Article de méthode

Un modèle oromucoses porcine ex vivo standardisé pour l’évaluation des flux peptidiques

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DOI :

10.3791/70935

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9 juin 2026

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1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une plateforme de dépistage utilisant des muqueuses épithéliales buccaux porcines fraîchement isolées pour évaluer la perméation des peptides. La méthode intègre la perméation d’un GLP-1RA en présence d’un améliorateur de perméation provenant de solutions, de chambres Hilltop, de films dans des cellules de diffusion Franz, ainsi que d’inserts imprimés en 3D, accompagnés d’une évaluation histologique de la muqueuse.

Résumé

L’administration oromuqueuse de médicaments sous forme de films, comprimés, pastilles et autres formes posologiques offre une voie systémique pratique pour les patients pédiatriques et âgés, ainsi que pour ceux qui ne peuvent pas avaler facilement des capsules ou des comprimés. Le développement de formulations peptidiques buccales et sublinguales nécessite des modèles précliniques alignés avec les structures épithéliales oromuqueuses non kératinisées de l’humain, parmi lesquelles les porcs et les chiens sont les plus adaptés. Nous avons récupéré des tissus oromucoseux porcins frais jetés dans un abattoir. Les muqueuses ont été disséquées du muscle lisse sous-jacent par chauffage contrôlé, puis montées soit dans des cellules de diffusion Franz, soit dans des inserts résine résinés imprimés en faible volume. Des combinaisons peptide-perméation améliorées ont été ajoutées du côté donneur, et des molécules perméées ont été échantillonnées du côté récepteur et quantifiées par chromatographie liquide ultra-haute performance (uHPLC). Pour les inserts, les valeurs de résistance électrique transépithéliale (TEER) des muqueuses montées ont été mesurées à l’aide d’électrodes de baguettes EVOM. L’histologie tissulaire a été examinée après incubation dans les cellules de diffusion de Franz et les inserts 3D. La concentration optimale d’un améliorateur de perméation a été choisie lorsque des mélanges aqueux de peptides et d’amplificateurs ont produit une augmentation de la perméation. La perméation peptidique a atteint 4,3 % sur 3 h dans les inserts tridimensionnels (3D) et 1,7 % dans les modèles de chambre Hilltop, ces derniers simulant une exposition directe à partir d’un film buccal. Des films mucoadhésifs polymériques couche par couche contenant des combinaisons peptide-amplificateur ont été développés et appliqués sur le tissu muqueuseux pour des études de perméation à l’aide de chambres de diffusion. La perméation peptidique ex vivo à travers les muqueuses buccales porcine a atteint 2 % lorsque celles-ci ont été exposées à la combinaison optimale de glycodésoxycholate (GDC) incorporée dans les films buccaux. Ces études de dépistage ex vivo offrent une voie vers une évaluation pharmacocinétique ultérieure de formulations de films chargés de peptides administrées par voie oromuqueuse chez les porcs et les humains.

Introduction

Les oromuqueuses buccales et sublinguales sont des voies attractives d’administration orale car elles offrent des sites directement accessibles et évitent le métabolisme hépatique en premier passage, améliorant potentiellement la biodisponibilité et l’acceptabilité par le patient par rapport à d’autres voies, y comprisla voie orale 1,2. Les peptides sont généralement administrés par injection plutôt que par voie orale en raison d’une mauvaise perméation à travers l’épithélium intestinal, en raison de leur poids moléculaire plus élevé, de leur hydrophilicité et de leur susceptibilité à la dégradationenzymatique 3. La FDA a approuvé 102 peptides pour des applications thérapeutiques, dont ~450 peptides thérapeutiques sont en cours d’évaluation dans des essais précliniques oucliniques 4. Cela inclut des comprimés oraux formulés avec des amplificateurs de perméation (par exemple, sémaglutide, Rybelsus)5 et des plateformes oromuqueuses (Minirin Melt et acétate sublingual de desmopressine Nocdurna) développées avec la technologie des comprimés désintégrants orales (ODT) deCatalent 6. Malgré des recherches approfondies sur les études de perméabilité buccale des médicaments, les valeurs de perméabilité des molécules montrent une faible reproductibilité et une comparabilité limitée entre les études 7,8. Ces incohérences proviennent en grande partie de variations dans les modèles animaux expérimentaux utilisés et de différences dans la manipulation et la préparation des muqueuses buccalesisolées 9.

