Sonder le microenvironnement ovarien : méthodes d’isolement, culture 2D et culture organoïde des cellules somatiques ovariennes de souris

Résumé

Nous décrivons des méthodes pour isoler les cellules somatiques ovariennes de souris à partir d’une fraction enrichie en strome de l’ovaire et pour générer des organoïdes somatiques ovariens de souris en utilisant une approche sans échafaudage.

Résumé

L’ovaire est constitué de populations hétérogènes de cellules somatiques, tant au sein du follicule que du strome environnant, qui sont essentielles pour soutenir la fonction ovarienne et la génération de gamètes de haute qualité. Nous rapportons des méthodes pour isoler les cellules somatiques des ovaires de souris, y compris les cellules endothéliales, épithéliales, stéroïdogènes, stromales et immunitaires. Lorsque ces cellules somatiques ovariennes primaires sont plaquées et cultivées dans un système traditionnel de culture 2D, l’hétérogénéité cellulaire, l’organisation, ainsi que les interactions cellule-cellule et matrice cellulaire typiques de l’ovaire sont perdues. Ainsi, nous décrivons également comment générer des organoïdes somatiques ovariens de souris en utilisant une approche sans échafaudage. Ces organoïdes s’auto-assemblent, maintiennent des populations cellulaires diverses et produisent des facteurs extracellulaires et sécrétés, y compris des cytokines. Les organoïdes peuvent être utilisés pour des expériences de co-culture et peuvent être maintenus en culture pendant au moins 3 semaines avec une forte viabilité. Dans l’ensemble, ces modèles permettent d’interroger la physiologie et la pathologie ovariennes du point de vue des cellules somatiques.

Introduction

Bien que l’ovocyte, ou gamète femelle, soit essentiel pour donner naissance à la génération suivante, les populations cellulaires somatiques dans l’ovaire jouent un rôle crucial dans le développement des gamètes, la production d’hormones stéroïdes et l’homéostasie ovarienne. Les ovocytes, entourés de cellules somatiques granuleuses et thèques, forment les unités fonctionnelles de l’ovaire appelées follicules. Les cellules de granulosa sont physiquement reliées à l’ovocyte par des projections transzonales et fournissent un soutien métabolique et nutritif à l’ovocyte en plus de réguler l’arrêt^{méiotique 1,2}. De plus, en réponse aux gonadotrophines, les cellules granuloseuses et thèques produisent des hormones stéroïdes, notamment des œstrogènes, de la progestérone et des androgènes, qui ont des effets au-delà du système reproducteur, affectant les systèmes cardiovasculaire, musculosqueletique et nerveux, et affectant ainsi la santé globale des femmes³. Les follicules ovariens se développent au sein d’un stroma ovarien hétérogène composé de vasculature, de cellules immunitaires, de plusieurs populations de fibroblastes interstitiels et de cellules mésenchymates, ainsi que d’une matrice extracellulaire (ECM)4 très ^ordonnée. Ce microenvironnement stromal fournit des indices physiques et chimiques qui influencent la croissance des follicules, l’ovulation et^{la lutéinisation 4}.

Plusieurs méthodes existent pour isoler et cultiver les gamètes et les follicules in vitro, et ces méthodes ont fait progresser notre compréhension de l’oogenèse et de la folliculogenèse⁵. Cependant, le compartiment somatique de l’ovaire est relativement peu étudié, en partie en raison du manque de modèles in vitro robustes. Les modèles actuels du compartiment somatique ovarien sont en grande partie limités à un seul type cellulaire, tels que les fibroblastes, les cellules épithéliales de surface ovarienne, endothéliales, immunitaires ou^granuloses 6,7,8,9,10,11. La culture de cellules ovariennes somatiques primaires définies de manière large en 2D favorise les populations de macrophages au fil du temps, entraînant une perte d’hétérogénéité^{cellulaire 12}. De plus, la culture monocouche bidimensionnelle (2D) traditionnelle ne permet pas les interactions diverses entre cellule et matrice cellulaire présentes dans l’ovaire. Les explantes de tissu ovarien maintiennent la complexité cellulaire et structurelle du tissu natif mais varient en composition selon l’endroit où elles ont été extraites dans^{l’ovaire 13,14}.

Les organoïdes sont des versions tridimensionnelles (3D), multicellulaires, miniaturisées d’organes ou de tissus, qui reproduisent l’organisation et le fonctionnement in ^{vivo 15,16}. Les organoïdes peuvent être générés à partir de cellules souches ou de cellules primaires isolées dans des tissus normaux ou^{malades 15}. Dans le contexte du système reproducteur féminin, des organoïdes ont été générés pour modéliser l’endomètre, la trompe de Fallope, le col de l’utérus et le^{placenta 17}. Cependant, en ce qui concerne l’ovaire, jusqu’à récemment, les modèles organoïdes étaient limités à un seul type cellulaire, comme les cellules épithéliales de surface ovarienne ou cancéreuses, ou ont été générés à partir de cellules souches pluripotentes induites pour ressembler à des structures folliculaires plutôt qu’au stroma^{ovarien 17,18}. Des études récentes ont généré et caractérisé des organoïdes à partir de populations hétérogènes de cellules somatiques isolées de tissu de souris, de macaques rhésus et de tissu ovarien^humain 19,20,21. Ces modèles organoïdes ont permis d’étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au vieillissement ovarien, ainsi que les effets de l’exposition aux phtalates sur la composition de la^{MCE 19,21}.

