Article de méthode

Essai d’isolation à fibre unique pour l’évaluation du comportement des myofibres oxydatives

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DOI :

10.3791/70637

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31 mars 2026

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1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des fibres musculaires uniques intactes du solèus oxydatif et l’établissement de cultures de myoblast hautement purifiées dérivées de ces fibres. La procédure optimisée permet de fournir de manière fiable environ 300 à 500 myofibres intactes par souris, permettant des analyses moléculaires et cellulaires en aval.

Résumé

Le muscle squelettique est composé de myofibres multinucléées dont l’intégrité et la fonction sont essentielles au mouvement et à la santé globale. Dans les troubles neuromusculaires, les groupes musculaires peuvent être affectés différemment selon les types et les stades de maladie, ce qui rend important d’isoler les fibres uniques viables des muscles représentatifs pour les études mécanistiques. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode fiable pour isoler un rendement élevé de myofibres simples intactes du muscle solèse murien (SOL), qui est difficile à dissocier en raison de la longueur et de la fragilité des fibres. En optimisant la concentration de collagénase et le temps de digestion, le protocole minimise la perte de fibres et préserve la viabilité lors de la dissociation. Ce flux de travail optimisé réduit considérablement l’attache tissulaire résiduelle aux fibres isolées, limitant ainsi la transmission des cellules non fibreuses et minimisant la contamination intercellulaire. Cette technique convient aux analyses à fibre unique ainsi qu’à l’isolement des cellules satellites et à l’expansion ultérieure dans des conditions de contamination minimale. Grâce à ce flux de travail optimisé, nous obtenons régulièrement ~300 à 500 myofibres uniques intactes dérivées du SOL, qui peuvent être immunomarquées avec une grande efficacité et produisent également une population cellulaire satellite de haute qualité avec une contamination minimale par fibroblastes. En utilisant des analyses comparatives avec le muscle extenseur du doigt long (EDL), nous soulignons la valeur d’une approche adaptée et spécifique au muscle pour évaluer les thérapies dans la recherche sur les maladies neuromusculaires, permettant de tester des interventions pharmaceutiques candidates dans de petites fenêtres expérimentales réglables.

Introduction

Le muscle squelettique est le tissu le plus abondant du corps humain, représentant environ 40 à 50 % de la masse corporelletotale 1. Le muscle squelettique sert de réservoir d’énergie sous forme de glycogène. Lors de l’exposition au froid, il fournit de la chaleur par thermogenèse et, surtout, favorise la locomotion. Le muscle squelettique est composé de myofibres multinucléées post-mitotiques. Pour soutenir la maturation et la réparation musculaires, de nouveaux myonoyaux sont générés par la cellule souche résidente de notre muscle squelettique, la cellule satellite (SC). Les SC se trouvent à la périphérie des fibres musculaires squelettiquespostnatales 2,3,4. Les SC sont identifiés par le facteur de transcription Pax7, exprimé à la fois dans les états quiescent etactivé 3,5. En cas de blessure ou de stimulation hypertrophique, les cellules cellules activent et régulent à l’augmentation la MyoD, entrent dans le programme myogénique, proliférent, puis fusionnent finalement avec des myofibres existantes ou nouvellement formées pour restaurer la fonction musculaire 6,7,8. Les SC sont hétérogènes dans leur capacité de tige, leur origine embryologique (somitique vs non somitique), leur stade de croissance postnatale (jeune vs vieux) et leur composition musculaire (fibres rapides vs lentes)9,10,11.

Selon la région du corps, le muscle squelettique est adapté pour répondre aux besoins énergétiques et fonctionnels de cette région. Cette hétérogénéité des fibres musculaires est possible grâce à leur contractilité et leur capacité oxydative. En effet, les fibres musculaires sont composées de fibres oxydatives à contractions lentes (appelées types I et IIa) et de fibres glycolytiques à contraction rapide (appelées IIx, chez les rongeurs IIb)12,13. Cette belle mosaïque fonctionnelle de types de fibres nous permet de nous déplacer librement dans notre vie quotidienne. Par exemple, les muscles posturaux tels que le solète (SOL) et les érecteurs spinais sont en état d’activation chronique et de faible intensité, et contiennent donc une forte proportion de fibres musculaires de type I et de type IIa à oxydation lente. En revanche, les muscles courts mais à action rapide tels que l’extenseur du doigt long (EDL) sont principalement composés de fibres glycolytiques de type IIx et de type IIb. La composition fibreuse, cependant, n’est pas fixe ; au contraire, les fibres musculaires sont des structures dynamiques capables de passer de rapides à lentes et inversement selon les exigences fonctionnelles qui leur sont imposées. La différence de contractilité par type de fibre est possible due à la teneur en protéine de myosine. C’est la principale protéine du muscle squelettique, composée d’isoformes de myosine (chaînes légères etlourdes) 12,14.