Les tests de perméabilité ex vivo utilisant des muqueuses buccales et sublinguales isolées sont un outil précieux pour prédire la perméabilité in vivo des petites molécules oromuqueuses et pour le dépistage préclinique des composants de formulation pertinents pour les formesposologiques 10, 11, 12 ; cependant, leur utilisation dans le criblage peptidique a été limitée car la perméabilité basale est négligeable. Ces dernières années, la muqueuse buccale porcine est devenue le modèle privilégié car sa structure non kératinisée ainsi que ses caractéristiques physiologiques et biochimiques ressemblent étroitement à celles del’humain. Les échantillons buccaux de chiens sont encore moins accessibles que les tissus porcins des abattoirs, bien que les deux sources soient nonkératinisées 14. Une variabilité considérable de l’épaisseur épithéliale et des méthodes de traitement persiste. La standardisation de la préparation oromuqueuse buccale et sublinguale est essentielle. Des variables telles que les conditions de stockage à court et long terme, l’épaisseur des tissus et le maintien de la viabilité lors des expériences influencent toutes les résultats de perméabilité ex vivo 8. La préservation tissulaire est essentielle, car l’intégrité structurelle et l’activité métabolique de la muqueuse affectent directement les profils de diffusion12,15. La perte de la fonction barrière peut entraîner des taux de perméation artificiellementélevés des médicaments 16,17. Au-delà du stockage, la méthode utilisée pour disséquer les muqueuses buccales porcines pour les monter dans les chambres de perméation introduit une variabilité supplémentaire. Les différences dans l’élimination du tissu conjonctif sous-muqueus, que ce soit par des moyens mécaniques, chimiques ou thermiques, peuvent modifier laperméabilité 18. Bien que certains rapports suggèrent que la séparation de la chaleur pour isoler l’épithélium du muscle lisse préserve laperméabilité 19, le consensus fait défaut. Actuellement, il n’existe aucune méthode universellement acceptée pour disséquer et évaluer l’intégrité des muqueuses buccalesisolées 20. Le sucre hydrophile marqué fluorescéine isothiocyanate-dextran (FITC dextran 4000, FD-4) est couramment utilisé comme marqueur d’intégrité pour la muqueuse buccale porcine car seules les petites molécules inférieures à ~500 Da peuvent pénétrer passivement dans le tissu. En revanche, une muqueuse intacte limite le transport FD-4, et un transfert donneur-receveur en dessous de 0,6 % est généralement considéré comme acceptable sur 2 à 4 h21,22. De plus, la coloration tissulaire par hématoxyline et éosine permet d’évaluer directement la morphologieépithéliale 23.

Dans ce travail, nous avons établi un protocole standardisé pour la manipulation des muqueuses buccales porcinales isolées, conçu pour optimiser l’intégrité et la perméabilité muqueuses sur une période donnée. Nos objectifs étaient de fournir un cadre expérimental pour disséquer le tissu épithélial buccal porcin et d’améliorer la fiabilité des évaluations de perméabilité ex vivo des peptides à travers les oromuqueuses montées dans des chambres de diffusion et des inserts. Nous avons d’abord réalisé des analyses visuelles pour identifier la muqueuse buccale non endommagée provenant de l’abattoir. Nous avons optimisé les techniques de traitement des tissus, l’épaisseur de la muqueuse et les méthodes pour maintenir l’intégrité tissulaire lors des expériences. En utilisant un agoniste stable et faible puissance du récepteur peptide-1 de type glucagon (GLP-1 RA) comme molécule d’outil, nous avons réalisé des études de perméation peptidique en présence et en l’absence d’un amplificateur de perméation des sels biliaires, le glycodésoxychlorate de sodium (GDC), sur des muqueuses buccales montées dans des cellules de diffusion de Franz et des inserts artisanaux de type transwell imprimés en 3D personnalisés. La GDC et la GLP-1 RA ont été présentées à des muqueuses buccales issues de solutions, de chambres Hilltop et de films polymères multicoliques bicouches. Nous avons utilisé des marqueurs de perméabilité, l’histologie tissulaire et les valeurs de résistance électrique trans-épithéliale/endothéliale (TEER) comme critères principaux d’évaluation.

Protocole

Les joues de porc utilisées dans cette étude ont été prélevées dans un abattoir local ; par conséquent, aucune approbation éthique n’était requise.

1. Isolement, préparation et stockage de l’épithélium buccal porcin

  1. Prélever les tissus des joues de porc dans un abattoir local et transporter en moins de 90 minutes au laboratoire dans un sérum tampon phosphaté glacé (PBS, pH 7,4). Dans les 60 minutes suivantes, préparez les tissus selon la méthodologieprécédemment décrite 19,24, avec des modifications mineures pour différents sites oromucoses comme montré à la Figure 1.
  2. À l’aide d’un scalpel, séparez les muqueuses buccales du tissu sous-jacent et rincez le tissu trois fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS). Éliminez les muqueuses présentant des dommages à la surface visuelle.
  3. Immergez les muqueuses intactes dans le PBS à 65 °C pendant 3 minutes et séparez l’épithélium et le tissu conjonctif sous-jacent restant du muscle lisse à l’aide d’une pince horloger taille 5. Cette méthode est également applicable pour isoler les muqueuses épithéliales sublinguales et de la langue.
  4. Séchez doucement les oromuqueuses disséquées sur du papier filtre à la cellulose et procédez à des études de perméation (option préférable) ou congelez pendant un maximum de 4 semaines.
  5. Pour le processus de congélation après séparation, immergez les oromuqueuses pendant 2 heures dans un cryoprotecteur, 85 % de glycérol25, avec un léger secouement. Le glycérol à haute viscosité remplace l’eau intercellulaire pour empêcher la formation de cristaux d’eau, qui pourraient endommager la structure tissulaire.
  6. Après cette période, remplacer le glycérol par du PBS frais et du glycérol à 10 %. Congelez les échantillons de muqueuse à -20 °C ou -70 °C, selon la durée de stockage requise. Effectuer la procédure de congélation à un taux contrôlé de ~-1 °C·min-1.
    REMARQUE : Toutes les expériences sont menées à partir d’au moins trois échantillons de tissus provenant des joues de différents animaux.

