Article de méthode

Combiner les injections de collagénase avec la surcharge mécanique induite par l’exercice : un modèle murin simulant la surcharge Traumatisme, lésions de stress et arthrose du genou

DOI :

10.3791/70609

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22 mai 2026

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1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Acupuncture and Massage, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Rehabilitation Medicine, Shanghai Pudong Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle murin d’arthrose du genou induite par stress surcharge, en combinant des injections de collagénase intraarticulaire avec une surmence induite par l’exercice, fournissant une plateforme minimalement invasive pour étudier la pathogenèse dégénérative.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’arthrose du genou (KOA) est une maladie articulaire dégénérative multifactorielle provoquée par l’interaction complexe de la dégradation biologique des tissus et de la surcharge mécanique soutenue. Les modèles animaux chirurgicaux conventionnels induisent souvent une destruction articulaire post-traumatique déclenchante, ce qui ne reproduit pas avec précision la pathogenèse progressive et cumulative de l’KOA dégénératif humain. Pour combler cet écart de traduction, la présente étude établit un modèle murin nouveau et reproductible simulant le KOA induit par la surcharge en synergisant la dégradation légère du cartilage enzymatique avec une charge mécanique soutenue. Plus précisément, des injections intra-articulaires standardisées de collagénase de type II étaient associées à un sureffort mécanique quotidien via un appareil de fatigue de type rotateur strictement calibré sur une période de quatre semaines. L’efficacité de cette intervention à double facteur a été validée grâce à des analyses comportementales, histologiques et moléculaires complètes. L’analyse automatisée de la démarche a révélé de graves déficits locomoteurs dans le groupe combiné. Ces mesures se caractérisaient par des réductions significatives de la longueur de foulée, de la largeur de foulée et de la surface maximale de la patte. Des évaluations histomorphologiques utilisant la coloration safranine O-fast green ont confirmé ces déficits fonctionnels, montrant des dommages structurels progressifs au cartilage, des défauts de surface et des scores significativement élevés de l’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) qui reflètent fidèlement les caractéristiques pathologiques des KOA humains en début à milieu de stade. De plus, des évaluations immunohistochimiques ont démontré une marquée régulation à la hausse du canal mécanosensible Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) et une réduction concomitante de la protéine cruciale Collagène II Alpha 1 (COL2A1) dans les chondrocytes articulaires. En intégrant une instabilité articulaire localisée avec un stress mécanique contrôlé, cette stratégie mini-invasive évite les traumatismes aigus associés aux modèles chirurgicaux. Ce protocole établit une plateforme expérimentale cliniquement pertinente pour suivre les mécanismes moléculaires dynamiques, évaluer les phénotypes de la douleur chronique et tester des interventions thérapeutiques à long terme pour l’arthrose en phase précoce.

Introduction

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L’arthrose (ARO) est une affection dégénérative multifactorielle caractérisée par la douleur, le gonflement, la raideur et une altération de la fonction, résultant de facteurs tels que l’obésité, une tension mécanique etun traumatisme 1. L’arthrose du genou (KOA) est très répandue et de plus en plus fréquente avec le vieillissement, cependant les essais cliniques sont souvent limités en raison de la diversité des manifestations cliniques. Par conséquent, le développement de traitements efficaces nécessite des modèles animauxappropriés 2. Compte tenu de l’hétérogénéité intrinsèque de l’OA, il n’existe pas de modèle « standard » universellement accepté, obligeant les chercheurs à identifier des modèles spécifiques qui correspondent à leur recherche scientifique.