À l’intérieur d’un sarcomère (la plus petite unité fonctionnelle du muscle qui génère de la force), les têtes de myosine et l’actine interagissent pour former une structure appelée pont transversal. Par hydrolyse de l’ATP, l’énergie est libérée par le cycle des interactions entre la myosine etl’actine 15,16. La chaîne lourde de myosine (MyHC) est le marqueur le plus approprié pour l’identification du type de fibre12,13. Selon l’isoforme de MyHC exprimée, le taux de contractilité musculaire varie. Comme mentionné, les fibres de type I sont des fibres oxydantes lentes, contrairement aux fibres de type II. Les groupes musculaires dominants de type I contiennent une plus grande abondance d’enzymes oxydatives, sont plus riches en mitochondries et possèdent un réseau capillaire dense pour perfuser le muscle17,18 (pensez aux marathoniens). Les fibres de type I sont codées par le gène MYH7 13,19. Les fibres de type II s’épuisent rapidement, contiennent une forte proportion d’enzymes glycolytiques et ont une vitesse maximale de raccourcissement plus élevée, ce qui les rend idéales pour de courtes poussées de puissance ou de mouvement (pensez à un powerlifter). Les fibres de type II pour les types IIa, IIx et IIb (chez les rongeurs) sont codées par les gènes MYH2, MYH1 et MYH4, respectivement20,21. Sans surprise, toute insulte physiopathologique affectant l’intégrité musculaire modifiera la composition des fibres et entraînera des effets néfastes sur la fonction musculaire, pouvant potentiellement diminuer la qualité de vie. En fait, de nombreuses dystrophies musculaires commencent soit dans la cellule satellite (opathies cellulaires satellites), soit dans la fibre musculaire (dérivées des motoneurones ou du tissu musculaire), et peuvent provoquer un changement de composition desfibres 22,23,24,25. Par exemple, les lésions de la moelle épinière, les études sur le repos au lit et les vols spatiaux (microgravité) montrent que l’inactivité à long terme peut déclencher le passage des muscles posturaux d’un phénotype lent à un phénotype de fibresrapides 26,27,28,29,30. Inversement, dans la dystrophie musculaire de Duchenne, tant chez les modèles humains que murins (mdx), les fibres glycolytiques rapides sont plus affectées et avec une plus grande sévérité que leurs homologues pluslents 31,32,33,34. De même, dans la dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD), une transition de contraction rapide à lente est observée avec une plus grande proportion de fibres de type I ainsi qu’une production de force plus faible dans les fibres de typeII 24,35,36.

Il reste incertain pourquoi certains types de fibres musculaires sont affectés ou épargnés de manière sélective dans différentes maladies. Le fait que ces motifs soient non aléatoires souligne l’importance de disséquer les mécanismes sous-jacents, pour lesquels l’isolation à fibre unique est devenue une technique puissante et largement utilisée. En effet, depuis son introduction au milieu des années 80 par Bischoff37, cet outil indispensable a été continuellement affiné et adapté, permettant une investigation de plus en plus précise de la biologiemusculaire 38,39,40. Il est important de noter que l’isolation d’une seule fibre maintient les SC aussi proches que possible de leur niche physiologique, permettant un examen adéquat de leur activité moléculaire. Bien que des groupes musculaires tels que ceux du fléchisseur court des doigts (FDB) et de l’EDL puissent être extraits relativementfacilement 41,42,43, le muscle SOL reste l’un des muscles les plus difficiles à obtenir pour obtenir une population riche de fibres intactes. Cela est dû à sa rigidité, à la longue longueur des fibres et à sa sensibilité aux dommages. Pour y remédier, une technique a été optimisée dans la présente étude qui permet de produire de manière robuste une population de fibres de haute qualité et viable à partir du muscle SOL, notoirement difficile à isoler. Combinée à l’isolation des fibres EDL, cette approche permet la culture de fibres et de cellules dérivées (cellules satellites, myoblastes et myotubes) à partir de groupes musculaires distincts. De manière essentielle, cette plateforme permet une investigation systématique des facteurs moléculaires pouvant contribuer différemment à diverses pathologies musculaires et offre un moyen puissant de tester les interventions pharmaceutiques de manière à révéler des réponses spécifiques au type musculaire et, en fin de compte, à soutenir le développement de traitements efficaces pour les maladies musculaires squelettiques.