2. Étude de perméation ex vivo dans des muqueuses montées dans des cellules de diffusion de Franz et utilisation de chambres Hilltop pour présenter la RA GLP-1 et la GDC

REMARQUE : Des études de perméabilité ex vivo sont réalisées initialement sur des muqueuses buccales porcines fraîches isolées à l’aide de cellules de diffusion de Franz (FDC).

  1. Montez les muqueuses tissulaires disséquées dans des chambres (surface de fenêtre 1,2cm 2) illustrée à la Figure 2 et équilibrez pendant 30 minutes avec PBS, pH 6,8 (côté donneur, volume de 1 mL) et PBS, pH 7,4 (côté récepteur, volume de 10 mL).
  2. Après 30 minutes d’équilibre, remplacer la solution donneuse PBS (pH 6,8) par 1 mL de PBS contenant un rapport 1:1 entre le GLP-1RA (25 mg/mL) et le GDC (25 mg/mL).
  3. Continuez à agiter la chambre du récepteur avec 10 mL de PBS pH 7,4, maintenu à 37 °C à 300 tr/min. Échantillonner 1 mL du compartiment récepteur toutes les 60 minutes pendant 180 minutes. Prélève des échantillons triplicats dans les compartiments des donneurs au début et à la fin de l’expérience. Après chaque échantillonnage, rechargez les chambres avec 1 mL de PBS.
  4. À la fin de l’expérience, stockez le tissu dans 10 % de formol pour l’histologie ou homogénéisez-le pour quantifier le peptide GLP-1RA restant dans le tissu.
  5. De même, il faut effectuer la perméabilité du GLP-1RA à l’aide de chambres Hilltop (HTC).
    REMARQUE : Le but de l’utilisation du HTC est de confirmer l’effet d’amélioration de la perméation oromuqueuse de la GDC sur le GLP-1 RA en solution avant de formuler un film buccal à deux couches. Le HTC est une chambre construite à partir de Kraton G-2705, un copolymère bloc biocompatible styrène-éthylène-butylène-styrène (SEBS), d’un diamètre extérieur de 19 mm, et contient un tampon Webril (diamètre de 12,7 mm) composé à 100 % de fibres de coton non tissées, servant de matériau absorbant antiadhésif pour l’application ensolution 26.
  6. De même, évaluer la perméabilité ex vivo du GLP-1RA et du GDC (rapport 1:1) chargés dans des films bicouches mucoadhésifs en plaçant les films dans des chambres donneuses des FDC ou dans des inserts 3D, comme décrit pour le HTC.
  7. Pour confirmer l’intégrité du tissu épithélial buccal porcin, utilisez FD-4 (0,05 mM) comme marqueur de flux fluorescent et ajoutez-le du côté donneur pour évaluer les fuites à travers le tissu.
    REMARQUE : Les tissus présentant des fuites sont exclus des calculs de perméabilité.
  8. Après l’expérience de 3 h, quantifiez le flux cumulatif de GLP-1 RA par analyse uHPLC des échantillons de 200 μL prélevés du compartiment basolatéral en triple licat. Répétez toutes les expériences de perméation trois fois. Quantifier le flux cumulatif de GLP-1RA à partir d’une courbe d’étalonnage générée à partir de concentrations fixes de GLP-1RA.

3. Préparation de films buccaux piégés avec le GLP-1RA et le GDC

REMARQUE : Les films bicouches buccaux contenant une mucoadhésive et une couche de support sont fabriqués par moulage à solvant avec un revêtementsemi-automatisé 27.

  1. Préparez un film bicouche pour piéger le GLP-1RA en utilisant HPMC et PVP-K90 comme polymères formateurs de film, ainsi qu’un composant mucoadhésif, Na-CMC.
    REMARQUE : Consultez le tableau 1 pour la composition de la couche mucoadhésive et de support du film buccal. La GDC est incorporée avec un peptide GLP-1 RA dans des films modèles en faible quantité de mg afin d’observer son effet sur la perméation peptidique à travers les muqueuses buccales porcines montées dans des chambres.
  2. Préparez la couche mucoadhésive en dissolvant les polymères formateurs de films, 45 mg de HPMC, 10 mg de Na-CMC et 25 mg de PVP-K90, dans de l’eau déionisée contenant 3 % de glycérol à 400 tr/min pendant 10 minutes à l’aide d’un agitateur magnétique à plaque chauffante.
    REMARQUE : Le HPMC est soluble à température ambiante, tandis que le PVP-K90 nécessite un chauffage à 40 °C pendant 30 minutes pour se dissoudre.
  3. Ajoutez 2 mg d’Aerosil 200 F sous le brassage, suivi de l’ajout du GLP-1 RA. Ensuite, ajoutez du GDC et dispersez-le à 600 tr/min pendant 30 minutes.
  4. Ultrasoniser la solution polymère finale pendant 90 minutes à l’aide d’un bain d’ultrasonicisation pour éliminer les bulles.
  5. Moulez les films sur un liner de polyéthylène térephtalate (PET) et endussez avec une lame docteur réglée à 2600 μm à 2 mm/s. Faites sécher les films dans un four à air chaud à 40 °C pendant ~1 heure.
  6. Pour la couche de fond, dissoudez 5 % d’éthyle cellulose (CE) et 5 % de propylène glycérol (PG) dans de l’eau hydroalcoolisée (éthanol : eau), puis jetez la bouillie dissoute sur un revêtement PET. Enfin, découpez les films séchés en carrés de 1 cm × 1 cm, emballez des sachets en aluminium et conservez-les à 4 °C.

