinquième semaine, les plantes avaient atteint GS21 dans les systèmes GNOVA, comme l’indique l’apparition des tillers (Figure 7B). En revanche, les tillers étaient absents des systèmes de sacs, et les usines sont restées en GS13. Ce retard de croissance et l’absence de changements phénologiques dans le système des sacs ont conduit à l’arrêt des plantes dans ce système à la sixième semaine. Les plants de blé ont continué à pousser pendant encore cinq semaines dans la GNOVA, où une augmentation du nombre de feuilles et de la biomasse a été observée (Figure 7C). Bien que la biomasse de blé ait augmenté visuellement après 12 semaines de croissance dans la GNOVA, les plantes ont également commencé à présenter plus de feuilles chlorotiques, et le volume du cylindre de verre a été comblé par la biomasse végétale (Figure 7D). Le blé a été cultivé pendant deux semaines supplémentaires par la suite (figure 7E, F). Cependant, il n’y a pas eu d’augmentation visuelle de la biomasse, et le test de croissance a donc été interrompu à 17 semaines de croissance. La croissance du maïs a également été évaluée dans le cadre de GNOVA pendant quatre semaines et comparée au maïs cultivé en sacs (Figure 8A,B). Dans cette expérience, les graines de maïs ont été stérilisées et pré-germées avant de les semer dans le système GNOVA ou dans le système de sac. Le poids des pousses fraîches et des racines du maïs différait significativement entre les deux systèmes (test t à deux échantillons, valeur p < 0,05, tableau supplémentaire 3). Le maïs cultivé en GNOVA avait des pousses et des racines fraîches pesant en moyenne respectivement 11,2 g et 5,7 g (Figure 8C,D). En revanche, les pousses et racines de maïs cultivées dans le sac avaient des poids frais de 1,29 g et 1,15 g respectivement. Globalement, la biomasse fraîche de maïs cultivée dans le GNOVA a augmenté de 593 % par rapport au maïs cultivé dans le système de sac. De plus, la longueur des pousses et des racines était significativement plus grande dans la GNOVA que dans les poches, respectivement de 89 % et 57 % (Figure 8E,F).

Figure 7 : Croissance du blé dans le prototype GNOVA. (A) Blé à deux semaines au stade de croissance (GS) 13 de Zadock. (B) Comparaison du blé après cinq semaines de croissance dans un sac et de GNOVA. Les motoculteurs sont présents dans GNOVA (GS21) et absents dans le sac (GS13). (C) Augmentation de la biomasse de blé à 10 semaines de croissance. (D) Augmentation de la biomasse de blé à 13 semaines de croissance avec l’apparition de feuilles chlorotiques. (E) Augmentation supplémentaire de la biomasse de blé à 15 semaines de croissance. F) La biomasse de blé occupe la majeure partie du volume de croissance disponible à 17 semaines de croissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Croissance du maïs à l’intérieur du prototype GNOVA (violet) par rapport au système de sac (vert). Les barres indiquent les valeurs moyennes ±erreur standard (n=4) (A) Le maïs cultivé pendant quatre semaines dans le système GNOVA et le système de sac. (B) Comparaison de la taille des plantes récoltées cultivées en GNOVA et en système de sac. (C) Poids de pousse fraîche (Moyen±SE). (D) Poids des racines fraîches (Moyen±SE). (E) Longueur du tir (Moyenne±SE). F) Longueur de racine (moyenne±SE). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Dynamique temporelle de l’humidité relative et de la température mesurée dans la GNOVA (violet) et la chambre de croissance (orange). Les données étaient enregistrées à intervalles de cinq minutes pendant trois jours. Les données de GNOVA ont été enregistrées avec une plante de maïs âgée de sept semaines. Les zones ombragées en bleu clair correspondent aux périodes nocturnes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Croissance microbienne résultant des tests de stérilité de la GNOVA sans irrigation des plantes (Contrôle) et avec irrigation (Irrigué). (A) Échantillons de cylindres de verre au-dessus de l’anneau en coton. (B) Échantillons de cylindres en verre sous l’anneau de coton. (C) Placage en série à dilution sur plaque unique des échantillons de sol. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Comparaison des caractéristiques de GNOVA avec d’autres gnotobiotiques végétaux existants (EcoFAB, boîtes magenta, sacs, FlowPot, GnotoPot et EcoFAB 3.0). Les systèmes sont comparés à travers des paramètres clés pertinents pour la conception expérimentale, tels que la capacité de hauteur des plantes, la capacité du volume racinaire et le contrôle de l’irrigation. Les informations ont été compilées à partir de la littérature publiée et des descriptions de systèmes disponibles ; lorsque les données n’ont pas été explicitement communiquées, des estimations sont indiquées. † Meilleure approximation lorsqu’elle n’est pas spécifiée dans la littérature ; ‡ Le système n’a pas besoin d’être démonté ou déplacé vers une hotte à flux laminaire pour effectuer la tâche ; * Possible avec des modifications du