Protocole

Tous les animaux étaient hébergés dans l’installation animale de l’Université métropolitaine de Tokyo (Numéros de permis : A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Tous les animaux ont été maintenus sous des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF). La manipulation des animaux et les procédures expérimentales employées dans cette étude ont strictement respecté les directives du Comité de sécurité et d’éthique de l’Université métropolitaine de Tokyo.

1. Préparation des réactifs

  1. Portez des gants tout au long. Dans un tube centrifuge de 25 mL, préparez 0,5 % de solution de collagénase de type I dans un milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco à haute glycémie + GlutaMAX avec une suspension à 1 % de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B (AB). Une fois la collagénase bien dissoute (tapotez légèrement le tube si nécessaire), stérilisez la solution en filtrant à travers un filtre à faible liaison protéique de 0,22 μm.
    REMARQUE : 2,5 mL de solution de collagénase suffisent pour deux soléaires (une souris).
  2. Préparez 10 mL d’albumine sérique bovine à 5 % (BSA) dans une solution sérique tamponnée phosphate (PBS). Inactivez à la chaleur à 60 °C pendant 30 minutes, puis filtrez la solution à travers un filtre à faible liaison protéique de 0,22 μm.
    REMARQUE : Les 5 % de BSA dans la solution PBS peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à 10 jours.

2. Dissection des muscles solèaires

  1. Équipement de mise en page pour la dissection musculaire (Figure 1A).
  2. Anesthésiez des souris C57BL/6 par injection intrapéritonéale d’un mélange triple anesthésique (0,5 mL/g de poids corporel) contenant 1 mg/mL de médétomidine chlorhydrate, 5 mg/mL de midazolam et 5 mg/mL de butorphanol tartrate, puis euthanasiez les souris par luxation cervicale.
  3. Faites des incisions cutanées séquentielles sur le membre postérieur et retirez la peau. Retirez la surface du fascia.
  4. Séparez le tendon plantaire (PLA) des faisceaux de tendons gastrocnémien (GAS) et soléaire (SOL). Retirez doucement le PLA en tirant sur son tendon (Figure 1B).
  5. Coupez les faisceaux tendineux du GAS et du SOL et exposez les muscles. Insérez une goupille dans l’espace entre le tendon proximal du GAS et le SOL (Figure 1C).
  6. Faites glisser prudemment l’aiguille vers l’extrémité distale pour séparer le muscle SOL et le muscle GAS (Figure 1D).
  7. Coupez les faisceaux tendineux du côté GAS (Figure 1E).
  8. Reposez le délai de détention sur le GAZ. Ajustez soigneusement la position du SOL pour exposer le tendon proximal et coupez-le avec une paire de microciseaux (Figure 1F).
  9. Placez le SOL sur la table de dissection et retirez le tendon restant (Figure 1G).
    REMARQUE : Cette étape est optionnelle ; le tendon restant n’influence pas le résultat.

3. Digestion des muscles solaires

  1. Transférez le soléus intact dans un tube centrifuge de 25 mL contenant la solution préparée à 0,5 % de collagénase. Incubez à 37 °C pendant 130 minutes.
    REMARQUE : Toutes les 15 à 20 minutes, on peut agiter manuellement l’échantillon pour séparer légèrement les fibres et soutenir l’activité collagénase.