Compte tenu de l’importance cruciale des cellules somatiques, tant dans le follicule que dans le stroma, pour la fonction ovarienne, nous décrivons des méthodes pour isoler les cellules somatiques à partir d’une fraction enrichie en stroma des ovaires de souris et pour les cultiver in vitro en utilisant soit une culture monocouche traditionnelle, soit dans un modèle organoïde. En utilisant des micromoules d’agarose sans échafaudage, les cellules somatiques ovariennes forment des organoïdes en 1 à 3 jours. Les organoïdes préservent des populations clés de cellules ovariennes, notamment les fibroblastes, les macrophages et les cellules stéroïdogènes, et peuvent être cultivés jusqu’à 3 semaines avec une forte viabilité. Les organoïdes somatiques ovariens favorisent les évaluations transcriptomiques et histologiques, l’analyse de milieux conditionnés, la co-culture avec d’autres types cellulaires et les méthodes de criblage des composés. Dans l’ensemble, ces organoïdes constituent un modèle robuste pour l’interrogatoire in vitro et la modulation du compartiment somatique ovarien et peuvent être appliqués à l’étude du développement ovarien, du vieillissement, de la physiologie et de la pathologie.

Protocole

L’utilisation d’animaux pour élaborer ce protocole s’est faite conformément au Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université Northwestern et aux Lignes directrices des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (Numéro d’assurance du bien-être animal de l’Université Northwestern : A3283-01 ; ID du protocole IACUC : IS00013082_IM12). Les informations du fabricant et les numéros de catalogue pour tous les matériaux, y compris les moulages en silicone pour les micromoules, médias et compléments en agarose, sont fournies dans le Tableau des matériaux. Un aperçu des étapes du protocole est présenté à la Figure 1. Toutes les étapes du protocole doivent être réalisées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié, en conformité avec toutes les réglementations institutionnelles sur la biosécurité et la santé et sécurité environnementales, et, sauf indication contraire, au sein d’une armoire de biosécurité de classe II.

Figure 1 : Schéma de l’isolation des cellules somatiques ovariennes de souris, de la génération d’organoïdes somatiques ovariens et des applications en aval. Les ovaires de la souris sont isolés et la fraction stromale est enrichie. La fraction stromale enrichie est digérée enzymatiquement et mécaniquement. Les tissus non digérés sont épuisés. Les cellules sont pelletées, lavées, comptées et placées pour culture en 2D. Pour la génération d’organoïdes, après une culture 2D toute la nuit, les cellules sont prélevées à l’aide de la trypsine et sont retraitées en granules, lavées et comptées. Les cellules sont ensemencées dans des micromoules d’agarose pour la culture organoïde. Les organoïdes peuvent être utilisés pour l’histologie, l’extraction d’ARN/protéines, l’analyse de milieux conditionnés, les traitements, le dépistage de drogues, ainsi que la co-culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Préparation des milieux pour l’isolement et la culture des cellules somatiques ovariennes

REMARQUE : La digestion du tissu ovarien et l’isolement et la culture ultérieurs des cellules somatiques primaires nécessitent quatre types de milieux : milieux de dissection (DM ; utilisés aux étapes 2.3–2.4 pour la dissection et la perforation des ovaires de souris), milieux enzymatiques (EM ; utilisés aux étapes 2.5–2.8 pour la digestion enzymatique des ovaires de souris enrichis en stroma), milieux de trempe (MQ ; utilisés à l’étape 2.9 pour ralentir la digestion enzymatique), et les milieux de plaquage (PM ; utilisés aux étapes 2.11–2.14 et 4.6 pour le lavage, le plaquage et la culture 2D des cellules somatiques ovariennes primaires, ainsi que pour l’inactivation de la trypsine lors de la récolte des cellules à partir de cultures 2D). Tous les milieux doivent être préparés dans une armoire de sécurité biologique stérilisée de classe II ou une hotte à flux laminaire. Les recettes de médias listées ci-dessous sont suffisantes pour traiter les ovaires de 5 à 6 souris, mais doivent être réduites à l’échelle selon les besoins. Tous les milieux peuvent être préparés jusqu’à une semaine à l’avance et stockés à 4 °C, mais les enzymes pour la EM doivent être ajoutées fraîches le jour de l’isolement cellulaire.

1. Préparez du DM (15 mL) contenant 1 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 0,5 % de pénicilline-streptomycine (PS) dans le milieu L-15 de Leibovitz. Stérilisez le média à l’aide d’un filtre stérile.
   REMARQUE : La DM est tamponnée pour l’échange d’air ambiant et utilisée lors de la microdissection de l’ovaire à partir des tissus environnants, ainsi que pour l’enrichissement de la fraction stromal.
2. Préparez de l’EM (10 mL) contenant 1 % de FBS et 0,5 % de PS en αMEM. Ajoutez 82 unités enzymatiques/mL de collagénase IV et 0,2 mg/mL de DNase I (≥400 unités d’activité enzymatique/mg). Dissoudez les enzymes en les inversant puis stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre stérile.
   REMARQUE : Les milieux enzymatiques sont tamponnés au bicarbonate de sodium pour un échange d’air à 5 % de_CO2 et utilisés pour la digestion enzymatique des morceaux de tissu ovarien.
3. Préparez une QM (20 mL) contenant 10 % de FBS et 0,5 % de PS dans un milieu αMEM. Stérilisez le média à l’aide d’un filtre stérile.
   REMARQUE : La QM est un tamponnement au bicarbonate de sodium pour l’échange d’air à 5 % de_CO2 et utilisé pour la trempe de la digestion enzymatique.
4. Préparez de la PM (30 mL) contenant 10 % de FBS et 1 % de PS dans RPMI 1640 (contenant 25 mM HEPES et 2 mM de L-Glutamine). Stérilisez le média à l’aide d’un filtre stérile.
   REMARQUE : Le PM est tampon de bicarbonate de sodium pour l’échange d’air à 5 % de_CO2 et utilisé pour le plaque des cellules somatiques ovariennes primaires, ainsi que pour la culture en 2D.