système ; Les catégories de coûts sont définies comme : faible (< 30 USD par unité), moyen (30-100 USD par unité), élevé (> 100 USD par unité) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Bénéfice (BOM) et coûts estimés d’assemblage et d’exploitation d’une seule unité GNOVA. Les matériaux sont classés en composants réutilisables ou à usage unique, avec un coût unitaire correspondant, des quantités requises par système et un coût total par système. Les composants réutilisables contribuent au coût initial de mise en place, et les matériaux à usage unique représentent le coût consommable par expérience. * calculé à partir de prix en gros négociés pour des tarifs rentables ; ** La quantité nécessaire varie selon la durée de l’expérience, le substrat utilisé et l’objectif de recherche. Valeur pour une expérience de quatre semaines avec un programme d’irrigation hebdomadaire utilisant le mélange d’argile et de sable ; † Coût approximatif de la quantité de matériau nécessaire par système ; ‡ N’inclut pas le prix de la solution nutritive ni du substrat du sol, car cela variera selon l’objectifexpérimental. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 3 : Les valeurs p résultantes du test t à deux échantillons pour la croissance du maïs mesuraient les variables cultivées dans GNOVA et le système de sac. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le système gnotobiotique végétal présenté ici, GNOVA, offre un outil accessible et polyvalent pour étudier les interactions plante-microbe dans les cultures céréalières. Ses caractéristiques principales incluent une capacité de croissance accrue et une irrigation intégrée, prolongeant la croissance des céréales au-delà du stade de semis dans des conditions stériles. Les performances de ce système sont comparables à celles de l’EcoFAB 3.0 et offrent un système gnotobiotique alternatif et accessible pour les plantes. Le système est construit à partir de composants disponibles dans le commerce, sélectionnés pour leur coût, leur simplicité et leur compatibilité avec les autoclaves de taille moyenne, facilitant ainsi l’adoption dans les laboratoires. L’assemblage et l’exploitation sont simples et ne nécessitent pas d’équipement spécialisé, réduisant ainsi les obstacles à la mise en œuvre. GNOVA peut être adapté pour répondre à différents objectifs de recherche grâce à sa compatibilité avec une large gamme de substrats de sol, des protocoles de stérilisation des semences, des inoculants microbiens (sans germes, SynCom ou communauté naturelle), et des analyses diverses en aval.

Une contamination minimale est essentielle dans les expériences gnotobiotiques végétales afin de garantir que les effets observés puissent être attribués aux microbes d’intérêt et non aux contaminants. La simplicité de fonctionnement de GNOVA réduit le risque de contamination. Un respect strict de la technique aseptique et les recommandations clés suivantes garantiront le maintien de la stérilité. Lors de la mise en place de l’expérience, nous recommandons la désinfection de la cagouille à flux laminaire entre les inoculants microbiens afin de minimiser la contamination croisée des traitements. L’ordre dans lequel les traitements sont appliqués peut également diminuer la contamination croisée. Il est idéal d’appliquer des traitements sans germes avant tout traitement à des microbes vivants. Des microbes étrangers peuvent également être introduits via des graines. Les protocoles de stérilisation des graines de surface doivent donc être optimisés pour chaque espèce de plante ou source de graines afin d’équilibrer stérilité et^{germination 26}. Les protocoles de stérilisation pour les céréales non modèles, telles que le^{sorgho 24},^{l’orge 29}, le sorgho et l’avoine²³ , peuvent être facilement mis en œuvre dans la GNOVA. Si la stérilisation a un impact négatif sur la germination, des graines pré-germées peuvent être utilisées à la place. L’irrigation représente une source majeure de contamination dans les systèmes gnotobiotiques. Le point le plus critique de ce processus est l’attache des filtres aux conduites d’irrigation. Les extrémités tubulaires des conduites d’irrigation et des filtres doivent rester stériles pendant ce processus. La stérilisation à la flamme nécessite de la dextérité et peut être laborieux, notamment dans les grandes expériences (n >50). Par conséquent, la méthode alternative à base d’eau de Javel est recommandée pour les grandes expériences ou lorsque la stérilisation à la flamme n’est pas pratique. Il est également recommandé de maintenir des filtres stériles supplémentaires et de disposer d’eau de Javel ou d’éthanol lors de l’arrosage en cas de contamination lors de la manipulation des matériaux du système. De plus, l’inclusion d’unités de contrôle de la contamination (c’est-à-dire pas de plante, pas de traitement des microbes et irrigation recevante) est fortement recommandée pour surveiller la stérilité et identifier les contaminants.

