Un modèle de culture tridimensionnel soutenant le développement in vitro du follicule secondaire à antral humain

Résumé

Cette étude a établi un modèle de culture tridimensionnelle (3D) qui soutient le développement des follicules humains du stade secondaire au stade antral in vitro. Ce système permet la croissance des follicules et la formation d’antrum tout en préservant les caractéristiques moléculaires des cellules somatiques, fournissant un modèle essentiel pour la recherche sur la folliculogenèse humaine.

Résumé

La folliculogenèse ovarienne humaine est un processus complexe et strictement régulé, difficile à étudier directement in vivo. Bien que les modèles in vitro soient essentiels à la recherche mécanistique, les systèmes existants restent sous-optimaux car ils ne peuvent pas reproduire la dynamique spatiotemporelle du développement des follicules. Cette étude présente un modèle de culture 3D qui soutient le développement du follicule humain du stade secondaire au stade antral. Ce modèle récapitule avec succès des événements morphologiques clés in vivo , notamment la croissance folliculaire soutenue, une phase d’expansion de diamètre distinct dès le jour 10, et la formation de cavité antrale vers le jour 20. Il est important de noter que cette progression développementale a culminé avec la récupération réussie d’ovocytes viables au stade de la vésicule germinale (GV). De plus, l’analyse d’immunofluorescence a révélé des schémas d’expression distincts des récepteurs des gonadotrophines dans les cellules somatiques, cohérents avec l’identité des cellules granuloses et thèques. Les cellules de type granulosa interne présentaient un récepteur élevé de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR), tandis que les cellules externes de type thèque présentaient une forte expression des récepteurs de l’hormone lutéinisante (LHR). Ce modèle offre une plateforme précieuse pour étudier la folliculogenèse humaine et la toxicologie de la reproduction, et constitue une référence pour optimiser les systèmes de culture folliculaire in vitro pour le développement du stade secondaire à antral.

Introduction

Le processus physiologique de développement des follicules ovariens, du stade primordial au stade préovulatoire, est fondamental pour la fertilité^{féminine 1}. Ce processus implique une série d’événements hautement coordonnés, incluant la croissance/maturation des ovocytes et la prolifération des cellules^{granuloses 2}. Les perturbations de ces mécanismes complexes représentent une cause majeure d’infertilité et de dysfonctionnement ovarien. Une compréhension détaillée des réseaux régulateurs sous-jacents à la folliculogenèse — englobant la signalisation paracrine, les interactions ovocyte-cellule somatique et la dynamique de la matrice extracellulaire — est donc d’une importance pathophysiologique cruciale. Cependant, l’investigation directe de la folliculogenèse humaine in vivo reste limitée par des limites éthiques et pratiques, ce qui rend nécessaire des modèles in vitro fiables pour élucider ces mécanismes. Malgré les avancées, il subsiste un manque critique d’un modèle de culture à long terme qui soutienne le développement des follicules humains, en particulier du stade secondaire à celui antral.

Bien que la culture folliculaire humaine dans des matrices bidimensionnelles (2D) ou tridimensionnelles (3D) ait fait progresser la compréhension du développement folliculaire^{précoce 3,4}, ces systèmes restent limités dans le soutien de la progression vers les stades ultérieurs. Il est à noter que l’atteinte de la foliculogenèse humaine in vitro à travers les stades avancés du développement reste particulièrement difficile en raison de la taille plus grande de leurs follicules et de leur délai de maturation^{prolongé 5}. Même parmi le nombre limité de systèmes de culture folliculaire in vitro humains qui ont réussi à produire des ovocytes MII, les taux de maturation restent faibles (environ 20 % au maximum⁾6,7,8,9. Un défi plus fondamental est peut-être la réexposition de la transition secondaire vers antrale, une phase critique et structurellement complexe qui n’a pas encore été correctement modélisée in vitro.

Cette étude a établi un modèle de culture 3D qui soutient le développement in vitro des follicules secondaires humains en follicules antraux aux structures cariales distinctes. Ce modèle constitue une base fondamentale pour une étude approfondie des mécanismes régulateurs sous-jacents au développement du follicule humain et sert de référence pour l’optimisation future des systèmes de culture folliculaire ciblant le développement secondaire vers l’antral.

Protocole

Ce protocole d’étude a été examiné et approuvé par le Comité d’éthique du Troisième Hôpital de l’Université de Pékin (Approbation n° M2024151). Tous les tuteurs légaux des mineurs participant à l’étude ont signé le formulaire de consentement éclairé.