4. Isolement de fibres simples sous stéréomicroscope

  1. Coupez deux pipettes Pasteur pour en créer une à large alésage et une à ouverture étroite (Figure 2A). Sous le feu, stériliser et lisser les trous pour éviter les dommages musculaires pendant la trituration.
  2. Pour éviter l’adhérence des fibres lors de l’isolement, enduir des pipettes Pasteur et trois boîtes de Petri de 50 mm contenant 5 % de BSA/PBS.
    REMARQUE : Un stéréomicroscope (Figure 2B) a été utilisé tout au long des étapes d’isolement.
  3. Après la digestion musculaire, éliminez l’excès de solution de collagénase et transférez le soléaire dans le premier plat contenant du DMEM contenant 1 % d’AB (Figure 2C).
  4. À l’aide de la pipette Pasteur à large calibre, rincez doucement de haut en bas pour dissocier les fibres (Figure 2D).
  5. Avec la pipette Pasteur à calibre étroit, transférez les fibres simples intactes le long de la longueur des fibres musculaires vers le second plat. Profitez-en ici pour enlever les débris et/ou les fibres rétrécies (Figure 2E,F).
  6. Transférez des fibres simples de haute qualité (pleine longueur/intactes) dans un troisième plat pour garantir la pureté avec la pipette Pasteur à calibre étroit (Figure 2G,H).
  7. Collectez les fibres dans un tube centrifuge de 25 mL recouvert de BSA. Remuez doucement la suspension, puis laissez-la reposer 5 minutes à température ambiante pour permettre aux fibres de précipiter au fond du tube.
  8. À l’aide de la pipette Pasteur à calibre étroit, jetez soigneusement le surnageant pour éliminer les débris restants. Laissez environ 500 μL du DMEM avec une solution AB à 1 %. Ce précipité contiendra une population hautement purifiée de fibres musculaires uniques (Figure 2G,H).
    REMARQUE : Cette technique peut fournir > 300 fibres simples, qui peuvent ensuite être utilisées pour l’extraction de protéines et d’ARNm ainsi que l’analyse ultérieure.

5. Établissement de cultures de myoblast hautement purifiées à partir de fibres de solèus

  1. Diluez la matrice Matrigel à 0,1 mg/mL et utilisez-la pour enrober un plat de culture de 100 mm. Faites couver le plat à 37 °C pendant 30 à 60 minutes jusqu’à ce que le revêtement polymérise uniformément.
  2. Ajoutez un volume égal d’Accutase à la suspension des fibres musculaires et faites couver à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 10 mL de milieu de croissance (composé de DMEM sans glucose contenant 30 % de sérum fœtal bovin, 1 % de GlutaMAX, 1 % d’extrait d’embryon de poulet, CEE, 1 % d’AB et 0,01 μg/mL de facteur de croissance fibroblastique basique, bFGF)44).
    REMARQUE : Une quantité égale d’Accutase dans ce cas correspond aux 500 μL décrits à la Section 4.8. L’accutase facilite la dissociation douce des fibres musculaires et aide à libérer les cellules satellites, soutenant l’expansion ultérieure de la culture de myoblast.
  3. Transférez les 10 mL de suspension musculaire traitée à l’Accutase dans un plat enrobé de Matrigel. Environ 4 fibres simples/cm 2 sont ajoutées à un bol de culture de 100 mm. Assurez-vous que les fibres sont réparties uniformément dans tout le plat de culture.
  4. Après 3 jours dans un milieu de culture, des colonies de myoblast peuvent être observées. Remplacez le milieu de croissance quotidiennement jusqu’à ce que les myoblastes atteignent la population requise. Normalement, au 6e jour, les cultures de myoblast deviennent suffisamment confluentes pour la phase expérimentale (Figure 3A).
  5. Détachez les myoblastes de leur plat de culture d’origine à l’aide de la trypsine et incubez l’échantillon à 37 °C pendant 2 minutes. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et les graines selon la taille du puits et la confluence cellulaire requise pour la progression myogénique.
    REMARQUE : Pour un plat de 100 mm, ajoutez 1 mL de trypsine.