Pour pallier le risque de contamination par irrigation, les premiers systèmes gnotobiotiques des plantes étaient complètement fermés et manquaient de capacité d’irrigation, ce qui limitait la durée des expériences. Le maïs a été cultivé de façon gnotobiotique dans des^{sacs 19, 30}, des tubes en verre et des boîtes de Petri¹⁵ entre deux et quatre semaines. Afin de reconstituer l’eau et les nutriments pendant la croissance des plantes, des systèmes alternatifs tels que l’EcoFAB²³, le FlowPot et le^{GnotoPot 21} ont permis l’irrigation par démontage partiel à l’intérieur des hottes à écoulement laminaire. Cela limitait leur taille et leur compatibilité avec les plantes plus grandes. Comme les conduites d’irrigation sont facilement accessibles en dehors de la GNOVA, le démontage n’est pas nécessaire, et le système n’est pas limité aux tailles des hottes à écoulement laminaire. Cela permet non seulement un apport continu en nutriments et en eau, mais augmente aussi l’espace de croissance disponible. Une réduction de l’espace des pousses peut diminuer la capacité photosynthétique et contribuer au retard^{de croissance 24}, et la restriction de volume raciculaire peut entraîner un liaison racinaire et réduire l’absorption d’eau et^{de nutriments 31}. La combinaison d’un espace de croissance réduit et d’un manque d’irrigation dans le système de sacs pourrait expliquer la diminution de la biomasse et l’absence de progression phénologique du maïs et du blé par rapport au système GNOVA. Ce nouveau système a permis une croissance gnotobiotique du maïs pendant une durée comparable à celle du sorgho dans EcoFAB 3.0²⁴. De plus, elle dépasse la croissance gnotobiotique du blé pendant quatre semaines dans un système hydroponique (20) dans un système de sol plus représentatif. En plus des contraintes physiques, les systèmes gnotobiotiques reposent souvent sur un flux d’air restreint pour maintenir la stérilité. Un flux d’air limité peut entraîner une augmentation de la température et de l’humidité, ainsi qu’une baisse des taux d’échange gazeux, ce qui pourrait impacter la physiologie des^plantes. Une croissance améliorée a été rapportée dans des systèmes à flux d’air amélioré, tels que les boîtes magenta équipées de filtres^{HEPA 33} qui fonctionnent de manière similaire au filtre DW4 utilisé dans GNOVA. De même, EcoFAB 3.0 présentait une augmentation de la température et de l’humidité relative mais restait considéré comme une plateforme robuste pour la croissance gnotobiotique du^{sorgho 24}. Cela suggère que, bien que des contraintes physiques et environnementales persistent au sein des systèmes gnotobiotiques, les avancées dans la conception des systèmes présentées ici offrent encore des conditions améliorées qui favorisent plus efficacement la croissance gnotobiotique des céréales.

La facilité de modification est une autre caractéristique clé de GNOVA. La modularité de sa conception permet aux utilisateurs d’apporter des modifications à des pièces individuelles pour mieux répondre à leurs besoins de recherche et à leur budget. Ce système est compatible avec tout substrat de sol, y compris les sols naturels. Les modifications du volume d’installation, de la concentration de la solution nutritive, ainsi que du volume et de la fréquence d’irrigation doivent être basées sur les propriétés physico-chimiques du sol, car elles influencent directement la disponibilité et la distribution des nutriments et de^{l’eau 34}. La sécheresse peut être induite en surveillant le poids de l’ensemble du système GNOVA et en déterminant gravimétriquement la teneur en eau du sol^{à 35}. Les exsudats radicaux peuvent être collectés de manière destructive en incubant les plantes récoltées dans de l’eau ultrapure³⁶ ou en rinçant le système pour obtenir des lichats non^{stériles 37}. Si des exsudats stériles sont nécessaires, le pot et la base de support imprimée en 3D de GNOVA peuvent être modifiés pour intégrer une fonction intégrée de collecte d’exsudats similaire à celle du design de l’EcoFAB 3.0²⁴. Les scientifiques souhaitant comprendre les effets^{prioritaires 38} sur l’assemblage des communautés microbiennes peuvent installer des conduites d’irrigation supplémentaires autour du pot. Cela permet d’appliquer ultérieurement des inoculants microbiens tout en maintenant la stérilité de la conduite d’irrigation principale. Les conditions environnementales pourraient être surveillées en installant des capteurs de température sans fil désinfectés et d’humidité relative dans GNOVA. Sinon, remplacer le cylindre en verre par une chambre en polycarbonate et percer les orifices^{d’échantillonnage 24} permettrait de mesurer l’environnement et d’échantillonner les gaz. Cela pourrait permettre la quantification de gaz et de composés volatils, tels que le CO₂, l’O2 et l’éthylène, avec le potentiel d’influencer la performance de ^{l’usine 33}. Le débit d’air vers le système peut également être augmenté en retirant l’anneau en coton dans le cylindre en verre. Cependant, chacune de ces modifications pourrait augmenter le risque de contamination et n’a pas encore été validée ou optimisée dans GNOVA.