2. Digestion des tissus ovariens et isolement des cellules somatiques primaires

REMARQUE : Les ovaires de souris sont isolés et digérés à la fois enzymatiquement et mécaniquement afin d’isoler les cellules somatiques primaires. Les ovaires de 5 à 6 souris peuvent être traités ensemble dans le même plat. Les étapes suivantes doivent être réalisées selon une technique aseptique, de préférence à l’aide d’un microscope disséquant dans une hotte à écoulement laminaire.

1. Ajoutez 10 mL d’EM, 20 mL de MQ et 20 mL de PM dans des boîtes de Petri séparées de 100 mm. Équilibrez les plats dans un incubateur de culture tissulaire (environnement humidifié, 37 °C avec 5 % de_CO2) pendant au moins 1 heure avant utilisation.
2. Faites chauffer du DM dans un bain-marie (37 °C) avant utilisation.
3. Disséquez les ovaires de souris dans une boîte de Petri de 35 mm contenant 3 mL de DM. Séparez les ovaires du tissu adipeux attaché, de l’oviduc et de la bourse ovarienne à l’aide de pinces à pointe fine et/ou de microciseaux (Figure 2Ai, ii). Utilisez un microscope disséquant selon les besoins pour la microdissection.
4. Transférez les ovaires disséqués sur une vitre de montre de 45 mm contenant 2 à 3 mL de DM. Au microscope disséquant, ancrer et perforer toutes les zones des ovaires à l’aide d’aiguilles d’insuline 28-G avec les mains non dominante et dominante, respectivement, pendant environ 10 minutes. Faites fréquemment tourner le tissu ovarien pour vous assurer que toutes les zones sont perturbées.
   REMARQUE : La perforation des ovaires enrichit la fraction stromale en libérant des follicules préantraux ainsi que des complexes cumulus-ovocytes et des cellules de granulosa provenant des follicules antraux (Figure 2Aiii–iv).
5. Utilisez des pinces à extrémité fine pour déplacer les ovaires de souris enrichis en stroma vers la boîte de Petri avec EM équilibrée (Figure 2Bi).
6. En travaillant rapidement pour minimiser les variations de température et de pH du milieu, déchirez les ovaires enrichis en stroma en morceaux d’environ 2 à 3 mm avec des pinces à pointe fine (Figure 2Bii).
7. Tenir la boîte de Petri en angle et pipeter à plusieurs reprises des morceaux de tissu ovarien contenant des morceaux de tissu ovarien avec une pipette p1000, réglée à 1 mL, 100× ou pendant 3 minutes, selon la première (Figure 2Biii). Faites tourner la boîte de Petri si nécessaire pour vous assurer que tous les morceaux de tissu sont pipettes.
   REMARQUE : Si le tissu est trop gros pour être pipettatu avec une pointe p1000, la pointe peut être découpée avec un scalpel stérile pour élargir l’ouverture. Le forage doit être suffisamment large pour laisser entrer la plupart (>50 %), mais pas toutes, les morceaux de tissu, créant ainsi un effet de cisaillement.
8. Transférez la boîte de Petri contenant des morceaux de tissu EM et ovarien dans un incubateur de culture tissulaire (environnement humidifié, 37 °C avec 5 % de_CO2) et incubez pendant un total de 30 minutes, retirez la plaque et pipettez à plusieurs reprises (100× ou pendant 3 minutes) après 15 minutes, puis à nouveau à la fin de l’incubation de 30 minutes (Figure 2Biii).
   REMARQUE : Après les 15 premières minutes d’incubation, les morceaux de tissu doivent être suffisamment digérés pour que > 80 % passent à travers une pointe de pipette p1000 sans avoir besoin de couper la pointe pour élargir l’ouverture. La durée totale de la digestion et la quantité de pipétage nécessaire dépendront de la taille initiale des morceaux de tissu déchirés. De plus, l’âge et la tension de la souris, la variabilité de l’activité des enzymes, ainsi que la taille du trou de la pipette peuvent tous influencer la vitesse de dégradation des tissus. La digestion doit être interrompue lorsque les morceaux de tissu ovarien sont décomposés en fragments d’environ 1 mm encore visibles à l’œil nu (Figure 2Biv). Une surdigestion peut entraîner une perte cellulaire et une diminution de la viabilité cellulaire.
9. Diluez les enzymes pour ralentir la digestion tissulaire en ajoutant 20 mL de MQ pré-équilibrée (Figure 2Ci).
10. Faites passer la suspension cellulaire à travers une tamis cellulaire de 40 μm placée sur un tube conique de 50 mL pour retirer les morceaux de tissu non digérés (Figure 2Cii). Centrifugez le filtrat à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour pelleter les cellules (Figure 2Ciii).
11. Lavez les cellules en retirant le surnageant par aspiration, en resuspendant la pellete cellulaire dans 1 mL de PM pré-équilibré, en transférant la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, puis en centrifugant à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour refaire les granules (Figure 2Civ).
12. Retirez le surnageant, remettez le pellet cellulaire en suspension dans 1 mL de PM, colorez une aliquote de 10 μL de cellules avec du bleu de trypan pour évaluer la viabilité cellulaire, et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour le nombre anticipé de cellules somatiques ovariennes primaires, selon la souche et l’âge de la souris, à ce stade du protocole d’isolement. La viabilité cellulaire à ce stade devrait être de >80 %.
13. Placez les cellules sur un récipient traité en culture tissulaire à une densité d’environ 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/^cm2 (par exemple, pour un nombre cellulaire d’environ 3 × 10⁶, les cellules placées sur un plat traité en culture tissulaire de 60 mm, et pour un nombre de cellules d’environ 1 × 10⁶, les cellules placées sur un puits d’une plaque traitée en culture tissulaire à 6 puits).
    1. Ajoutez du PM supplémentaire en fonction du volume total de la plaque ou du plat (par exemple, ajoutez 4 mL supplémentaires de PM si vous utilisez un plat de 60 mm ou 2 mL supplémentaires de PM si vous utilisez un puits d’une plaque à 6 puits).
       REMARQUE : La densité de placage indiquée ci-dessus est recommandée si les cellules seront utilisées pour la génération d’organoïdes après une culture 2D pendant la nuit. Pour une culture 2D plus longue, les cellules peuvent être placées à une densité plus faible. Les milieux de plaquage supplémentaires qui n’ont pas été équilibrés peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine. Le PM est nécessaire à la fois pour la génération d’organoïdes et pour maintenir les cellules somatiques ovariennes en culture 2D. À ce stade du protocole, les cellules somatiques ovariennes peuvent être maintenues dans une culture monocouche 2D (étape 2.14) ou peuvent être utilisées pour générer des organoïdes (passer à la Section 3). Une culture 2D toute la nuit avant la formation des organoïdes est nécessaire pour retirer les ovocytes des follicules à un stade précoce qui auraient pu passer à travers la tamoire cellulaire de 40 μm.
14. Après le plaquage toute la nuit (minimum 16 h), lavez les cellules avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS ; Mg/Ca, pH 7,0–7,3) pour éliminer les cellules mortes et les débris (Figure 3A). Ajoutez du PM frais après le lavage et remplacez le substrat par du PM frais un jour sur deux dans la culture (Figure 3B).
    REMARQUE : Malgré une forte viabilité cellulaire après l’isolement, une forte attrition du nombre total de cellules est généralement observée après le plaque pendant la nuit, soit en raison de la mort cellulaire, soit de l’incapacité à s’attacher au vaisseau de culture tissulaire (Figure 3A).