Source tissulaire
Le tissu médullaire ovarien humain utilisé dans ce protocole a été prélevé auprès de quatre patientes pédiatriques diagnostiquées avec un tératome ovarien (âgées de 2, 6, 13 et 16 ans) qui ont donné du tissu ovarien à des fins de recherche (Tableau 1). Le cortex ovarien a été utilisé pour des études de cryopréservation des tissus ovariens, tandis que le tissu médullaire restant a été employé pour la culture folliculaire in vitro dans cette étude. Un total de 33 follicules secondaires ont été isolés, avec 16 follicules attribués au groupe témoin et 17 au groupe de culture 3D.

Préparation des réactifs
Le milieu de transport était constitué du milieu L-15 de Leibovitz complété par un complément de substitution sérique à 10 % et était stocké à 4 °C. La solution digestive complète a été préparée en complétant MEMα avec 0,04 mg/mL de Libérase DH, 10 UI/mL de DNase I et 100 UI/mL de pénicilline-streptomycine, puis stockée à -20 °C. La solution d’arrêt de la digestion était un DPBS complété par un complément de substitution sérique à 10 % et stocké à 4 °C. Le milieu de croissance complet a été préparé en complétant MEMα avec un supplément de substitution sérique à 10 %, 1 % d’insuline-transférrine-sélénium, 50 μg/mL d’acide L-ascorbique, 2 mM de pyruvate sodique et 100 UI/mL de pénicilline-streptomycine. Le milieu était stocké à 4 °C. L’hormone folliculo-stimulante humaine recombinante (FSH) a été ajoutée à une concentration finale de 100 mIU/mL lors de l’initiation de la culture, comme décrit dans une étude précédente¹⁰. Après la détection visuelle de la formation précoce d’antrum (vers le 20e jour), l’hormone lutéinisante humaine recombinante (LH) a été ajoutée à une concentration finale de 10 mIU/mL lors des changements de milieu. La matrice solide de culture a été préparée en mélangeant une matrice membranaire basale à 70 % (v/v) avec un milieu de croissance complet glacé à 30 % (v/v) et conservée sur glace lors de toutes les étapes de manipulation.

Digestion tissulaire et isolation secondaire des follicules
Le tissu ovarien était placé dans un milieu de transport et transporté au laboratoire à 4 °C. Dans des conditions stériles, la moelle ovarienne était disséquée à l’aide d’un scalpel. Le tissu a été coupé en morceaux fins (~3 × 3 × 1 mm) puis haché en petits fragments (~0,5 × 0,5 × 1 mm) à l’aide d’un découpeur de tissu, maintenant le tissu humide tout au long. Le tissu haché a été transféré dans un plat de 35 mm, et une solution digestive complète préchauffée a été ajoutée à 2 mL par tissu de 100 mg. L’incubation a été effectuée à 37 °C pendant 45 à 80 minutes (moyenne : 60 ± 15 minutes), avec un mélange doux toutes les 10 minutes. La digestion a été interrompue lorsque l’examen microscopique a révélé un desserrement de la matrice stromale et la libération de follicules individuels (Figure 1). Les follicules secondaires sains (diamètre 100–200 μm, avec ≥ 2 couches cellulaires de granulose et un ovocyte visible) ont été sélectionnés au stéréomicroscope à l’aide d’une pipette en verre à commande buccale (diamètre interne 200 μm) et lavés deux fois avec un milieu de croissance complet préchauffé.

Intégration 3D et culture à long terme
Un insert de culture cellulaire a été placé dans un plat de 35 mm humidifié avec 2 mL de milieu de croissance complet et pré-équilibré dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant 2 heures. Certains follicules secondaires sélectionnés ont été transférés dans l’insert et pré-cultivés pendant la nuit dans les mêmes conditions. À la fin de la pré-culture, les follicules du groupe témoin ont été cultivés directement à l’intérieur de l’insert (culture 2D). En revanche, les follicules désignés pour le groupe culture 3D ont été préparés pour être intégrés dans une matrice membranaire basale réduite par facteur de croissance (protéine totale 8~12 mg/mL). La matrice a été décongelée sur de la glace et mélangée à un milieu de croissance complet à 30 % (v/v) de glace. Des gouttelettes de 40 μL du mélange étaient placées dans un plat de 35 mm (maximum six gouttelettes par plat), pour former une couche de gel uniforme d’environ 1,5 mm de hauteur. Ensuite, un follicule secondaire unique était transféré dans chaque gouttelette à l’aide d’une pipette en verre à commande buccale, soigneusement placée dans le tiers moyen à supérieur de la gouttelette pour éviter qu’elle ne s’enfonce. Le plat a été placé dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant 30 minutes pour permettre la gélification. Après la solidification, 2 mL de milieu de croissance complet ont été délicatement ajoutés au plat pour initier la culture à long terme.