Malgré les avantages et la polyvalence de GNOVA, quelques limites doivent être prises en compte. Il convient de noter que ce système convient mieux à une utilisation dans des chambres de croissance contrôlée, car des conditions non contrôlées dans la serre ou le champ pourraient affecter ses performances. Bien que le blé ait pu se développer dans le système pendant 17 semaines, des signes de stress ont été observés vers 12 semaines de croissance. Par conséquent, le blé ne doit pas être cultivé au-delà de 12 semaines. De plus, le maintien de la stérilité n’a été confirmé que par quatre événements d’irrigation hebdomadaires sur une période de croissance de quatre semaines ; Les expériences plus longues comportent un risque accru de contamination. Même si la capacité de volume radiculaire augmentée par la GNOVA, la restriction radiculaire reste possible, et une évaluation temporelle de la morphologie racinaire peut aider à déterminer des durées de croissance optimales qui minimisent la liaison racinaire. De plus, certaines modifications du système, comme le remplacement du cylindre en verre par un cylindre en polycarbonate, peuvent augmenter le coût d’installation à plus de 100 USD par unité. Actuellement, GNOVA ne permet que l’échantillonnage destructif des points finaux, ce qui augmente les besoins en main-d’œuvre et en réplication pour les études temporelles de dynamique microbienne, de schémas d’exsudation ou de surveillance de la stérilité. Enfin, maintenir la stérilité lors de l’installation, de l’irrigation et de la récolte prend du temps, et même des systèmes simplifiés comme GNOVA nécessitent un effort dédié, ce qui augmente les coûts globaux d’exploitation. Collectivement, ces limitations doivent être prises en compte lors de l’adoption de ce système. De plus, les contraintes environnementales causées par la croissance gnotobiotique doivent être prises en compte lors de la planification des expériences et de l’interprétation des résultats, car elles peuvent influencer la physiologie des plantes et, par conséquent, son microbiome associé.

GNOVA offre une plateforme gnotobiotique polyvalente compatible avec les cultures céréalières. Le système permet la récupération de systèmes racinaires presque intacts, adaptés aux outils d’analyse de l’architecture racinaire tels que RhizoVision explorer³⁹ et ARIA⁴⁰, permettant la caractérisation de la morphologie racinaire en réponse à divers inoculants microbiens et conditions environnementales. Combiné aux SynComs et aux analyses multi-omiques, la GNOVA facilite l’identification des liens mécanistiques entre les effecteurs microbiens et les réponses des plantes. Des SynCom plus larges (>100 membres) associés à l’analyse métagénomique ^41,42,43 peuvent être utilisés pour examiner les schémas de cooccurrence et identifier des microbes d’importance écologique dans différentes ^{conditions 5,44}. En revanche, des SynCom plus petits (souches <50) combinés avec les métatranscriptomiques^45,46, métaprotéomiques 19,47,48 et métabolomiques 49,50,51 permettent une caractérisation détaillée de la réponse fonctionnelle chez les plantes et les microbes ⁴⁴. Ensemble, ces capacités font de GNOVA un outil précieux pour l’identification de caractéristiques microbiennes clés pouvant accélérer le développement de nouveaux bioinoculants favorisant la durabilité des systèmes agricoles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Powerconnect cordless drill & kit de 100 pièces	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" et 1/8" forets nécessaires.
Ruban adhésif vinyle, jaune, 1" de large x 36 verges	3M	471	Matériel consommable
Élastiques Sterling taille #32  (2 élastiques par système)	Amazon	B001I1QO00	Matériel consommable.
Graines de blé			Cultivar utilisé dans cette expérience: Catawba
Isolation d'enveloppe de tuyau en fibre de verre, 3 " de largex 1/2 " d'épaisseur  (2 cercles pré-découpés par système)	Lowe's	28930	Coupé en 2 cercles de 7/8 " (7,3 cm) de diamètre. Matériel consommable. Pour une production à haut débit de cercles, déroulez l'isolant enveloppe et utilisez le bord ouvert du pot pour couper le cercle en plaçant le pot sur le haut de l'isolant enveloppe et en appliquant une pression et en tordant.