4. Impression d’un insert 3D personnalisé imitant le transwell

REMARQUE : Les inserts personnalisés imprimés en 3D sont fabriqués selon une méthode précédemment décrite avec des modificationsmineures 28.

  1. En résumé, concevez le modèle 3D à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
  2. Conservez les dimensions de l’insert 3D identiques à celles du corps cylindrique principal (chambre donneuse), avec une surface maximale de 1659,06mm2, et des dimensions extérieures globales de 25,20 mm sur l’axe des x, 14,50 mm sur l’axe des y et 21,63 mm sur l’axe z.
  3. De plus, concevez un anneau de rétention circulaire détachable pour soutenir le tissu épithélial. L’anneau a un diamètre extérieur d’environ 19,90 mm et un diamètre intérieur de 17,93 mm, correspondant aux dimensions du corps cylindrique principal, et peut s’adapter aux plaques Transwell à 12 puits (Figure 3).
  4. Fabriquez tous les composants à l’aide d’une imprimante 3D stéréolithographie (SLA) de bureau avec une résine transparente polyvalente aux UV. Toutes les dimensions sont approximatives et peuvent être ajustées selon les besoins pour garantir un bon ajustement dans les Transwells et la compatibilité expérimentale.
    REMARQUE : Pour garantir l’élimination des monomères non réagis et des potentiels lixiviables, toutes les pièces ont subi un protocole de post-traitement standardisé, incluant un lavage de 10 minutes dans de l’alcool isopropylique à 99 % (IPA) impeccable, suivi d’un durcissement UV selon les spécifications du fabricant, c’est-à-dire 1 minute à température ambiante dans un Form Cure 2. Le fichier stéréolithographique (STL) pour la conception de modèles 3D se trouve dans https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 ou dans les fichiers complémentaires (Fichier Supplémentaire 1 et Fichier Supplémentaire 2).

5. Perméation à travers les muqueuses montées dans des inserts 3D

REMARQUE : La perméabilité ex vivo du GLP-1RA et du GDC incorporée dans des films buccaux bicouches mucoadhésifs peut également être évaluée à l’aide d’inserts 3D à faible volume, conçus sur mesure imitant Transwell (Figure 2), en alternative aux FDC. Cela s’explique par le fait que le côté récepteur de 10 mL des FDC dilue le peptide, mettant en cause la sensibilité à la détection de l’uHPLC. La conception FDC n’est donc ni rentable ni pratique pour les flux peptidiques, car elle nécessiterait une détection continue d’un test immunosorbent lié à une enzyme (ELISA) ou d’une radioimmunoanalyse (RIA).

  1. Fabriquez/imprimez les inserts dans une résine à curation UV à l’aide d’une imprimante SLA3D de bureau 28, et montez-les sur des plaques de culture tissulaire à 12 puits.
  2. Positionner les muqueuses buccales porcines sur une fenêtre de 1,4 cm2 entre les chambres apicale et basolatérale, mesurer la résistance électrique transépithéliale de base (TEER) à l’aide d’un voltohmmètre EVOM 2 avec des électrodes STX2 de baguettes placées sur les côtés donneur et récepteur des inserts. Le TEER est calculé selon la loi d’Ohm.
  3. Après avoir placé le film (1,0 × 1,0cm 2) sur le dessus du tissu, on pipettez 0,5 mL de PBS (pH 6,8) dans la chambre apicale et 1,5 mL de PBS (pH 7,4) dans la chambre basolatérale.
  4. Prélever des échantillons (0,2 mL) des côtés du récepteur à des intervalles d’une heure sur 3 h et remplacer par des volumes égaux de tampon frais.
  5. Quantifier le peptide GLP-1 RA fluxé par uHPLC.
    REMARQUE : Aucune adsorption de GLP-1RA avec inserts 3D n’est observée après 3 heures, comme montré dans la Figure Supplémentaire 1 et le Fichier Supplémentaire 3.
  6. Mesurez la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l’aide d’un voltohmmètre EVOM 2 avec des électrodes STX2 à des intervalles de 1 h sur 3 heures. Le TEER est calculé selon la loi d’Ohm.
  7. Pour confirmer l’intégrité des tissus épithéliaux buccales et sublinguales porcines, utilisez FD-4 (0,05 mM) comme marqueur fluorescent.
    REMARQUE : Toutes les expériences sont réalisées en triple exemplaire, et les résultats rapportés correspondent à la moyenne ± DE de trois ensembles de données.

