Article de méthode

Stratégie intégrée UHPLC-MS/MS et HRMS pour le dépistage des composés potentiellement hépatotoxiques contenant du furan chez Dioscorea bulbifera L.

DOI :

10.3791/70865

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19 mai 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

Dans cet article

Résumé

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Cette étude a développé une stratégie intégrée combinant UHPLC–MS/MS et HRMS pour dépister des composés potentiellement hépatotoxiques contenant du furan chez Dioscorea bulbifera L.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dioscorea bulbifera L. (DBL), une médecine traditionnelle à base de plantes utilisée pour traiter les troubles thyroïdiens et les tumeurs, a soulevé d’importantes préoccupations en matière de sécurité en raison de ses effets hépatotoxiques potentiels. Des recherches antérieures suggèrent que cette lésion hépatique pourrait être liée à l’activation métabolique des composés contenant du furan (FCC) présents dans la DBL. Ici, nous avons caractérisé systématiquement les FCC et leurs métabolites réactifs dans l’extrait DBL grâce à une approche analytique intégrée combinant chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse tandem (UHPLC-MS/MS) et la chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution tandem (UHPLC-HRMS). En utilisant des analyses spectrométriques de masse ciblées et non ciblées, nous avons identifié un total de 849 constituants dans l’extrait aqueux de DBL, dont 10 furanoditerpénoïdes et 17 FCC supplémentaires. Pour élucider les voies d’activation métaboliques, nous avons utilisé le glutathion (GSH) et la 4-bromobenzylamine (BBA) comme agents de double piège au sein d’un système d’incubation microsomal du foie (MLM) de souris. Par métabolisme médié par P450, sept adducts correspondants dérivés de diosbulbine B (DSB), C (DSC), D (DSD), E (DSE), L (DSL), N (DSN) et 2-pentylfurane ont été piégés et caractérisés avec succès. Cette étude établit une approche sensible et spécifique pour le profilage complet des composés potentiellement hépatotoxiques du furan dans DBL, et fournit des informations précieuses sur la formation des métabolites réactifs et les mécanismes de toxicité liés à la phytothérapie contenant du furan.

Introduction

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Les préoccupations liées à la sécurité liées à la médecine traditionnelle chinoise (MTC), en particulier les lésions hépatiques induites par des médicaments (DILI), entravent leur utilité clinique généralisée et leurmodernisation 1,2,3. De plus en plus de preuves suggèrent que la plupart des constituants de la MTC ne sont pas intrinsèquement toxiques ; Au contraire, leur hépatotoxicité résulte d’une activation métabolique in vivo 1,4,5. Les composés contenant du furan (FCC) sont bien reconnus comme des précurseurs hépatotoxiques importants, subissant une activation métabolique médiée par P450 pour produire des intermédiaires électrophiles hautement réactifs, en particulier des cis-enedials, essentiels pour initier la toxicité hépatique. Ces métabolites électrophiles forment des adducts covalents avec les thiols de cystéine et les groupes aminés des protéines essentielles, facilitant ainsi la progression des effets toxiques 6,7,8.

En MTC, Dioscorea bulbifera L. (DBL) a été largement utilisée pour le traitement des troubles thyroïdiens, des tumeurs et des maladiescutanées 9,10. Un total de 152 constituants chimiques ont été isolés et caractérisés à partir de DBL, dont 41 furanoditerpénoïdes11. Parmi celles-ci, la diosbulbine B (DSB), un composant bioactif majeur, a démontré induire des lésions hépatiques dans les modèles murins, un effet étroitement lié à la formation du cis-énedial (DDE) dérivé du DSB12,13. Portée par les avancées dans l’instrumentation analytique, la spectrométrie de masse est devenue un outil important pour analyser des composants chimiques complexes et des métabolites de laMTC 14,15. Conventionnellement, les cis-enedials produits par le métabolisme du DSB sont détectés en piégeant des espèces électrophiles avec de la N-acétyl-L-lysine en combinaison avec du glutathion ou de la N-acétyl-L-cystéine, suivies d’une analyse LC-MS/MS des dérivés chimiquement stables dupyrrole résultant 16,17. En s’appuyant sur cette approche, nous avons précédemment développé une stratégie améliorée employant le piégeage simultané d’intermédiaires métaboliques dérivés du furan avec le GSH et le BBA, couplé à une analyse LC-MS/MS utilisant un balayage de perte neutre de 129 Da et un balayage ionique précurseur de m/z 272 pour les adducts GSH, ainsi qu’un scan ionique précurseur 1:1 de m/z 169 et 171 dérivé de la moitié BBA pour la détection du pyrrole (Figure 1)18, 19. Bien qu’efficace pour les furanoïdes connus, cette approche présente des limites notables lorsqu’elle est appliquée à des mélanges complexes, en particulier pour les FCC dépourvues d’informations structurelles préalables. Par conséquent, il reste urgent un besoin urgent d’une stratégie analytique globale capable de permettre une caractérisation chimique approfondie des matrices complexes de la MTC tout en soutenant un dépistage efficace des précurseurs hépatotoxiques.