Le KOA est actuellement caractérisé en médecine moderne comme une affection impliquant l’interaction de facteurs mécaniques et biologiques sur le cartilage articulaire et le tissu périchondral. La conséquence de cette interaction complexe est principalement la détérioration progressive du cartilage articulaire et de sa matriceenvironnante 3. Le stress mécanique sert de signal de transduction crucial régissant divers processus physiologiques et pathologiques au sein des cellules et tissusarticulaires 4. Maintenir le cartilage articulaire en bonne santé nécessitait une charge mécanique appropriée dans la plage physiologique. Inversement, une surcharge excessive entraîne souvent la dégénérescence du cartilage et l’apparition subséquente de KOA5. Les modèles spontanés sont freinés par des investissements importants en tempset en économies 6, tandis que les modèles induits par chirurgie utilisent une approche destructive qui représente principalement un KOA de stade moyen à avancé, s’écartant de la progression dégénérativenaturelle 7,8. Inversement, les modèles induits chimiquement ciblent la matrice de collagène mais ne capturent pas les changements complets de l’OA dégénérative humaine lorsqu’ils sont utilisés sans contrainte mécanique9. La combinaison de la dégradation enzymatique avec un sureffort mécanique permet de combler ces lacunes en récapitulant plus fidèlement la pathogenèse progressive de la lésion due au stress de surcharge. L’objectif de cette étude est d’établir et de valider un nouveau modèle murin de KOA en combinant des injections intraarticulaires de collagénase de type II avec un sureffort à l’aide d’un appareil de fatigue de roue rotative.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Les expériences ont été menées dans le cadre d’une licence de projet (NO : PZSHUTCM201016022) délivrée par le Centre d’Éthique des Animaux Expérimentaux de l’Université de Médecine Traditionnelle Chinoise de Shanghai, en conformité avec le Comité de mise à jour du Guide de Soins et d’Utilisation des Animaux de Laboratoire du Conseil National de la Recherche (États-Unis).

1. Protocole de production de modèles animaux

  1. Répartissez au hasard 32 souris C57BL/6 âgées de 10 semaines en quatre groupes : témoin, collagénase, exercice excessif, et collagénase + exercice excessif.
    1. Acclimater toutes les souris pendant une semaine dans des conditions normales d’alimentation et d’hébergement avant d’entamer les procédures de modélisation.
  2. Induire les modèles animaux sur une période de 4 semaines selon les groupes expérimentaux assignés.
    1. Administrez la collagénase de type II par injection intra-articulaire aux souris du groupe collagénase.
    2. Soumettez les souris du groupe d’exercice intense à un entraînement à l’aide d’un appareil de roue rotative.
    3. Appliquez à la fois l’injection de collagénase intra-articulaire et l’entraînement de la roue tournante sur les souris du groupe collagénase + exercice excessif.
    4. Maintenez la même fréquence et la même durée d’entraînement pour tous les groupes d’exercice concernés.