6. Détection uHPLC du GLP-1 RA

  1. Quantifier la quantité de GLP-1 RA perméée à travers les oromuqueuses montées dans des FDC et inserts, à partir de chacune des solutions côté donneur, HTC et films par uHPLC à l’aide d’une colonne CSH C18 (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) avec une phase mobile de 0,1 % d’AGT dans l’acétonitrile (Eluent A) et 0,1 % d’AGT dans l’eau (Eluent B), élution en gradient sur 8 minutes à 30 °C, avec un volume d’injection de 20 μL et un débit de 0,7 mL/min, et une détection UV à 214 nm (temps de rétention : ~4,2 min).
  2. Réalisez une étude de linéarité.
    1. Concevoir une étude de linéarité pour estimer la réponse analytique des conditions optimales de l’uHPLC à l’aide de normes d’étalonnage GLP-1 dans la plage de 2,5 à 20,0 μg·mL⁻1.
    2. Préparer des étalons d’étalonnage (n = 6–8 niveaux) indépendamment et injecter les échantillons en triple exemplaire. Effectuer une régression linéaire des moindres carrés de la surface de pic (mAU) par rapport à la concentration nominale, et évaluer la linéarité en utilisant le coefficient de détermination (r2), le pourcentage d’interception y et la distribution des résidus (réponse observée–prédite).
      REMARQUE : L’inspection visuelle du graphique d’étalonnage et du graphique des résidus a indiqué une déviation insignifiante par rapport à la linéarité au niveau de sensibilité le plus bas (2,5 μg·mL⁻1), avec des résidus dans la limite d’acceptation prédéfinie (±3 %). La plage d’étalonnage est ensuite limitée à une plage de 2,5 à 20,0 μg·mL⁻1, à laquelle la régression a montré une linéarité acceptable (r2 ≥ 0,999, % d’interception y < 2 %, et tous les résidus se situant dans ±3 %).

7. Estimation du GLP-1RA retenu dans le tissu buccal

  1. Retirez les muqueuses épithéliales buccales porcines exposées à la RA GLP-1 et à la GDC des FDC/inserts.
  2. Rincez le tissu trois fois avec du PBS pour retirer les excipientes adsorbés et les films.
  3. Ensuite, homogénéisez le tissu dans 5 mL de PBS à l’aide d’un homogénéiseur sur table jusqu’à ce qu’il soit complètement fragmenté.
  4. Conservez l’échantillon toute la nuit à 4 °C pour permettre l’équilibre de la partition peptidique entre le tissu homogénéisé et le PBS.
  5. Ensuite, centrifugez le mélange à 5000 × g pendant 5 minutes pour précipiter les fragments et collecter le surnageant pour la quantification.
  6. Stériliser le surnageant à l’aide de filtres centrifugeuses de 0,22 μm pour éliminer les particules résiduelles avant l’analyse uHPLC.

8. Histologie des tissus oromucoss

REMARQUE : Après 3 heures de perméation du GLP-1 RA à partir de mélanges, HTC ou films, les muqueuses sont traitées pour évaluer les dommages.

  1. Fixez les tissus à 10 % de formol pendant 48 heures, puis incorporez les tissus fixés dans la paraffine.
  2. Coupez les tissus à une taille de 5 μm à l’aide d’un microtome.
  3. Ensuite, colorez les tissus avec de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) pour examiner l’intégrité histologique à l’aide de la microscopie optique à un grossissement de 4×.
  4. Les lames sont imagées à l’aide d’un microscope vertical et analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
    REMARQUE : Le flux de travail global est résumé à la Figure 4.

Résultats

Isolement et dissection des tissus épithéliaux buccaux porcins
La muqueuse buccale porcine est largement utilisée comme tissu substitutif pour les oromuqueuses humaines car elles partagent des caractéristiques anatomiques comparables et des propriétés de barrière physiologique29. Les tissus épithéliaux buccaux porcins sont isolés à la fois par des méthodes chirurgicales et de chauffage, comme montré à la Figure 4. Au départ, un scalpel est utilisé pour retirer les muscles et les tissus conjonctifs profonds des joues. Les morceaux isolés de tissu avec des couches muqueuses combinées et intactes et du tissu conjonctif sont ensuite placés dans des PBS chauds chauffés à 65 °C pendant 3 minutes. Le tissu est retiré du tampon, et l’épithélium ainsi que la lamina proprie sous-jacente sont retirés avec une pince taille 5. Le chauffage permet une épaisseur constante et uniforme dans l’épithélium disséqué résultant.

Perméation ex vivo d’un GLP-1RA à travers des oromuqueuses buccales porcines montées dans des FDC et des inserts imprimés en 3D
La perméation ex vivo de GLP-1RA a été évaluée à l’aide de muqueuses épithéliales buccales porcines montées dans des FDC et des inserts. Pour évaluer le rapport optimal de concentration de la GLP-1 AR : GDC, des HTC contenant des coussinets de coton d’une surface de 12,7 mm ont été fixés sur le côté donneur des muqueuses montées dans les FDC, et le mélange peptide-amplificateur a été pipetté sur le coton compressé. La perméation cumulative de la RA GLP-1 a atteint environ 4,3 % sur 3 heures lorsque la GDC a été incluse à un ratio 1:1 (GLP-1RA 25 mg : GDC 25 mg). En revanche, en l’absence de GDC, aucun flux détectable de GLP-1RA n’a étéobservé 27. Les paramètres quantitatifs de perméabilité, y comprisl’application P, sont calculés selon la formule suivante :

Papp = figure-results-1

Où :
P application : coefficient de perméabilité apparente (cm/s).
dQ/dt : taux de transport du GLP-1RA à l’état stationnaire, calculé comme la quantité de peptide transportée par unité de temps (μg/s).
A : aire de l’insert 3D (cm2).
Co : la concentration initiale du peptide dans le compartiment donneur (apical) (μg/mL).