Figure 2 : Schéma de l’isolation des cellules somatiques ovariennes de souris. (A) Images représentatives de (i,ii) dissection des ovaires de souris et (iii,iv) enrichissement stromatique. L’ovaire de la souris est délimité par une ligne pointillée dans Ai. (B) Images représentatives de fragments de tissu ovarien tout au long de la digestion mécanique et enzymatique. Ovaires enrichis en stroma (i) avant et (ii) après la déchirure, (iii) morceaux de tissu ovarien pendant la pipetation, et (iv) morceaux de tissu ovarien après la digestion. (C) Images représentatives de (i) la trempe de la digestion, (ii) le filtrage de la suspension cellulaire, et (iii,iv) la pelletation des cellules somatiques ovariennes primaires de la souris. Les insertions dans Cii et Ciii montrent des fragments de tissu non digérés capturés respectivement par le filtre cellulaire et la pellete cellulaire après centrifugation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Les cellules somatiques ovariennes primaires peuvent être cultivées en 2D. (A) Images représentatives de lumière transmise des cellules somatiques ovariennes primaires placées dans un plat de 60 mm 16 h après le plaquetage, avant et après le lavage avec PBS. (B) Images représentatives de lumière transmise des cellules somatiques ovariennes primaires placées dans une plaque à 24 puits sur 3 jours en culture. Barres d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation de micromoules et de milieux d’agarose pour la génération et la culture d’organoïdes

REMARQUE : Les organoïdes somatiques ovariens sont générés et cultivés dans des micromoules d’agarose sans échafaudage avec des milieux organoïdes ovariens. Les micromoules d’agarose et les milieux organoïdes ovariens doivent être préparés selon une technique aseptique dans un cabinet de sécurité biologique stérilisé de classe II ou une hotte à écoulement laminaire.