2. Protocole d’injection intra-articulaire de type II de collagénase

  1. Anesthésie
    1. Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane administré via une machine d’anesthésie gazeuse calibrée. Effectuer une induction rapide à une concentration de 2 % à 3 % d’isoflurane.
    2. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % à 2 % d’isoflurane. Assurez-vous que le système de récupération anesthésique fonctionne correctement afin d’éviter toute exposition au travail.
    3. Surveillez en continu la fréquence respiratoire et les réflexes de la souris tout au long de la procédure.
  2. Préparation de la peau
    1. Appliquez une crème dépilatoire sur la zone entourant l’articulation du genou gauche. Enlevez complètement les poils avec un grattoir.
    2. Nettoyez soigneusement la peau exposée. Maintenez des conditions aseptiques tout au long de la préparation.
  3. Préparation de la collagénase de type II
    1. Équilibrez la poudre de collagénnase de type II à température ambiante pendant 30 minutes dans un cabinet de biosécurité stérile. Utilisez du sérum stérile tamponné phosphate (PBS, pH 7,2–7,4) comme solvant et tampon exclusif pour le processus de dissolution.
    2. Peser précisément la masse nécessaire de poudre de collagénase à l’aide d’une balance analytique. Ajoutez lentement le PBS stérile à la poudre pour atteindre une concentration finale de travail de 0,04 U/μL.
    3. Mélangez doucement la solution en pipettant le mélange de haut en bas jusqu’à ce qu’il soit clair et dépourvu de particules visibles. Évitez les vortex violents pendant cette étape afin d’éviter la perte d’activité enzymatique.
    4. Centrifugez la solution préparée à 0,04 U/μL à 1 000 tr/min pendant 5 minutes à 4 °C. Cela élimine les microparticules non dissoutes et empêche le blocage de l’aiguille lors de l’injection suivante.
    5. Aspirez le surnageant dans des tubes stériles et conservez-les dans un bain de glace à 4 °C pour une utilisation immédiate. Préparez la solution de façon fraîche pour chaque séance afin d’assurer une activité enzymatique maximale.
  4. Injection intra-articulaire
    1. Saisir la peau dorsale de la souris à l’aide du pouce et de l’index de la main non dominante. Sécurisez les deux membres inférieurs avec l’annulaire et l’auriculaire pour étendre naturellement les articulations du genou et exposer complètement la zone d’injection.
    2. Tenez une micro-seringue de 10 μL équipée d’une aiguille de 30 G. Insérez l’aiguille parallèlement à la surface de la peau dans la couche superficielle de la peau sur environ 0,2 cm au point d’entrée.
    3. Ajustez lentement la direction de l’aiguille vers une orientation perpendiculaire par rapport à la peau lorsque la résistance tissulaire diminue.
    4. Continuez à avancer l’aiguille sur environ 0,3 à 0,5 cm jusqu’à ce qu’une perte de résistance indique une entrée dans la cavité articulaire. Retirez lentement le ventouse de la seringue pour confirmer l’absence de reflux sanguin.
    5. Injectez 5 μL de la solution de collagénase de type II (concentration : 0,04 U/μL) dans la cavité articulaire à vitesseconstante 10.
    6. Maintenez la position de l’aiguille immédiatement après l’injection. Pressez doucement la peau autour du site d’injection pendant 10 à 15 secondes.
    7. Retirez l’aiguille lentement. Appuyez légèrement sur le point d’entrée avec une gaze stérile pendant 30 secondes pour éviter les fuites de médicaments.
    8. Placez la souris dans une cage chaude et sèche. Laissez l’animal récupérer naturellement de l’anesthésie, ce qui prend généralement 5 à 10 minutes.
    9. Reprenez les conditions normales d’hébergement et d’alimentation une fois que la souris se sera complètement rétablie.
    10. Effectuez ces injections intraarticulaires deux fois par semaine, avec un intervalle de 3 à 4 jours entre les injections, exclusivement pendant la période de modélisation de 4 semaines (après l’acclimatation initiale d’une semaine).
    11. Jetez immédiatement tous les objets tranchants dans des contenants approuvés pour biohazard.
      REMARQUE : Veillez à ce que le personnel formé effectue toutes les injections afin de minimiser les blessures articulaires et la variabilité expérimentale.