Le coefficient de perméabilité apparent (Papp) de GLP-1RA à travers les muqueuses buccales porcines est illustré dans la Figure Supplémentaire 2. Lorsque le rapport GLP-1RA :GDC était de 1:1, les mêmes concentrations que pour les HTC étaient intégrées dans les films bicouches ; cependant, la perméation du GLP-1RA à travers les tissus buccaux porcins isolés n’était pas quantifiable avec la configuration conventionnelle de la FDC, car la présentation du GLP-1RA des films vers les muqueuses est plus lente que celle des mélanges en solution ou des HTC. Pour surmonter cette limite, des inserts personnalisés à faible volume imprimés en 3D ont été développés afin de réduire le volume du récepteur à 1,5 mL, améliorant ainsi la sensibilité de détection. À l’aide d’inserts 3D, la perméation cumulative de GLP-1RA à partir de films buccaux sur 3 heures était mesurable et atteignait environ 1,8 %, comme montré à la Figure 5. Les valeurs TEER et les flux FD-4 ont été utilisées pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale et la perméabilité paracellulaire. Une baisse dépendante du temps de la TEER a été observée (Figure supplémentaire 3) dans les groupes traités et correspondait à une augmentation de la perméation de GLP-1AR. Le PBS et les tissus traités à pellicule vierge n’ont montré aucun changement dans le TEER, indiquant que la matrice bicouche du film n’a pas perturbé la barrière. Ces données impliquent la GDC comme principal contributeur à l’effet d’amélioration de la perméation.

Évaluation histologique des tissus porcins
Une évaluation histologique de la muqueuse buccale porcine ex vivo a été réalisée afin d’évaluer l’impact des méthodes d’isolement tissulaire et d’examiner l’intégrité épithéliale après 3 heures d’exposition au GLP-1RA et à la GDC. Comme montré à la Figure 6, les tissus fraîchement isolés obtenus par la méthode de chauffage ont conservé une architecture physiologique épithéliale normale, avec des couches stratifiées intactes et un mucus de surface continu, et n’ont montré aucune trace de dommage structurel. En revanche, les tissus isolés par séparation mécanique ou soumis à un stockage/congélation présentaient de légères altérations de la morphologie des cellules épithéliales et une réduction de l’épaisseur du mucus de surface. Les muqueuses buccales exposées à 25 mg de GLP-1RA en présence de 25 mg de GDC ont conservé l’intégrité épithéliale et ressemblaient étroitement à des témoins non traités. Seuls un œdème léger et une érosion épithéliale superficielle ont été observés. Exposition à GLP-1RA seule ou à des étoiles et GLP-1RA : Les films bicouches chargés en GDC n’ont pas produit de lésions tissulaires visibles, et les caractéristiques histologiques étaient comparables à celles des tissus témoins traités avec PBS.

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Figure 1 : Cavité buccale porcine montrant les zones muqueuses buccales et sublinguales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : FDC et composants. Six chambres sont montées dans un système intégré (à gauche). Un individu, Franz Cell, est montré (au milieu). Le système de montage du tissu buccal dans une chambre individuelle (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Composants d’inserts en résine 1 cm 2 imprimés en 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : Flux de travail pour l’isolement, le montage, la perméation et la caractérisation histologique de l’épithélium buccal porcin. Créé en BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5 : Quantité cumulative de l’RA GLP-1. La quantité cumulative ex vivo de GLP-1 AR a pénétré du côté récepteur de la muqueuse épithéliale buccale porcine après 180 minutes d’application de 25 mg/mL de GLP-1RA (rouge), 25 mg/mL de GLP-1RA : 25 mg/mL de solution GDC (noir), et 25 mg/mL de GLP-1RA : 25 mg/mL de GDC chargé dans des films (violet) appliqués via HTC, FDC et inserts 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 6 : Images microscopiques colorées à HE des muqueuses épithéliales buccales porcines sous différentes conditions d’exposition. (A) film vierge, (B) mélange aqueux de GLP-1RA : GDC, (C) films piégés avec GLP-1RA :GDC, (D) muqueuses isolées de tissu frais après traitement thermique (65 °C), (E) épithélium buccal isolé de tissu congelé après traitement thermique, (F) muqueuses isolées par une méthode mécanique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Composition de la couche mucoadhésive
ComposantsConcentration (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glycérol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Couche de support
Éthylcellulose5 mg
Propylène glycol5 mg

Tableau 1 : Composition des couches mucoadhésives et de couches de fond de film buccal.