Résultats

Notre technique démontre que les fibres isolées des muscles solèque (SOL) et extenseur du doigt long (EDL) peuvent être immunomarquées efficacement contre Pax7 (Figure 3B). Ces fibres isolées peuvent être conservées dans un milieu de culture flottant (composé de DMEM + GlutaMAX avec 10 % de sérum de cheval, 1 % d’AB, 0,5 % de CEE) pendant 3 jours, suivies d’un immunomarquage (Figure 3B). Il n’est pas recommandé de garder les fibres flottantes plus de 4 jours. Dans les conditions de fibres flottantes décrites, les myofibres ont tendance à s’agréger après ce délai, compromettant l’analyse immunomarquée ultérieure.

La technique présentée peut également être utilisée pour l’immunoblotting à travers le programme myogénique (Figure 3C). En effet, les myoblastes dérivés de SOL et EDL ont été placés en plaques de 24 puits à une confluence d’environ 70 %. Les cellules étaient soit maintenues dans un milieu de croissance pendant 1 jour (myoblastes), soit induites à se différencier pendant deux ou quatre jours (myotubes à formation précoce et différenciés, respectivement). Cinq μg de protéines ont été chargés pour une analyse immunoblot.

L’expression de MyHC I s’exprimait presque spécifiquement dans les fibres musculaires dérivées de SOL, avec une expression minimale dans les myotubes et négligeable dans les myoblastes (Figure 3C). MyHC II s’exprimait à la fois dans les fibres musculaires SOL et EDL. Cette expression reflète le SOL, composé principalement de types I et IIa, tandis que l’EDL est principalement composé de fibres IIx et IIb. Les myoblastes n’exprimaient pas MyHC II, mais son expression augmentait progressivement lors de la différenciation. Les protéines d’origine oxydative PGC-1α et COXIV ont démontré une expression attendue plus élevée dans les fibres dérivées de SOL. De plus, une expression plus élevée de GLUT4 a été détectée dans les fibres SOL isolées par rapport aux fibres EDL. Un problème auquel peuvent être confrontés les biologistes du muscle squelettique est que les protéines de maintien de l’eau largement utilisées et les contrôles de charge, tels que la α-tubuline, la β-actine, le GAPDH et les colorations protéiques totales incluant Ponceau S, ne restent pas stables à travers les myoblastes, les myotubes et les fibres musculaires isolées, chacune présentant une variabilité distincte. L’intensité du signal de la α-tubuline et de la β-actine était la plus élevée dans les myotubes, tandis que la coloration en S de Ponceau était relativement faible dans les myoblastes. En revanche, le GAPDH a montré une expression plus forte dans les fibres musculaires de l’EDL. Néanmoins, selon l’objectif expérimental, l’une de ces protéines de maintien pourrait encore être applicable, et des facteurs de normalisation tels que la protéine de choc thermique 70 (HSP70) peuvent être explorés.