Ici, nous présentons une stratégie intégrée pour la caractérisation systématique des FCC potentiellement hépatotoxiques dans DBL (Figure 2). La stratégie comprend trois étapes clés : (i) un profilage chimique complet de l’extrait aqueux de DBL à l’aide d’une métabolomique (WTM) largement ciblée basée sur UHPLC–MS/MS ; (ii) piégeage des intermédiaires réactifs générés par les FCC avec GSH et BBA ; et (iii) la détection et l’élucidation structurelle des adducts de GSH/BBA formés par activation métabolique de constituants potentiellement toxiques à l’aide de HPLC–MS/MS et UHPLC–MS/MS. Cette approche intégrée permet d’identifier sans ambiguïté les principaux précurseurs toxiques responsables de l’hépatotoxicité induite par la DBL à partir de matrices complexes de la MTC et fournit un cadre hautement sensible et spécifique pour l’évaluation de la sécurité de la MTC.

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Protocole

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REMARQUE : Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de la solution de test DBL

  1. Collectez et authentifiez trois lots de tubercules de Dioscorea bulbifera L. Conformément à la Spécification Nationale pour le Traitement de la MTC, retirez les racines fibreuses des tubercules, lavez-les pour enlever la saleté, coupez-les en tranches circulaires de 1 cm d’épaisseur lorsqu’elles sont fraîches, séchez les tranches dans un four à air forcé à 60 °C, puis retirez-les et refroidissez-les à températureambiante de 20.
  2. Pèser 200 g de DBL de chaque lot et broyez-les en une poudre grossière (taille de particule 250-850 μm) à l’aide d’un concasse-papier à grande vitesse.
  3. Faites tremper 20 g de poudre brute dans 200 mL d’eau déionisée (1:10, p/v) pendant 30 minutes. En même temps, on traite un mélange des trois lots de poudre grossière préparés à l’étape 1.2 (mélangés au ratio 1:1:1, à la fois par mois).
  4. Extraire le matériau imbibé en chauffant sous reflux pendant 60 minutes. Filtrez l’extrait à travers une gaze ou un tamis pour éliminer les résidus insolubles. Ajoutez 200 mL d’eau déionisée au résidu restant et répétez l’extraction du reflux deux fois, chacune pendant 60 minutes. Combinez les trois filtrats et concentrez l’extrait en pool en faisant bouillir jusqu’à un volume final de 100 mL.
  5. Transférez l’extrait concentré dans un lyophilisateur sous vide et liophilisez pour obtenir de la poudre.
  6. Pesez précisément 18 mg de chaque lot de poudre d’extrait. Dissoudrez chacun dans 1,5 mL d’acétonitrile à 50 %, puis faites passer le mélange en vortex pendant 30 s pour assurer l’homogénéité.
  7. Centrifugez la solution à 13 800 x g pendant 10 minutes à 4°C et collectez le surnageant comme solution d’incubation MLM.
  8. Pipeter 20 μL de la solution d’origine, diluer à 1:50 avec 50 % d’acétonitrile, puis utiliser un vortex pendant 30 s. Ensuite, filtrez la solution à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm pour obtenir la solution d’échantillon prête à l’analyse par spectrométrie de masse.

2. Caractérisation chimique de la DBL

  1. Conditions chromatographiques
    1. Utilisez une colonne C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) et réglez la température du four à colonne à 40 °C. Préparez la phase mobile A en acide formique à 0,1 % (v/v) dans l’eau et la phase mobile B sous forme d’acétonitrule.
    2. Programmer l’élution du gradient comme suit : 0–10 min, 2 %–50 % B ; 10–11 min, 50 % – 95 % B ; et 11–13 min, 95 % de B. Régler le débit à 0,4 mL/min et injecter 2 μL de l’échantillon.
  2. Effectuer une analyse par spectrométrie de masse en utilisant les paramètres suivants : Source ionique : ionisation électropulvérisatrice IonDrive Turbo V (ESI) ; Mode acquisition : Surveillance des réactions multiples (MRM) avec acquisition simultanée en modes ions positifs et négatifs ; Tension de pulvérisation ionique : +5,5 kV (positif) / −4,5 kV (négatif) ; Gaz rideau : 35 psi ; Température source : 400 °C ; Gaz source d’ions 1 : 60 psi ; Gaz source d’ions 2 : 60 psi ; Potentiel de dégroupement (DP) : ±100 V.
  3. Traitement des données
    1. Acquérir et traiter les données MRM à l’aide du logiciel SCIEX Analyst (v1.6.3). Convertissez les fichiers de données brutes (.wiff) en format TXT à l’aide de MSConvert. Annotez les composés détectés en interrogeant la bibliothèque propriétaire BiotreeDB (V2.1) MS. L’annotation reposait sur l’appariement des temps de rétention (RT), des rapports masse/charge (m/z) et des motifs de fragmentation avec des standards authentiques.