1. Préparation des micromoules d’agarose
   1. Placez des moulages en silicone pour les micromoules et les pinces Graefe dans une pochette de stérilisation et un autoclave en utilisant un cycle de séchage (pression sur la chemise : 20 psi, température de la chambre : 250 °F (121,11 °C, temps de stérilisation : 15 min).
      REMARQUE : Plusieurs moulages en silicone peuvent être autoclavés et utilisés simultanément pour une génération plus rapide de micromoules d’agarose.
   2. Ajouter 1 mL de PBS contenant 1 % de PS à chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits pour le stockage des micromoules d’agarose.
   3. Dissoudre 1,5 % (p/v) d’agarose stérile dans le PBS en le chauffant au micro-ondes, dans un bain d’eau chaude ou sur une plaque chauffante.
      REMARQUE : La dissolution de l’agarose au micro-ondes dans un tube conique de 50 mL placé dans un bécher de 100 mL rempli d’eau fonctionne bien (Figure 4Ai). En plus de permettre une ébullition contrôlée, le bain-marie créé dans le bécher ralentit la re-solidification de l’agarose.
   4. Laissez l’agarose liquide refroidir à environ 50 °C jusqu’à ce que le tube puisse être manipulé confortablement.
   5. Pipeter lentement 300–350 μL d’agarose à 1,5 % dans la moule en silicone, tout en veillant à ne pas trop remplir ou à ne pas en sous-remplir et en évitant de créer des bulles (Figure 4Aii). Assurez-vous que l’agarose crée une couche plate au sommet du moulage plutôt qu’un bord concave ou convexe (Figure 4Aiii,iv). Faites éclater les bulles à l’aide d’une pointe de pipette stérile p10 avant que l’agarose ne commence à se solidifier (Figure 4Bi–iii).
   6. Laissez l’agarose solidifier dans le moulage en silicone pendant 2 à 3 minutes à température ambiante (Figure 4Biv).
   7. Une fois solide, inversez le moulage de silicone sur un puits de la plaque de culture tissulaire à 24 puits contenant PBS + 1 % de PS. Fléchissez soigneusement le silicone pour libérer le micromoule d’agarose dans la plaque (Figure 4Ci).
      REMARQUE : Les micromoules d’agarose immergés dans du PBS +1 % PS dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits enveloppés dans du parafilm peuvent être stockés à 4 °C jusqu’à 1 mois avant l’utilisation (Figure 4Cii). Les micromoules d’agarose doivent être préparés au moins 16 heures avant utilisation, car les micropuits contiennent souvent des bulles d’air immédiatement après la fonte et la plongée dans le PBS + 1 % de PS (Figure 4Ciii). Cependant, ces bulles d’air se dissipent lors du stockage (Figure 4Civ). Avant d’être utilisés pour la culture organoïde, les inserts de micropuits d’agarose doivent être examinés soigneusement au microscope afin de confirmer que les micropuits n’ont pas été fusionnés ou perturbés lors du moulage (Figure 4Di–iv). Les micromoules défectueux ne sont pas recommandés pour la génération et la culture d’organoïdes. Il est recommandé de préparer un excès de micromoules d’agarose pour expliquer ~25 % de défauts
2. Préparation des milieux organoïdes ovariens
   1. Dans un cabinet de biosécurité, ajoutez les suppléments de milieu de croissance organoïde (Mouse) 1 et 2 et 1 % de PS dans le milieu basal selon les instructions du fabricant. Conservez le milieu organoïde ovarien préparé à 4 °C pendant jusqu’à 2 semaines avant utilisation.
      REMARQUE : Les suppléments 1 et 2 peuvent être aliquotés et stockés à -20 °C.

Figure 4 : Préparation schématique des micromoules d’agarose. (A) Images représentatives de (i) préparation à 1,5 % d’agarose, (ii) pipettage dans des moulages en silicone, (iii) correctement remplis, et (iv) moulages en silicone surchargés. Les lignes pointillées dans Aiii et Aiv montrent respectivement des fonds plats et convexes des micromoules d’agarose. (B) Images représentatives de (i,ii) des moulages en silicone remplis de bulles dans l’agarose, (iii) des bulles éclatées avec une pointe de pipette avant la solidification de l’agarose, et (iv) un micromoule d’agarose solidifié à l’intérieur du moulage en silicone. (C) Images représentatives de (i) retrait de micromoules d’agarose solidifiés des moulages en silicone, (ii) stockage des micromoules d’agarose dans une plaque à 24 puits contenant PBS + 1 % de PS, (iii) des bulles présentes dans les micropuits immédiatement après la coulée, et (iv) un micromoule d’agarose sans bulles, correctement coulé, après 16 h de stockage. (D) Images représentatives de micromoules avec (i,ii) puits combinés, (iii) puits perturbés, ou (iv) dommages. Abréviations : PBS = solution physiologique tamponnée au phosphate ; PS = pénicilline-streptomycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Génération et culture des organoïdes

REMARQUE : Après culture 2D pendant la nuit, les cellules somatiques ovariennes primaires sont prélevées à partir de la culture 2D et ensemencées dans des micromoules d’agarose pour générer des organoïdes. Les étapes suivantes doivent être réalisées à l’aide d’une technique aseptique dans une armoire de sécurité biologique stérilisée de classe II.