Entretien et suivi de la culture
Un changement de 50 % du milieu avec un milieu de croissance complet frais (contenant FSH) a été effectué toutes les 48 heures. Les follicules ont été observés quotidiennement au stéréomicroscope, et leurs diamètres ainsi que leurs caractéristiques morphologiques ont été enregistrés. Lors de la détection visuelle de la formation précoce d’un fourmon (vers le 20e jour), du LH humain recombinant a été ajouté au milieu lors des changements ultérieurs. La culture a été maintenue jusqu’à 30 jours ou jusqu’à ce que les follicules atteignent le stade antral (diamètre > 400 μm avec une cavité bien définie remplie de liquide).

Dissociation cellulaire post-culture
À la fin de la culture, les follicules antraux ont été transférés dans une boîte contenant du DPBS frais et dissociés mécaniquement à l’aide d’une seringue stérile de calibre 29. Les complexes cumulus-ovocytes (COC) isolés ont été transférés dans une antenne séparée pour une analyse plus approfondie. La suspension restante de granulose et de cellules thèques a été transférée dans un nouveau plat de 35 mm contenant 2 mL de milieu de croissance complet préchauffé, légèrement tournée pour une distribution uniforme, puis incubée pendant 48 heures (37 °C, 5 % CO₂).

Analyse d’immunofluorescence
Après la culture, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformodéhyde pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS, perméabilisés avec 0,5 % de Triton X-100 pendant 20 minutes, puis bloqués toute la nuit à 4 °C en utilisant 1 % de BSA dans le PBS. Les cellules ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires. Les principaux anticorps utilisés étaient l’anti-FSHR (lapin, 1:200) et l’anti-LHR (souris, 1:100). Après l’incubation, les cellules ont été lavées trois fois pendant 15 minutes chacune avec des PBS contenant 1 % de BSA. Par la suite, ils ont été incubés avec des anticorps secondaires fluorescents (anti-lapin et anti-souris, 1:200) pendant 2 heures à température ambiante dans l’obscurité. Enfin, les cellules ont subi trois lavages finaux, chacun durant 20 minutes. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, les échantillons ont été lavés trois fois pendant 5 minutes avec du PBS contenant 1 % de BSA. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie à haut contenu Operetta CLS en mode confocal. Les signaux de fluorescence ont été capturés via les canaux suivants : DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) et Alexa Fluor 647 (FSHR), avec des réglages d’exposition cohérents sur tous les échantillons.

Analyse statistique
Des comparaisons du diamètre des follicules entre le groupe témoin et le groupe de culture 3D aux jours 5, 10 et 15 ont été réalisées à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. L’analyse statistique du diamètre des follicules n’a pas été réalisée au-delà du 15e jour, car presque tous les follicules du groupe témoin n’ont pas survécu après le 15e jour. Cela a conduit à une taille d’échantillon insuffisante, empêchant ainsi des comparaisons de groupes fiables et significatives. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism (version 9.0).

Résultats

Développement d’un modèle de culture 3D soutenant la croissance folliculaire humaine jusqu’au stade antral
Un défi majeur dans la recherche sur les follicules ovariens est le développement d’un système de culture in vitro qui soutient le développement complet du follicule, la formation de la cavité antrale étant une étape clé. Ainsi, cette étude a établi un modèle de culture 3D pour les follicules humains in vitro (Figure 2

Discussion

Le maintien réussi des follicules ovariens humains in vitro grâce à la transition du secondaire vers l’antral représente une avancée technique significative. Dans cette étude, un système de culture 3D fournissant un soutien biophysique approprié et des indices hormonaux spécifiques à chaque stade a permis cette progression. Ces résultats s’alignent sur des preuves récentes soulignant la nécessité de systèmes de culture 3D pour reproduire la physiologie tissulaire. Bien que les m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondaire)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondaire)	Abcam	AB205718
Matrice de membrane basale pour la culture d'organoïde	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Insert de culture cellulaire	Millipore	PICMORG50
Plat de culture	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubateur	Thermo	Heracell 3111
Insuline-Transferrine-Sélénium	Gibco	41400045
Acide L-ascorbique	MCE	HY-B0166
Milieu Leibovitz's L-15	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
Hachoir à tissus McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldéhyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Pénicilline-Stréptomycine	Gibco	15140122
Supplément de substitut de sérum	FUJiFILM Irvine	90194
Pyruvate de sodium	Gibco	11360070
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ1270
Le système d'imagerie à haut contenu	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100