3. Caractérisation des conjugués GSH/BBA générés lors des incubations MLM

  1. Incubation MLM
    1. On dégèle lentement la suspension microsomale du foie de souris sur la glace. Sur glace, préparez le mélange d’incubation dans un tube microcentrifuge de 2 mL en ajoutant séquentiellement les composants listés ci-dessous. Ajoutez le système régénérant le NADPH en dernier. Pour le groupe témoin, remplacer le système régénérant le NADPH par un volume égal de PBS glacé. Vortex brièvement pour mixer.
      1. Préparez un mélange d’incubation composé des composants suivants : suspension microsomale du foie de souris (MLM, protéine 4 mg/mL) : 125 μL ; Solution de chlorure de magnésium (MgCl₂) (32 mM) : 10 μL ; DBE (12 mg/mL) ou solution standard DSB (35 mM) : 10 μL ; Solution de glutathion (GSH) (50 mM) : 100 μL ; Solution BBA (250 mM) : 10 μL ; Tampon PBS (pH 7,4, contenant 1,0 mol/L EDTA et 0,1 mol/LK 2HPO 4) : 145 μL ; Solution du système régénérant NADPH (5,0 mM) : 100 μL.
    2. Immédiatement après la fin de l’incubation, retirez tous les tubes de l’incubateur. Terminez la réaction enzymatique en ajoutant 1 mL d’acétonitrile glacé (-20 °C) à chaque tube.
    3. Vortex pendant 3 minutes pour précipiter les protéines. Centrifugez à 13 800 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
    4. Collectez le surnageant, filtrez à travers une membrane de 0,22 μm, puis transférez le filtrat dans un flacon autoéchantillonneur.
  2. Dépistage préliminaire de l’incubation MLM d’extraits DBL par HPLC-MS/MS
    1. Conditions chromatographiques
      1. Utilisez une colonne C18 (150 mm x 4,6 mm, 3 μm) et réglez la température de la colonne à 25 °C. Préparez la phase mobile A en acide formique à 0,1 % (v/v) dans l’eau et la phase mobile B sous forme d’acétonitrule.
      2. Suivez la pente suivante : 0–2 min, 10 % B ; 2–15 min, augmentation linéaire de 10 % à 90 % B. Réglez le débit à 0,8 mL/min et injectez 5 μL de l’échantillon préparé.
    2. Conditions de spectrométrie de masse. Réglez la plage de balayage complet à m/z 500–1000. Des scans d’ions précurseurs (PI) à m/z 169 et 171, un balayage de perte neutre (NL) de 129 Da en mode ion positif, et un scan PI à m/z 272 en mode ion négatif. Définir les paramètres clés comme suit : tension de pulvérisation ionique (IS), +5 500 V (positif) / −4 500 V (négatif) ; potentiel de dégroupement (DP), ±70 V ; potentiel d’entrée (EP), ±10 V ; énergie de collision (CE), +35 V (positif) / −40 V (négatif) ; potentiel de sortie de la cellule de collision (CXP), ±10 V ; gaz source d’ions 1 et 2 (GS1/GS2), 50 psi chacun ; gaz de rideau (CUR), 40 psi ; et la température source (TEM), 650 °C.
    3. Acquérir et traiter toutes les données de spectrométrie de masse à l’aide du logiciel SCIEX Analyst (v1.6.3).
  3. Identification des dérivés du pyrrole et des FCC par UHPLC-HRMS
    1. Conditions chromatographiques
      1. Utilisez une colonne C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,9 μm) et réglez le four à colonne à 30 °C. Préparez la phase mobile A en acide formique à 0,1 % (v/v) dans l’eau et la phase mobile B sous forme d’acétonitrule.
      2. Programmez le gradient comme suit : 0-20 min, 5 % à 95 % B ; 20-21 min, 95 % de B. Réglez le débit à 0,3 mL/min et injectez 2 μL de l’échantillon.
    2. Réaliser une analyse par spectrométrie de masse avec les paramètres suivants : Source ionique : ESI ; Tension de pulvérisation ionique : +3,5 KV (ions positifs)/-2,5 KV (ions négatifs) ; Température capillaire : 320 °C ; température du chauffe-sonde : 350 °C ; Gaz de gaine : 10 ARB ; courant de pulvérisation maximal : 100 μA ; Niveau RF de l’objectif S : 50 % ; énergie de collision : 35 V (ions positifs) et 40 V (ions négatifs) ; Portée de balayage : 100-1000 m/z.
    3. Prétraitement des données
      1. Sur la base des FCC identifiées à partir de DBL et du mécanisme de piégeage (Figure 1), extraire les conjugués GSH/BBA prédits à l’aide de ChemBioDraw Ultra 14.0 (Figure supplémentaire 1).
      2. Importez les fichiers bruts HRMS acquis (.raw) dans le module Qual Browser de Xcalibur (V4.1). Créez un flux d’identification dans le logiciel pour filtrer les conjugués GSH/BBA.
      3. Comparez les spectres expérimentaux MS1 et MS2 avec les structures prédites des conjugués GSH/BBA dérivés des FCC (prédites via ChemBioDraw Ultra 14.0) sur la base des mécanismes d’adduction connus (Figure 1 et Figure supplémentaire 1). Utilisez un seuil d’intensité maximale minimal de 1 x 105 et une tolérance de précision de masse de ± 10 ppm pour tous les ions surveillés. Confirmer les conjugués en se basant sur le motif isotopique caractéristique du brome (environ 1:1) observé dans les spectres MS1 et MS2 , incluant les ions diagnostiques à m/z 169 et 171.
      4. Déterminer les poids moléculaires des FCC parentes en soustrayant la masse de la balise GSH/BBA des ions moléculaires observés. Utilisez 472/474 Da (C17H21O 5N4BrS) pour la soustraction.
      5. Caractérisez les FCC mères dans DBL par UHPLC–HRMS sur la base des résultats obtenus ci-dessus.