1. Tièdez le PM et le milieu organoïde à 37 °C dans un bain-marie et réchauffez 0,05 % de trypsine à température ambiante.
2. À l’aide de pinces Graefe, transférez soigneusement les micromoules dans les puits d’une nouvelle plaque à 24 puits (Figure 5Ai).
3. Ajouter 500 μL de milieux organoïdes ovariens à chaque puits de la plaque à 24 puits contenant un micromoule d’agarose (Figure 5Aii). Assurez-vous que les micromoules sont entièrement immergés dans le milieu et équilibrez les micromoules et le milieu pendant au moins 30 minutes dans un incubateur (environnement humidifié, 37 °C avec 5 % de_CO2).
4. Retirez le PM des cellules somatiques ovariennes adhérentes en aspirant et lavez les cellules avec du PBS sans Mg/Ca.
5. Ajoutez 0,05 % de trypsine (1 à 2 mL de trypsine pour une plaque à 6 puits ou un plat de 60 mm) pour récolter les cellules à partir de cultures 2D. Incubez les cellules avec de la trypsine pendant 2 à 3 minutes à 37 °C dans un incubateur.
6. Confirmez que les cellules se sont détachées au microscope et inactivez la trypsine en ajoutant deux volumes de PM chaud pour chaque volume de trypsine utilisé.
7. Transférez la suspension des cellules dans un tube conique de 15 mL, puis pelletez les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Resuspendez les cellules dans 1 mL de PM chaud, colorez une aliquote de cellules avec du bleu de trypan pour évaluer la viabilité cellulaire, puis comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   REMARQUE : Voir le tableau 1 pour le nombre anticipé de cellules somatiques ovariennes primaires, selon la souche et l’âge de la souris, après une culture 2D pendant la nuit et une trypsinisation ultérieure. La viabilité des cellules trypsinisées est généralement supérieure à 90 %.
9. Pelletez les cellules par centrifugation (300 × g pendant 5 minutes à température ambiante) et resuspendez le pellet cellulaire dans un milieu organoïde ovarien à une densité de 3,33 × 10⁶ cellules vivantes par 1 mL de milieu, c’est-à-dire 2,5 ×^{10 5} cellules vivantes pour 75 μL de milieu.
   REMARQUE : Ici, 2,5 ×^{10 5} cellules sont semées par micromoulant d’agarose. Ainsi, le nombre total de micromoules pouvant être générés dépendra du nombre total de cellules. Les organoïdes peuvent être générés avec moins de 2,5 × 10 cellules⁵ par micromoulant d’agarose, mais la taille des organoïdes, la cinétique d’agrégation, la composition cellulaire relative et les fonctions, y compris la production d’hormones, peuvent être affectées.
10. Retirez les micromoules d’agarose équilibrés de l’incubateur, assurez-vous que les micromoules sont orientés de manière à ce que la chambre d’ensemencement des cellules soit orientée vers le haut, et retirez le milieu organoïde ovarien des chambres d’ensemencement cellulaire (Figure 5Aiii).
    1. Retirez le milieu des chambres d’ensemencement cellulaire des micromoules en utilisant des pinces Graefe pour soulever et incliner les micromoules ou en pipettant. Pour retirer le substrat des chambres d’ensemencement cellulaire en pipettant, il faut délicatement faire flotter la pointe de la pipette au-dessus du coin de la chambre de sémiement cellulaire tout en tirant le substrat. Ne pas entrer en contact direct avec le micromoulure d’agarose pour éviter de perturber les micropuits.
       REMARQUE : Les chambres d’ensemencement cellulaire doivent être aussi sèches que possible, de sorte que les micropuits soient visibles à l’œil nu, mais l’extérieur des micromoules doit rester entouré de milieux organoïdes ovariens (Figure 5Aiii).
11. Distribuez 75 μL de la suspension cellulaire (c’est-à-dire 2,5 × 10⁵ cellules) directement dans la chambre d’ensemencement cellulaire de chaque micromoule d’agarose et évitez de créer des bulles (Figure 5Bi). Remet la plaque à 24 puits dans l’incubateur.
12. Une à deux heures après l’ensemencement cellulaire, ajoutez 250 μL supplémentaires de milieux organoïdes ovariens réchauffés autour de l’extérieur des micromoules d’agarose, en veillant à ne pas perturber les chambres d’ensemencement cellulaire (Figure 5Bii).
    REMARQUE : Les cellules somatiques ovariennes primaires devraient commencer à s’agréger dans un délai de 1 à 24 h après la semis dans des micromoules d’agarose (Figure 5Biii).
13. Remplacer le milieu entourant les micromoules d’agarose par 750 μL de milieux organoïdes ovariens frais le lendemain de l’ensemencement cellulaire, puis un jour sur deux pendant la culture.
    1. Pour changer le milieu, maintenez la plaque légèrement inclinée afin d’enlever le média usé entourant les micromoules d’agarose. Ne retirez pas le substrat des chambres de sement cellulaire. Pipettez doucement un milieu frais vers la paroi du puits pour éviter de perturber les chambres d’ensemencement cellulaire.
       REMARQUE : Les milieux conditionnés issus de changements de milieu peuvent être conservés et stockés à -80 °C pour l’analyse des facteurs organoïdes sécrétés. Une fois les organoïdes formés (1 à 3 jours après l’ensemencement cellulaire), les milieux peuvent être remplacés par des milieux contenant des protéines recombinantes, des inhibiteurs, etc., afin d’examiner les effets de divers traitements sur la fonction organoïde ou pour le criblage des composés.

Figure 5 : Schéma de la génération des organoïdes somatiques ovariens. (A) Images représentatives de (i) transfert de micromoules d’agarose vers la plaque de culture avec des pinces de Graefe, (ii) l’équilibrage de micromoules d’agarose dans des milieux organoïdes ovariens, et (iii) le retrait de milieux de semis cellulaires. La flèche dans Aiii indique la chambre de sème des cellules vide. (B) Images représentatives de (i,ii) l’ensemencement de cellules dans des micromoules d’agarose et (iii) un balayage à lumière transmise d’un micromoule d’agarose contenant des cellules somatiques ovariennes agrégées. Barre d’échelle (Biii) : 2500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Utilisation des organoïdes pour des applications en aval

REMARQUE : Les organoïdes peuvent être utilisés pour diverses applications en aval, notamment l’histologie, les applications en biologie moléculaire (par exemple, analyses ARN/protéines), l’analyse de milieux conditionnés et la coculture.