Figure 1
Figure 1. Dissection du muscle solère. (A) Équipement nécessaire pour la dissection. 1 : micro ciseaux, 2 : pinces fines, 3 : ciseaux à disséquer, et 4 : goupilles de dissection. (B) Le tendon PLA a été coupé à partir des faisceaux tendineux GAS et SOL (flèche jaune). Le tendon distal de PLA (flèche blanche) a été soulevé avec des pinces. (C) Une goupille de dissection a été insérée dans l’espace entre le tendon proximal du SOL (flèche rouge) et le GAS (flèche verte). (D) SOL a été séparé du GAS à l’aide d’une goupille de dissection. (E) Les faisceaux tendineux GAS et SOL ont ensuite été coupés du côté GAS. (F) Le tendon proximal du SOL a ensuite été coupé avec des microciseaux. (G) Des faisceaux tendineux distaux supplémentaires ont été retirés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2
Figure 2. Isolation des fibres soléaires. (A) Équipement nécessaire pour l’isolement. 1 : pipettes à calibre étroit et 2 : pipettes Pasteur à large âme. (B) Stéréomicroscope utilisé pour l’isolation. (C) Le solèus digéré à la collagénase a été transféré au DMEM avec 1 % d’AB. (D) Les fibres du solèus se sont dissociées du muscle après les 10 premières séances de rinçage. (E) Les fibres simples sont transférées au second plat. (F) Image montrant des fibres propres retirées des débris et des fibres rétrécies. (G) Des fibres simples sans débris transférées au troisième plat. (H) Fibres simples intactes clairement visibles. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3
Figure 3. Expansion de la culture cellulaire et analyse d’échantillons dérivés de l’EDL et du SOL. (A) Après 6 jours après l’isolement, les échantillons cultivés par le milieu de prolifération montrent une culture myoblast pure obtenue à partir de fibres solaires isolées. Scale bar = 100 μm. (B) SOL et les fibres simples dérivées de l’EDL, immédiatement ou 3 jours après l’isolement, montrent des cellules satellites immunomarquées pour Pax7 (vert). L’absence de MyoD (rouge) confirme que les cellules satellites ne se sont pas encore engagées dans l’activation myogénique. Les fibres étaient contre-colorées avec du DAPI (bleu). Les cellules ont ensuite été observées au microscope à fluorescence. Barre d’échelle = 20 μm. (C) 5 μg de protéines ont été utilisés pour l’immunoblotting des myoblastes, myotubes et échantillons dérivés de myofibres. Les panels d’immunoblotting montrent que l’expression de MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubuline, β-actine et GAPDH ont été utilisés comme cibles de maintien et de normalisation. La coloration Ponceau S a été utilisée comme contrôle total de la charge protéique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La première clé pour isoler un grand nombre de fibres musculaires du solèse (SOL) est de maintenir l’intégrité structurelle du muscle lors de la dissection. Si l’épimysée du SOL est déchiré ou si le muscle est tiré violemment, notamment le long de son axe longitudinal, lors de la dissection, le rendement en isolement sera gravement compromis. Ces erreurs de dissection sont généralement faciles à identifier par la suite. En effet, après la digestion de la collagénase, le muscle se rétrécit uniformément et forme une masse blanche et compacte. Dans de telles conditions, un très petit nombre de fibres viables peut être dissocié.

Le deuxième facteur décisif pour un isolement réussi est l’efficacité de la digestion de la collagénase de type I. Lorsque la collagénase agit de façon optimale, environ 100 à 200 fibres soléaires peuvent être obtenues lors des 10 premières séances de rinçage. En revanche, lorsque la digestion est sous-optimale, même après les 20 premiers rinçages, moins de 50 fibres peuvent être libérées. Pour obtenir un rendement plus élevé en fibres, un rinçage plus vigoureux et des cycles de rinçage supplémentaires sont nécessaires. Cependant, comme les fibres SOL sont exceptionnellement fragiles, cela entraîne souvent un rétrécissement lors du rinçage.

Pour établir une culture primaire de myoblast dérivée de SOL pure, la digestion de la collagénase joue à nouveau un rôle crucial. Lorsque la digestion est efficace, moins de fibres restent attachées aux tissus résiduels et le transfert des fibres dans un milieu de culture entraîne une contamination minimale par les fibroblastes. En revanche, lorsque le SOL est mal digéré, les fibres dissociées restent attachées aux tissus résiduels, contaminant la culture des myoblast avec des fibroblastes. Les chercheurs devraient rechercher les signes typiques de contamination par les fibroblastes dans les échantillons de cellules ensemencées ; celles-ci incluent une taille cellulaire beaucoup plus grande et des protubérances cytosquelettiques étendues, comparées aux cellules satellites beaucoup plus petites en forme de fuseau dans les plats recouverts de Matrigel adhérés. En cas de contamination, les chercheurs peuvent soumettre les cellules à des étapes de pré-plaque comme décrit ailleurs45. En résumé, les SC sont cultivés pendant 3 jours après l’isolement, puis tripsinés et brièvement pré-dressés sur des plats enrobés de collagène. Pendant 15 à 30 minutes d’incubation, les fibroblastes adhèrent tandis que les SC restent en suspension et sont transférés sur des plaques fraîches recouvertes de Matrigel.