3. Protocole de surmenage induit par roue rotative

  1. Préparation des appareils et contrôle de sécurité
    1. Réglez la vitesse de l’appareil de fatigue de type rotateur à 12 tr/min (équivalent à environ 0,063 m/s) et la durée à 2 h par séance.
    2. Allumez le module de stimulation électrique. Confirmez que le courant de sortie se situe dans la plage de sécurité prédéfinie de 0,1 à 0,3 mA. N’augmentez pas manuellement l’intensité du courant.
      ATTENTION : Utilisez le module de stimulation électrique strictement pour guider les souris vers la roue, pas comme un stimulus punitif. Vérifiez le câblage de l’appareil pour détecter des dommages et assurez-vous d’avoir un bon contact avec les électrodes avant l’utilisation afin d’éviter les courts-circuits et les décharges électriques.
  2. Formation à l’acclimatation
    1. Assurez-vous que les chambres des roues rotatives de l’appareil de fatigue sont propres, sèches et exemptes de débris. Désactivez les électrodes de stimulation électrique à l’entrée de la roue pour éliminer tout stress potentiel lié à la stimulation.
    2. Manipulez chaque souris délicatement à la base de la queue ou ramassez avec un tissu mou stérile. Placez les souris individuellement dans la région centrale de la surface de roulement de la roue tournante.
    3. Placez la souris dans une posture quadrupède naturelle debout sur la surface de course horizontale. Orientez le corps parallèlement à l’axe central de rotation de la roue, les pattes avant étant en avant et les pattes arrière légèrement en arrière.
    4. Utilisez une barrière souple temporaire et non restrictive pour empêcher la souris d’entrer dans la zone étroite des électrodes pendant les deux premières minutes. Retirez la barrière après cette période pour permettre à la souris d’explorer librement toute la chambre.
    5. Laissez les souris dans l’appareil fixe pendant 10 minutes par jour pendant les 3 premiers jours. Ne commencez pas la rotation de la roue ni n’initiez de stimulation électrique pendant cette période.
    6. Surveillez la souris pour détecter les signes de stress sévère tels qu’un gel persistant ou un élevage excessif. Repositionnez doucement la souris sur la zone centrale de la roue si elle présente un comportement anormal afin de restaurer une posture naturelle.
    7. Démarrez le volant à une vitesse de 5 tr/min pendant 30 minutes le jour 4. Cette étape acclimate les souris au rythme de mouvement de l’appareil sans recourir à des indices électriques.
    8. Guidez manuellement les souris vers le centre de la roue si elles tombent ou s’arrêtent pendant la phase d’adaptation rythmique. Assurez-vous que la stimulation électrique reste désactivée pendant toute la période d’acclimatation de 4 jours.
      ATTENTION : Évitez d’utiliser la stimulation électrique pendant la phase d’acclimatation afin d’éviter les réponses de stress induites par la peur et assurer la conformité future à l’entraînement.
  3. Exécution formelle de l’exercice
    1. Effectuez la formation formelle à une heure fixe chaque jour (par exemple, de 9h00 à 11h00). Portez des gants isolants pour placer les souris dans l’appareil de fatigue de type rotateur.
    2. Ferme la porte de l’appareil. Démarrez les paramètres prédéfinis de 12 tr/min (~0,063 m/s) pour une durée maximale de 2 heures par session (voir Figure 1).
      ATTENTION : Surveillez les souris en continu pendant l’entraînement. Interrompez l’entraînement pendant 5 minutes si une souris tombe continuellement (plus de 3 fois en 1 minute) afin d’éviter une fatigue sévère et des blessures causées par le stress.
  4. Détermination et stimulation de la fatigue
    1. Surveillez les souris en continu pour évaluer leur état de fatigue. Terminez la séance d’entraînement plus tôt, sans forcer la durée complète de 2 heures, si une souris remplit au moins deux des quatre critères spécifiques de fatigue pour éviter un surmensonge.
    2. Définissez le Critère 1 comme l’incapacité à rester sur la roue roulante plus de 5 secondes avant de tomber. Définissez le Critère 2 comme une fréquence de baisse significativement augmentée de 3 fois ou plus en une période d’une minute.
    3. Définissez le Critère 3 comme l’absence d’intention volontaire de revenir à la roue, où la souris reste immobile ou ne bouge que brièvement malgré une stimulation électrique.
    4. Définissez le Critère 4 comme la présentation de postures locomotrices anormales. Observez des signes évidents comme des membres traînants ou une démarche chancelante.
    5. Autorisez l’appareil à déclencher automatiquement une stimulation électrique légère lorsqu’une souris tombe à l’entrée du spinner. Assurez-vous que la stimulation électrique s’arrête immédiatement dès que la souris revient sur laroue 11.
      ATTENTION : Interrompez immédiatement l’entraînement si la souris présente des conditions anormales telles que des convulsions ou une dyspnée. Retirez la souris de l’appareil et administrez un traitement symptomatique si nécessaire.
  5. Traitement post-entraînement et fréquence
    1. Coupez l’alimentation de l’appareil après la fin de la formation. Portez des gants isolants pour retirer les souris et ramenez-les dans leurs cages à domicile.
    2. Fournissez aux souris une eau potable adéquate. Observez les animaux pour détecter toute activité anormale, état mental ou problème des membres (par exemple, claudication ou tremblements musculaires).
    3. Notez toute anomalie et apportez un traitement en temps opportun.
    4. Maintenez cette fréquence d’entraînement une fois par jour, 2 heures par séance, pendant 4 semaines consécutives. Gardez les paramètres d’entraînement et la surveillance de la sécurité cohérents tout au long de la période.
      REMARQUE : Vérifiez que l’appareil de fatigue et le module de stimulation électrique fonctionnent correctement avant chaque séance d’entraînement quotidienne afin d’assurer une intensité de stimulation constante.