1. Histologie
   REMARQUE : Les organoïdes peuvent être traités pour les extrémités histologiques sans être retirés des micromoules d’agarose. En fait, les organoïdes contenus dans les micromoules d’agarose agissent de manière similaire aux microarrays tissulaires, permettant ainsi une évaluation histologique à haut débit de plusieurs organoïdes espacés de manière cohérente en même temps.
   1. Dissoudre 1,5 % (p/v) d’agarose stérile dans le PBS en faisant bouillir.
   2. Après la culture des organoïdes somatiques ovariens, maintenez la plaque en angle et retirez le milieu entourant les micromoules d’agarose.
   3. Sous un microscope disséquant, retirez le milieu des chambres d’ensemencement cellulaire en faisant légèrement flotter une pointe de pipette au-dessus du coin de chaque chambre de semis cellulaire et en tirant soigneusement le milieu sans déranger les organoïdes ni perturber le micromoule lui-même.
   4. On pipete soigneusement 100–125 μL d’agarose liquide à 1,5 % refroidi à environ 50 °C dans le coin de chaque chambre de sement cellulaire pour remplir et sceller les chambres d’ensemencement, en veillant à ne pas déranger les organoïdes (Figure 6Ai).
   5. Laissez l’agarose se solidifier pendant 2 à 3 minutes à température ambiante.
   6. Ajoutez 750 μL de Davidson modifié ou 4 % de paraformoldéhyde à chaque puits et fixez les organoïdes dans les micromoules d’agarose scellés pendant la nuit à 4 °C.
   7. Après fixation, retirez le fixateur et lavez les micromoules d’agarose avec 70 % d’éthanol.
      REMARQUE : Les micromoules peuvent être stockés à 70 % d’éthanol à 4 °C jusqu’au traitement des tissus (déshydratation, dégagement et infiltration de cire). Lors du traitement des tissus, suivez l’orientation des micromoules d’agarose.
   8. Après le traitement des tissus, plongez les micromoules d’agarose dans la paraffine de sorte que les micromoules soient plats à l’intérieur des blocs de paraffine et que le fond des micromoules soit le premier à être sectionné (Figure 6Aii).
   9. Bloquez la paraffine à 5 μm et placez les sections de tissu sur des lames chargées de microscope.
      REMARQUE : La présence de micropuits peut être visualisée à l’œil simple lors du coupage, tant dans les sections tissulaires que dans les blocs de paraffine (Figure 6Aiii,iv). La présence d’organoïdes dans les sections du micromoule peut être vérifiée en examinant des lames coupées au microscope (Figure 6Av). Plutôt que de placer 2 à 3 sections consécutives sur la même diapositive, placer 2 à 3 sections espacées de 50 μm (c’est-à-dire toutes les^{10 sections} ) sur une seule diapositive augmente la probabilité que la plupart des organoïdes soient représentés dans au moins une section de chaque diapositive. Les organoïdes sont systématiquement espacés au sein des sections tissulaires, ce qui facilite l’imagerie après la coloration histologique (Figure 6Avi).
   10. Laissez les lames sécher au four à 37 °C toute la nuit.
   11. Procéder à une coloration histologique ou immunohistochimique ou conserver les lames à température^{ambiante 19}.
2. Récolte d’organoïdes pour des applications moléculaires
   REMARQUE : Après la culture, les organoïdes peuvent être extraits des micromoules d’agarose et traités pour diverses applications en biologie moléculaire en aval, y compris l’extraction d’ARN ou de protéines pour évaluer l’expression des gènes ou des protéines.
   1. Tenir la plaque contenant les micromoules d’agarose légèrement inclinée et retirer le milieu entourant les micromoules d’agarose en pipettant.
   2. Ajoutez 750 μL de PBS à température ambiante aux puits contenant les micromoules d’agarose.
   3. Utilisez des pinces Graefe pour inverser et agiter les micromoules d’agarose afin de libérer les organoïdes dans le PBS environnant. Confirmez la libération des organoïdes des micromoules d’agarose au microscope.
   4. Retirez les micromoules d’agarose vides à l’aide de pinces Graefe et transférez le PBS contenant les organoïdes dans des tubes de microcentrifuge par pipetage.
   5. Pelletez les organoïdes par centrifugation à 10 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
   6. Retirez le surnageant en aspirant puis procédez à l’extraction d’ARN ou de protéine. Sinon, congelez rapidement la pellete et conservez-la à -80 °^{C 19}.
3. Sauvegarder des milieux conditionnés organoïdes pour l’analyse
   REMARQUE : Les milieux conditionnés issus des organoïdes peuvent être conservés dans la culture pour l’analyse des facteurs organoïdes sécrétés, y compris les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance. Les résultats représentatifs de l’analyse des cytokines dans des milieux conditionnés par organoïdes sont présentés à la Figure 7A.
   1. Tenez la plaque contenant les micromoules d’agarose légèrement inclinée et retirez le milieu conditionné autour des micromoules en pipetant. Ne retirez pas le milieu des chambres d’ensemencement cellulaire pour éviter de déranger les organoïdes.
   2. Transférez le milieu conditionné dans des tubes microcentrifuges et procédez à l’analyse du milieu ou à la congélation éclair et stockez à -80 °^{C 19,22}.
      REMARQUE : En option, centrifugez le milieu conditionné à 10 000 × g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules mortes ou les débris. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuges avant l’analyse ou le stockage du milieu.
4. Co-culture organoïde
   REMARQUE : Les organoïdes somatiques ovariens peuvent être co-cultivés avec d’autres cellules et tissus par plusieurs méthodes. Des résultats représentatifs issus de la co-culture d’organoïdes avec des cellules et follicules du cancer de l’ovaire, par les méthodes décrites respectivement aux étapes 5.4.1 et 5.4.3, sont présentés dans Figure 7B,C.