Média filtrant DW4, pré-découpé à 15" x 75 verges  (1 cercle coupé par système)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Coupé en cercles de 6,3 " (16,02 cm) de diamètre. CBC a d'autres tailles pré-découpées ou rouleaux standard qui peuvent être achetées à la place si désiré.  Matériel consommable. découpez un modèle du cercle dans du carton et utilisez-le pour dessiner des cercles dans toute la zone du média DW4 et coupez avec des ciseaux.
Tube en silicone, Versilon SPX-50 haute résistance, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" d'épaisseur de paroi	Saint-Gobain	ABX00007	Coupé en deux longs morceaux ( 16" // 40,64 cm) et trois morceaux courts (2,5" // 6,35 cm)
Hypochlorite de sodium 5% de chlore disponible en solution aqueuse	VWR	JT9416-1	Dilué à 2% v/v et utilisé pour le protocole de stérilisation du maïs
Milieu de Murashige & Skoog, éléments micro et macro. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Dilué à 0,5x la force
Éthanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Dilué à 95% v/v
Seringue 3 mL, luer lock non stérile  (2 par système)	Fisher scientific	14-817-117	Jetez le piston et ne gardez que le baril, remplissez de laine de verre et fermez avec du papier aluminium.
Béchers en verre, 250 mL	VWR	470191-150	Cinq sont nécessaires pour la stérilisation des graines de blé
Graines de maïs			Génotype utilisé dans cette expérience: Mexico 21–22 B73XMo17
Plateau de cuisson en aluminium 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Assurez-vous qu'il correspond aux dimensions de votre hotte à flux laminaire
Chlorure de sodium	Fisher scientific	BP358-1	Préparez une solution à 0,145 M.
Base imprimée en 3D, filament en acide polylactique (PLA) utilisé (1 par système)	Protolabs	NA	L'impression et les fichiers modifiables peuvent être trouvés dans les documents supplémentaires. Les fichiers sont disponibles sur Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. NE PAS AUTOCLAVER si du PLA a été utilisé comme filament pour produire la base. Le PLA fond au-dessus de 150 °C et peut se déformer au-dessus de 60 °C. Il est recommandé de tester l'intégrité de la base imprimée en 3D en PLA si elle doit être utilisée à des températures supérieures à 40 °C. Pour une résistance à la chaleur plus élevée, des matériaux tels que le PETG (polyéthylène téréphtalate glycol) ou le PC (polycarbonate) peuvent être utilisés à la place; cela augmentera le coût de la pièce et pourrait toujours ne pas être autoclavable. L'impression 3D des prototypes de base a été réalisée dans une imprimante personnelle avec des volumes de construction de 256 × 256 × 256 mm (longueur × largeur × hauteur). Pour la rapidité et l'efficacité des coûts, nous recommandons l'impression en masse auprès de fournisseurs de services d'impression 3D commerciaux locaux.
Raccord mâle luer à raccord barbelé 1/8 " ID, polypropylène sans dérivés animaux  (2 par système)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Dénommé raccord 1 dans le protocole
Raccord mâle glissant luer à raccord barbelé 1/8 " ID, polypropylène sans dérivés animaux  (1 par système)	Cole-Parner	EW-50114-63	Dénommé raccord 2 dans le protocole
Serre-tubes à engrenage à vis sans fin en acier inoxydable 201, 1 1/2" -3 1/2" diamètre de serrage (1 par système)	Grainger	5CZF2	Dénommé serre-tubes dans le protocole
Armoire à flux laminaire Airstream Gen 3 avec commutateur simple, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Dénommé hotte à flux laminaire dans le protocole. Toute hotte à flux laminaire de dimensions similaires fonctionne. Des modifications pourraient être nécessaires dans les hottes à flux plus petites.
Sable de jeu, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Dénommé sable dans le protocole
Fil en acier inoxydable tissé, 120 mailles (1 par système)	Amazon	B09KRS5F7T	Dénommé maille en acier inoxydable dans l'article. Coupé en cercles de 4,7" (11,9 cm) de diamètre. Pour un débit élevé ou une production de cercles, découpez un modèle du cercle dans du carton et utilisez-le pour dessiner des cercles dans toute la zone en maille tissée du tissu maillé et coupez avec des ciseaux.
Argile (Montmorillonite), OIL-DRI Sorbent en vrac, 50 lb de poids, non