4. Analyse de la démarche

  1. Aperçu du système
    1. Effectuez l’acquisition et l’analyse de la démarche à l’aide d’un système automatisé d’imagerie de la démarche.
    2. Effectuer toutes les procédures de marche sur 32 souris C57BL/6 âgées de 10 semaines après la période de modélisation de 4 semaines.
    3. Placez la caméra à grande vitesse sous la ceinture transparente du tapis roulant pour capturer des images ventrales pendant la locomotion.
  2. Acclimatation et mise en place
    1. Acclimatez toutes les souris à l’appareil du tapis roulant avant la collecte formelle des données afin de minimiser le stress.
    2. Réglez la vitesse du tapis de course à 20 cm/s pour correspondre au rythme physiologique de marche des souris.
    3. Enregistrez trois essais valides indépendants par souris avec un intervalle de repos de 2 minutes entre les essais.
  3. Enregistrement de l’épreuve et sélection des enjambres
    1. Laissez la souris marcher sans interruption pendant une période d’acquisition de 60 secondes à chaque essai.
    2. Effectuez un essai de remplacement si un enregistrement est invalide à cause d’un « gel », d’un saut ou d’un tournage.
    3. Ne commencez la collecte de données qu’après que la souris ait atteint une locomotion stable et constante pendant au moins 10 secondes.
    4. Sélectionnez un minimum de 4 foulées complètes consécutives de chaque essai de 60 secondes pour analyse.
    5. Assurez-vous que deux observateurs aveugles indépendants effectuent la sélection de pas afin d’éliminer les biais subjectifs.
    6. Vérifiez que la souris maintient une posture quadrupède naturelle sans sauter ni fluctuation soudaine de vitesse.
    7. Vérifiez que la foulée inclut à la fois une phase de position portante et une phase de propulsion vers l’avant.
    8. Vérifiez les images claires des contacts de ceinture de pattes sans perte de trace, flou ou contamination.
  4. Traitement d’image et extraction de paramètres
    1. Utilisez les algorithmes intégrés au logiciel système pour numériser les images capturées et détecter les points de contact de la ceinture de pattes.
    2. Calculez le rapport Swing/stance comme le rapport entre la durée de la phase du swing et la durée de la phase de la posture.
    3. Mesurez la longueur de la foulée (cm) comme la distance linéaire parcourue lors d’une seule foulée complète.
    4. Mesurez la largeur de foulée (cm) comme la distance horizontale entre les bords médiaux des pattes postérieures controlatérales à la position de pointe.
    5. Déterminez la zone de patte à la position maximale (cm2), représentant la surface totale de contact au maximum de portée.
    6. Calculez la variabilité de la surface de patte (cm2) comme le coefficient de variation de la surface de contact sur des foulées consécutives.
    7. Calculez la valeur moyenne des 3 essais valides pour chaque souris individuelle et exportez les ensembles de données finaux.
      REMARQUE : Excluez les essais présentant des comportements d’arrêt, de saut ou de rotation irréguliers de l’analyse.