Figure supplémentaire 1 : Adsorption de GLP-1RA après incubation de 0,5 mg de GLP-1RA pendant 6 heures avec des inserts 3D. Les données correspondent à la moyenne ± écartement de trois expériences (n = 3).Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 2 : Coefficient de perméabilité apparent (Papp) d’un GLP-1RA après exposition de 3 h de tissu muqueuseux buccal porcine monté dans des inserts 3D. 25 mg/mL de solution GLP (rouge), 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de solution aqueuse GDC (noir), et 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de GDC intégrés dans les films buccaux (violet). Les données représentées sont la moyenne ± DE (n = 3). Une signification statistique entre les groupes a été observée : p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Résistance transépithéliale (TEER). Réduction progressive de la résistance transépithéliale (TEER) à partir de tissu épithélial buccal porquin isolé fixé dans des inserts 3D, après exposition à 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de solution GDC (rouge), 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de GDC dans des films buccaux (vert), et 25 mg/mL de GLP-1RA dans PBS (bleu). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Intégrité tissulaire et fuite. L’intégrité et la fuite tissulaire ont été évaluées en exposant les tissus épithéliaux buccaux porcins dans des inserts 3D à 0,05 mM FD4 du côté donneur. Les échantillons ont été prélevés à intervalles fixes de 60 minutes sur 6 heures. Moyenne +SD de trois expériences. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : transwell-v9 (JOVE).stl.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Détails expérimentaux supplémentaires.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette méthodologie décrit des protocoles expérimentaux pour l’isolement des épithélios buccales et autres épithélios oromucoss porcins, ainsi que des tests de perméabilité pour des thérapies peptidiques utilisant un analogue stable de GLP-1RA à faible puissance commeexemple 30. Les peptides sont des macromolécules hydrophiles avec une perméabilité négligeable à travers les membranes muqueuses17. La réussite de l’exécution du protocole ci-dessus repose sur une isolation précise et un montage des muqueuses buccales et sublinguales. L’isolation nécessite une compétence spécialisée et un contrôle rigoureux de la température ; Même de légères fluctuations thermiques lors du processus de chauffage peuvent induire des modifications physiologiques et morphologiques délétères du tissu épithélial, compromettant finalement l’intégrité des données de perméation. De plus, la fixation du tissu isolé dans les inserts personnalisés imprimés en 3D représente une étape cruciale. Compte tenu de la nature délicate des couches épithéliales, le risque de rupture ou de fuite tissulaire lors du montage est plus élevé. Pour atténuer cela, nous avons utilisé un test de fuite FD4, qui sert de mesure de contrôle qualité pour garantir l’intégrité de la membrane avant de commencer les études de flux. La fuite FD4 a d’abord été évaluée visuellement puis quantifiée davantage par spectroscopie UV-visible. Les données correspondantes sont fournies dans les données complémentaires (Figure 4 et Fichier 3 supplémentaires).

La FDC conventionnelle, considérée comme la norme pour les études ex vivo , pose souvent des difficultés lors de la quantification des thérapies peptidiques en raison des volumes élevés dans la chambre réceptrice, généralement 10 mL. Le volume élevé conduit à une dilution excessive de l’échantillon, poussant les concentrations de peptides perméés en dessous du LOD plus bas pour les méthodes analytiques standard. Pour éviter cela, nous avons développé un insert novateur imprimé en 3D qui imite l’échelle et les volumes du système de transwells utilisé pour les monocouches de cellules épithéliales, y comprisCaco-2 31. Les inserts peuvent être placés directement dans des plaques de culture tissulaire standard à 12 puits et accueillent de manière sécurisée des muqueuses épithéliales buccales porcines isolées. Cette modification réduit considérablement le volume du compartiment donneur de près de 7 fois à 1,5 mL, se concentrant ainsi sur l’analyte et surmontant les limites de sensibilité de l’uHPLC. Cette adaptation est particulièrement importante pour la quantification des médicaments peptidiques coûteux à faible perméabilité.

Une augmentation de la perméation de l’AR GLP-1 en présence de GDC a été observée à l’aide du système d’insertion 3D. La quantité cumulative perméée de GLP-1RA a atteint ~55,3 μg en 3 heures, correspondant à ~4,3 % de la concentration initialement appliquée du côté donneur. En revanche, aucun flux mesurable de GLP-1 RA n’a été détecté lorsque des concentrations similaires de GLP-1RA et de GDC piégées dans des films buccaux ont été appliquées sur des muqueuses buccales montées dans des FDC, suggérant qu’une perméation peptidique a pu se produire mais est restée analytiquement indétectable en raison d’une dilution excessive dans le grand volume du récepteur. Cependant, la perméation cumulative de GLP-1 RA à partir de la formulation du film buccal bicouche a atteint environ 1,8 % en 3 h dans des inserts 3D sur 3 heures, démontrant la faisabilité de détecter le transport peptidique de bas niveau à travers le tissu buccal à partir des formes posologiques en utilisant le système de récepteur miniaturisé. La perméation ex vivo de GLP-1 RA a également été évaluée à l’aide de cellules HTC contenant un coton chargé du peptide et du GDC. C’est un dispositif de dépistage initial très utile pour prouver le concept que la présentation d’un peptide provenant de films avec un amplificateur de perméation est possible. L’intégrité de la barrière de l’épithélium buccal porcin peut être surveillée pendant l’expérience à l’aide de fuites TEER et FD-4. Une diminution lente et dépendante du temps du TEER a été observée lors de l’exposition à l’agoniste du récepteur GLP-1 (GLP-1 AR), ce qui est cohérent avec une augmentation du transport paracellulaire induite dans les muqueuses buccales par le selbiliaire 32.