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Résultats

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FCC identifiées dans DBL
Pour caractériser le profil chimique du DBL, une combinaison de WTM et de profilage HRMS à base de quadrupoles triples a été utilisée. Cette approche double a permis une analyse complète des paires d’ions extraites, générant des chromatogrammes d’ions extraits (EIC, Figure 3A) et des chromatogrammes d’ions totaux (TIC, Figure 3B) très instructifs. Dans des conditions chromatographique...

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Discussion

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Les recherches précédentes sur l’hépatotoxicité de la DBL se sont principalement concentrées sur les intermédiaires métaboliques des FCC individuelles en utilisant des stratégies de captureciblées 9,22. Bien que ces approches fournissent des informations mécanistiques précieuses, leur efficacité dans des matrices herbacées complexes est souvent limitée par la faible détectabilité des intermédiaires bioactivés à faible abondance. ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82360759), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guizhou (n° ZK [2024]406, ZK [2024] 397, Station postdoctorale [2021]007, BSH [2024]005), et Université de médecine traditionnelle chinoise du Guizhou TD Hopes [2023]005.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-BromobenzylamineJiuding Chemical (Shanghai) Technology Co., LtdX114214A
AcétonitrileSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd1000294000
CentrifugeuseWuxi BaiTaKe Biotechnology Co., LtdCR3180
Chromatographique  ; sample  ; bouteillesZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Diosbulbine BChengdu PufeiDe Biotech Co., Ltd18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1 ; DBL-2 ; DBL-3Les matériaux végétaux ont été authentifiés par le Professeur Weike Jiang (Université de Médecine Traditionnelle Chinoise de Guizhou, Guiyang, Chine), avec des spécimens de référence déposés au Laboratoire clé de pharmacologie de base de la province du Guizhou.
Balancière électroniqueUsine d’instruments électroniques Anting de ShanghaiFA1004B
Acide formiqueThermo Fisher Scientific  ;Co., Ltd195715
GlutathionSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., LtdSLBX5462
Haute vitesse  ; BroyeurYongkang Biao Hardware Products Co., LtdXC-2000Y
Microsomes hépatiques de souris de Kunming (mâles)Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.MB12496-1
Chlorure de magnésiumBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdM8161
MéthanolSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd646377
Filtre milliporeTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., LtdNylon66
NADPH Na4Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd102X022
FourInstrument de laboratoire et instruments de laboratoire de Tianjin Equipment Co., LtdGFL125
Solution physiologique tamponnée au phosphateBeyotime Biotechnology & nbsp ; Co., LtdC0221B
Thermostatique   ; eau  ; bath  ; oscillateurShanghai Zijia Instrument Co., LtdTHZ-82A
Ultra-congélateurThermo Fisher Scientific  ;Co., LtdTDE60086FV-ULTS
Nettoyeur ultrasonoreShanghai Zijia Instrument Co., LtdL10-250A
Mélangeur à vortexUsine d’instruments médicaux Jiangsu HaimenVM-D

Références

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D pistage de l h patotoxicitUHPLC HRMSm tabolites r actifsmicrosomes h patiquesm tabolisme du P450pi geage au glutathionefuranoditerp no des
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