5. Histologie

  1. Collecte et fixation des tissus
    1. Euthanasiez toutes les souris de manière humaine par luxation cervicale après la période d’induction de 4 semaines. Disséquez soigneusement l’articulation du genou gauche et retirez l’excès de tissu mou environnant.
    2. Immergez immédiatement l’échantillon dans un fixateur pré-refroidi à 4 % de paraformoldéhyde (PFA) (w/v). Assurez-vous que le volume fixatif soit 10 à 15 fois supérieur au volume de l’échantillon afin d’immerger complètement le tissu.
    3. Fixez le mouchoir à température ambiante pendant 48 heures. Agitez doucement le récipient de fixation toutes les 8 heures pour assurer une pénétration adéquate du fixateur.
  2. Décalcification tissulaire
    1. Rincez l’échantillon fixé avec de l’eau qui coule lentement pendant 10 minutes. Répétez ce rinçage trois fois pour éliminer le PFA résiduel.
    2. Transférez l’échantillon dans une solution de décalcification d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) de 0,5 mol/L (pH 7,2–7,4). Maintenez le volume de la solution de décalcification à 20 fois le volume de l’échantillon et stockez-le à 4 °C.
    3. Décalcifiez le tissu pendant 14 à 21 jours. Remplacez l’ancien liquide par une nouvelle solution de décalcification à l’EDTA tous les 3 jours.
    4. Testez l’extrémité de la décalcification en perceant doucement l’os sous-chondral avec une aiguille stérile. Concluez le processus de décalcification lorsque l’aiguille pénètre en douceur sans résistance.
    5. Lavez l’échantillon complètement décalcifié sous de l’eau courante pendant 2 heures pour éliminer l’EDTA résiduel. Rincez ensuite l’échantillon avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) trois fois pendant 5 minutes chacun.
  3. Encastrement et sectionnement
    1. Déshydrater l’échantillon décalcifié séquentiellement à l’aide d’une série d’éthanol graduée (70 %, 80 % et 90 % pendant 2 heures chacun ; 95 % pendant 1 h ; éthanol absolu deux fois pour 1 h chacun).
    2. Nettoyez les tissus déshydratés dans le xylène deux fois pendant 10 minutes chacun. Enfoncez le tissu dégagé dans la paraffine.
    3. Coupez le tissu incrusté de paraffine en sections sagittales continues de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Montez les sections sur des lames en verre recouvertes de poly-L-lysine et cuisez-les dans une plaque chauffante à séchage à 60 °C pendant 2 heures.
  4. Évaluation histomorphologique
    1. Colorez les sections avec du vert O-fast de safranine pour évaluer l’histomorphologie du cartilage articulaire.
    2. Évaluer la dégénérescence du cartilage à l’aide du système de notation de l’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) en conditions à doubleaveugle 12.
  5. Flux de travail central en immunohistochimie (IHC)
    1. Déparaffinez les sections dans le xylène deux fois pendant 10 minutes chacune. Réhydratez les sections séquentiellement à travers une série d’éthanol graduée jusqu’à de l’eau déionisée.
    2. Immergez les sections dans un tampon de citrate de 0,01 mol/L (pH 6,0) pour la récupération de l’épitope thermique induit par micro-ondes. Chauffez le tampon jusqu’à ébullition à haute puissance, puis maintenez un léger mijotage à moyenne puissance pendant 15 minutes.
    3. Refroidissez les sections naturellement à température ambiante. Lavez les lames avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune
    4. Incubez les coupes dans une solution de méthanol à 3 % de peroxyde d’hydrogène (H2O2) pendant 20 minutes à température ambiante pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase. Lavez les lames avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
    5. Appliquez une solution bloquante du sérum de chèvre à 5 % sur les sections. Incubez pendant 60 minutes à température ambiante pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
    6. Jetez la solution de blocage sans la laver. Appliquer la solution active primaire spécifique (Vanilloïde du Potentiel Récepteur Transitoire 4 (TRPV4) à 1:100, Caspase-3 à 1:200, ou Collagène de type II Alpha 1 (COL2A1) à une dilution 1:150).
    7. Incubez les sections avec l’anticorps primaire dans une chambre humidifiée à 4 °C pendant la nuit pendant 12 à 16 heures.
    8. Équilibrez les sections à température ambiante pendant 30 minutes le lendemain, puis lavez avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. Appliquer un anticorps secondaire IgG anti-lapin ou anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:500).
    9. Incubez les sections avec l’anticorps secondaire pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez les lames avec du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
    10. Appliquer une solution de chromogène 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et incuber dans le noir pendant 3 à 5 minutes à température ambiante. Arrêtez immédiatement la réaction avec de l’eau déionisée lorsqu’un signal brun clair apparaît sous observation microscopique.
    11. Contre-teinte les sections avec une solution d’hématoxyline pendant 5 minutes. Rincez sous l’eau courante pendant 10 minutes pour laisser la tache devenir bleue.
    12. Différenciez les sections à l’aide d’une solution alcoolique à 1 % pendant 30 s. Rincez les toboggans sous l’eau courante pendant 5 minutes.
    13. Déshydratez rapidement les sections à travers une série d’éthanol graduée et nettoyez le tissu dans le xylène deux fois pendant 10 minutes chacun.
    14. Montez les lames avec du baume neutre et recouvrez-les de couvercles en résine optique. Laissez sécher les lames montées à température ambiante.
  6. Contrôles IHC et analyse d’image
    1. Établissez un contrôle négatif en remplaçant l’anticorps primaire par du PBS pendant la coloration. Inclure une section cartilagineuse positive comme témoin positif pour vérifier l’efficacité des anticorps.
    2. Acquérez les images de la section colorée à l’aide d’un scanner de diapositives complètes à 40× et 100× grossissements.
      REMARQUE : Effectuez toutes les évaluations histologiques indépendamment par au moins deux observateurs aveuglés afin de réduire les biais subjectifs.