Une limitation de cette technique est la dépendance aux tissus porcins frais, qui ne sont pas toujours disponibles à la demande des abattoirs, et la qualité des tissus peut varier. Pour répondre aux contraintes liées à l’obtention de tissu frais à une distance raisonnable du laboratoire, nous avons évalué la cryoprotection destinée à stocker des échantillons de haute qualité que nous pourrions utiliser ultérieurement. Bien que l’utilisation de tissu frais soit optimale, l’utilisation de tissus mucoseux isolés et stockés nécessite une utilisation soigneuse de cryoprotecteurs et de taux de congélation afin d’éviter la formation de cristaux de glace et les dommages subséquents à la barrière. Le protocole a la capacité de combler l’écart entre les études de perméation à grande échelle standard et l’analyse peptidique à haute sensibilité. En optimisant à la fois le processus d’isolement tissulaire et le protocole de perméation à l’aide d’inserts 3D, nous avons obtenu un degré de reproductibilité et de sensibilité supérieur à ce qui est généralement rapporté avec les FDC. De plus, l’utilisation d’inserts 3D offre un cadre permettant aux chercheurs de définir des limites de détection pour des molécules peptidiques coûteuses, représentant une amélioration significative de la flexibilité et du débit de la recherche muqueuse ex vivo .

Ces protocoles fournissent une base pour une mesure fiable de la perméation des tissus muqueuseux en utilisant des classes de médicaments au-delà des peptides. La capacité à générer des profils de perméation à haute résolution à partir de modèles ex vivo aidera à prédire les données d’absorption précliniques issues de modèles animaux. La perméation ex vivo de la RA GLP-1 a également été évaluée à l’aide de cellules HTC contenant un coton chargé du peptide et de la GDC, une solution d’amplificateur de la perméation. Cette approche d’administration garantissait un contact intime et reproductible entre l’admixture et la surface muqueuse. Une augmentation significative de la perméation de GLP-1RA a été observée avec un ratio 1:1 de GDC dans les inserts 3D imitant les transwells. C’est un dispositif de dépistage très utile pour prouver que la présentation d’un peptide à partir de films avec un améliorateur de perméation peut être possible dans un design construit adapté à partir de monocouches cultivées de cellules épithéliales vers des muqueuses tissulaires. L’intégrité de la barrière de l’épithélium buccal porcin peut être surveillée pendant l’expérience grâce à la mesure TEER et à la fuite FD4.

Dans l’ensemble , les évaluations ex vivo de la perméation et histologiques démontrent que l’évaluation fiable du transport peptidique buccal et sublingual en présence d’un améliorateur de perméation dépend de la préparation tissulaire, des protocoles de flux et de la sensibilité analytique. Parmi les approches d’isolation examinées, la séparation de l’épithélium buccal et sublingual porcin fraîchement obtenu par la méthode de la chaleur a permis un bon équilibre entre le maintien de l’intégrité épithéliale et la reproductibilité de la dissection tissulaire, comme en témoignent un TEER de base stable, une fuite minimale de FD4 et la préservation des structures cellulaires tissulaires. Il est important de noter que l’insert imprimé en 3D a nettement amélioré la fiabilité expérimentale en réduisant la dilution du compartiment récepteur, permettant la quantification de flux peptidiques faibles indétectables dans les FDC. Pris ensemble, ces résultats soutiennent l’utilisation de muqueuses épithéliales buccales porcines isolées dans une chambre d’insertion tissulaire comme plateforme ex vivo pour évaluer l’administration buccale de peptides thérapeutiques pour une délivrance systémique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune implication financière ni conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Ben Shovlin (UCD School of Veterinary Medicine) pour son assistance technique. Nous remercions également le Dr Hans Eckhardt (UCD School of Chemistry) pour son soutien à l’analyse uHPLC. Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon Europe de l’Union européenne dans le cadre de la subvention numéro 101071054. Nous reconnaissons également un soutien financier supplémentaire provenant de la subvention numéro 13/RC/2073_P2, du Research Ireland CURAM Center for Medical Devices et du Fonds européen de développement. Les auteurs tiennent à remercier Kenneth McNamara de Rosderra Irish Meats pour la fourniture de joues de porc.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Computer / LaptopGénériqueTout système standard>=8 Go de RAM recommandés
Script d'acquisition de donnéesPersonnalisécollect.pyScript d'acquisition basé sur Python
Électrodes en gel jetablesGénériqueÉlectrodes Ag/AgCl pré-gélifiéesÀ usage unique, adhésives
Module d'acquisition EEGUpside Down LabsBioAmp EXG PillInterface frontale analogique pour les signaux biopotentiels
Gel pour électrodes (si électrodes réutilisables utilisées)GénériqueGel conducteurAméliore la conductivité du signal
Application interactive (jeu)GénériqueTout jeu simple (par exemple, course)Interface contrôlée par clavier
Fiches de liaisonGénériqueConnecteurs mâle–femelleFiches de breadboard standard
Matplotlib / SeabornOpen-sourceDernières versionsBibliothèques de visualisation
Carte de microcontrôleurArduinoUno / Maker UnoADC 10 bits, interface USB
Environnement de programmation PythonPython Software FoundationPython ≥3.8Langage de programmation open-source
Bibliothèque PyTorchMeta AIVersion ≥1.12Cadre d'apprentissage profond
Scikit-learnOpen-sourceDernière version stableUtilitaires ML
Bibliothèques de traitement du signalSciPyDernière versionFiltrage, STFT
Câble USBGénériqueUSB Type-A vers BCâble de transfert de données

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