Comme mentionné plus haut et en accord avec notre expérience, les fibres SOL sont plus longues et plus fragiles que celles issues de l’extenseur du doigt long (EDL) et du fléchisseur du doigt court (FDB). Cela rend le transfert des fibres avec des pipettes Pasteur difficile. Il est essentiel d’aspirer les fibres le long de leur axe longitudinal plutôt que de les tirer du centre ; sinon, les fibres se replient et se rétrécissent sous la contrainte. Outre les facteurs décisifs qui déterminent directement le succès de l’isolation de la fibre, quelques étapes techniques supplémentaires sont essentielles pour améliorer le rendement de la fibre du soleus. L’une d’elles consiste à recouvrir toutes les pipettes, plats et tubes de collecte Pasteur avec 5 % de BSA. Cela empêche les fibres musculaires fraîchement dissociées d’adhérer aux surfaces, empêchant ainsi le repli des fibres et leur rétrécissement ultérieur. Il est recommandé de préparer de nouvelles pipettes Pasteur stérilisées à la chaleur et enduites de BSA à chaque isolement des échantillons musculaires. Sinon, les chercheurs pourraient préparer un ensemble de pipettes Pasteur pour une utilisation à long terme. Si oui, stérilisez à chaud à chaque fois et enrobez fraîchement de BSA avant utilisation.

Le protocole conventionnel pour l’isolement des fibres musculaires uniques était principalement optimisé pour les muscles glycolytiques tels que FDB et EDL37. Cependant, les muscles oxydatifs, tels que le SOL, sont structurellement distincts. Des analyses transcriptomiques ont montré que l’expression génique liée à la matrice extracellulaire (ECM) diffère entre le SOL et l’EDL46, incluant des gènes tels que la dystrophine, une protéine lieuse du cytosquelette du musclesquelettique 44. Par conséquent, la condition standard pour la digestion musculaire EDL avec 0,2 % (2 mg/mL) de collagénase pendant 60 à 90 minutes n’est pas optimale pour les muscles SOL, entraînant des faisceaux de fibres compactes ou des fibres rétrécies après la digestion. Dans cette étude, nous avons optimisé plusieurs étapes clés pour adapter le protocole aux muscles oxydatifs SOL. En ajustant la concentration de collagénase de type I à 0,5 % (5 mg/mL), en prolongeant la période d’incubation à 130 minutes et en minimisant le stress mécanique lors du rinçage, on peut obtenir systématiquement 300 à 500 fibres intactes d’une seule souris. Comparé à l’EDL, le nombre de fibres et le rendement des échantillons SOL restent inférieurs (l’EDL peut produire > 500 fibres) ; néanmoins, le nombre de fibres et, surtout, la haute qualité de nos fibres dérivées du SOL sont robustes et adaptés à des applications en aval telles que l’immunomarquage et l’immunoblotting. Bien que nos résultats d’immunoblotting aient consisté en des échantillons de fibres uniques regroupés, la technique présentée dans ce rapport est capable d’extraire de manière fiable des fibres individuelles intactes, les rendant adaptées à des applications en aval telles que l’immunoblotting, la protéomique et le séquençage del’ARN 47 à résolution de fibre unique. Les chercheurs du domaine peuvent utiliser cette technique pour étudier les différences métaboliques et contractiles entre les fibres musculaires oxydatives et glycolytiques.

Dans l’ensemble, ce protocole offre une méthode reproductible et accessible pour isoler les fibres oxydatives intactes du muscle solère, élargissant ainsi la boîte à outils disponible pour étudier la physiologie et les mécanismes moléculaires spécifiques aux types de fibres musculaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la création de bourses universitaires pour la création d’innovations en sciences et technologies (JST, subvention n° JPMJFS2139 à T.H.) et des subventions de la Société japonaise pour la promotion de la science (KAKENHI 23H00457 attribuée à la N.L.F., 20J12849 à Y.Mi., 24K22254 à Y. Ma). Cette étude a également été soutenue par la subvention de recherche avancée du gouvernement métropolitain de Tokyo [R2-2] à Y.Ma., N.L.F., et par le fonds de recherche stratégique TMU pour un projet de recherche innovant [R3] à N.L.F. Merci à Yasuro Furuichi pour ses conseils et ses commentaires utiles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Nom du produit: Vetorphale injection
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Nom du produit: Dorbene Injection
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Nom du produit: Dormicum Injection
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100Mentionné comme plat de Petri dans le manuscrit
Anbitodies pour l’immunomarquage
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anbitodies pour l’immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ peroxidase de raifort
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ peroxidase de raifort
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

Références

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