6. Analyse statistique

  1. Gestion des données et tests globaux
    1. Effectuer toute la collecte et l’analyse des données en conditions aveugles afin de minimiser les biais expérimentaux.
    2. Analysez les variables continues parmi les quatre groupes expérimentaux à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) pour tester les différences globales.
    3. Appliquer le test H de Kruskal-Wallis à toutes les variables ne répondant pas aux hypothèses paramétriques nécessaires.
  2. Tests post-hoc et seuils de signification
    1. Effectuer des comparaisons par paires à posteriori à l’aide du test de Tukey pour identifier des différences spécifiques de groupe si l’ANOVA initiale indique une signification statistique.
    2. Comptez uniquement sur le test de Tukey pour contrôler le taux d’erreur familial. Ne combinez pas cela avec d’autres méthodes de correction par comparaison multiple.
    3. Définissez la signification statistique de manière uniforme comme p < 0,05

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse de la démarche
Paramètres du cycle de la foulée : Le rapport balancement/posture — défini comme le rapport entre la durée de la phase de balancement sans charge et la phase de position portante d’une seule foulée — a été évalué pour refléter l’équilibre entre la charge et la propulsion. Comparées au groupe témoin (2,10 ± 0,06), les souris ayant reçu une injection intra-articulaire de collagénase (1,45 ± 0,05) ou ayant subi un exercice excessif (1,68 ± 0,05) pr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons développé un nouveau modèle murin de KOA qui imite les effets d’un stress excessif sur l’articulation en combinant l’injection intra-articulaire de collagénase avec un entraînement à l’entraînement à l’entraînement de fatigue par roue. Ces résultats confirment une fois de plus l’idée que le KOA découle de l’interaction entre facteurs biologiques et mécaniques. Comprendre et identifier ces facteurs est prometteur pour élaborer des plans de traitement individua...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les participants pour leur temps et leurs efforts, ainsi que tous les animaux de l’étude. Ce travail a été soutenu par la demande d’incitation de financement pour l’hôpital Hanghai Yueyang, branche Ruian, Fonds d’incitation à la construction des disciplines majeures - département de Tuina [QY71.42.06] et par l’Administration nationale de la médecine traditionnelle chinoise de haut niveau discipline clé scientifique de Tuina [zyyzdxk -2023061].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fixateur de paraformaldéhyde à 4 %BeyotimeP0099
Acide acétiqueSinopharm631-61-8
Système d’imagerie DigiGait pour sourisSciences de la vie RWDMSI-DIG-MS
Solution EDTAProcellPB180320
Embedding de la cassetteLeicaIP C
ÉthanolSinopharm64-17-5
Teinture verte rapideLeyan1085995
Crème dépilatoireVeetG20161330
HématoxylineAdamas61753A
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseHermleZ366K
IncubateurTAITECM-210FN
Machine d’anesthésie inhalatoireRangerRZ-Viking
IsofluraneWebioW100
MicrotomeTed Pella10180-220
Appareil de fatigue de type rotateur de sourisTechnologie biologique Zhishu Duobao de PékinYLS-10B
Balsam neutreSinopharm96949-21-2
Tache Safranin OBiossS0062
Centre d’incrustation semi-automatique de tissuThermo FisherHistoStar
Plaque chauffante de séchage à coulisseSciences de la microscopie électroniqueXH-2002
Bain d’eau à flottaison tissulaireBIOBASEBT-I
Colagnase de type IISigma-AldrichC4-22-1G
Scanner de diapositives entièresLeicaAperio VERSA
XylèneSinopharm1330-20-7

Références

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Mots-clés

Injection de collag nased gradation du cartilageanalyse de la d marchevaluation histologiqueexpression de TRPV4r duction de COL2A1mod le d arthrose

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