   1. Pour générer des organoïdes en utilisant une combinaison de cellules somatiques ovariennes primaires de souris et d’autres types cellulaires afin d’étudier les effets des interactions cellulaires directes, suivez les étapes 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Suivez les étapes 4.1 à 4.9 : laver les cellules somatiques ovariennes primaires après culture 2D toute la nuit, prélever les cellules de la culture 2D à l’aide de trypsine à 0,05 %, faire des granules, compter et resuspendre les cellules dans un milieu organoïde ovarien à une densité de 2,5 ×^{10 5} cellules vivantes pour 75 μL de milieu.
      2. Si l’autre type cellulaire d’intérêt est adhérent, prélever les cellules d’une culture 2D. Compter les cellules, les mettre en pellet par centrifugation, puis les resuspendre dans un milieu organoïde ovarien à une densité de 2,5 × 10⁵ cellules vivantes pour 75 μL de milieu.
      3. Combinez la suspension des cellules somatiques ovariennes primaires avec la suspension de l’autre type cellulaire d’intérêt à un rapport connu.
      4. Suivez les étapes 4.10 à 4.13 pour ensemencer la suspension cellulaire résultante dans des micromoules d’agarose et cultiver des organoïdes.
   2. Pour transférer des micromoules d’agarose contenant des organoïdes formés vers des plaques à 24 puits contenant d’autres cellules ou organoïdes, suivez les étapes 5.4.2.1–5.4.2.2.4.
      REMARQUE : Pour évaluer les effets des facteurs sécrétés d’origine organoïde sur d’autres types cellulaires et inversement, les organoïdes formés peuvent rester dans les micromoules d’agarose, et des micromoules entiers d’agarose peuvent être transférés sur une plaque à 24 puits contenant d’autres cellules ou organoïdes. Ces méthodes de co-culture peuvent être utilisées lorsque les milieux organoïdes ovariens peuvent être utilisés pour cultiver les deux types cellulaires et tissulaires.
      1. Chauffer le milieu organoïde ovarien à 37 °C dans un bain-marie.
      2. Tenez la plaque contenant les micromoules d’agarose en angle et retirez le milieu entourant les micromoules d’agarose en pipettant.
      3. À l’aide de pinces Graefe, transférez soigneusement les micromoules dans des plaques à 24 puits contenant d’autres cellules ou organoïdes.
      4. Ajoutez 750 μL de milieux organoïdes ovariens frais pour entourer les micromoules d’agarose.
   3. Pour retirer les organoïdes formés des micromoules d’agarose et les transférer dans de nouveaux micromoules d’agarose, suivez les étapes 5.4.3.1–5.4.3.3.13.
      REMARQUE : Si les milieux organoïdes ovariens ne sont pas les milieux souhaités pour les expériences de co-culture, le paradigme décrit à l’étape 5.4.2 pose le défi d’un transfert significatif de milieux de mieux, étant donné que les micromoules d’agarose sont saturés en milieux organoïdes ovariens. Les organoïdes formés (1 à 3 jours après l’ensemencement initial des cellules) peuvent être déplacés de leurs micromoules d’agarose et transférés dans de nouveaux micromoules d’agarose pour une culture ou une co-culture supplémentaire afin d’éviter le transfert de mieux.
      1. Chauffez le milieu désiré pour la co-culture à 37 °C dans un bain-marie.
         REMARQUE : Les milieux à base de DMEM, αMEM et F12 ont été utilisés avec succès pour des expériences de co-culture avec des organoïdes somatiques ovariens.
      2. À l’aide de pinces Graefe, transférez soigneusement les nouveaux micromoules d’agarose issus de PBS +1 % PS dans les puits d’une plaque à 24 puits contenant d’autres cellules ou organoïdes pour la co-culture.
      3. Assurez-vous que les micromoules sont entièrement immergés dans le substrat, ajoutez un substrat supplémentaire souhaité pour la co-culture si nécessaire, et équilibrez les micromoules et le milieu pendant au moins 30 minutes dans un incubateur (environnement humidifié, 37 °C avec 5 % de_CO2).
      4. Tenir la plaque contenant les micromoules d’agarose avec organoïdes formés légèrement inclinée et retirer les milieux entourant les micromoules d’agarose en pipettant.
      5. Ajoutez le milieu souhaité pour la co-culture autour des micromoules d’agarose avec les organoïdes formés.
      6. Utilisez des pinces Graefe pour inverser et agiter les micromoules d’agarose afin de libérer les organoïdes dans le milieu environnant. Confirmez la libération des organoïdes des micromoules d’agarose au microscope.
         REMARQUE : Si les cellules somatiques ovariennes primaires ne se sont pas suffisamment agrégées, les organoïdes peuvent ne pas rester intacts lorsqu’ils sont retirés des micromoules d’agarose. L’assemblage des organoïdes peut prendre de 1 à 3 jours, selon la souche et l’âge des souris dont les cellules somatiques ovariennes ont été isolées.
      7. Retirez les micromoules vides d’agarose à l’aide de pinces Graefe et transférez le milieu contenant les organoïdes dans des tubes de microcentrifuge par pipette.
      8. Centrifugez les organoïdes à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
      9. Au microscope disséqueur, retirez le surnageant par pipetage, laissant 50 à 75 μL de milieu contenant les organoïdes.
      10. Retirez les micromoules équilibrés de l’incubateur et assurez-vous que les micromoules sont orientés de manière à ce que la chambre de semis des cellules soit orientée vers le haut.
      11. Retirez le milieu des chambres de sement cellulaire à l’aide de pinces Graefe ou en pipettent.
          REMARQUE : Les puits ne doivent pas contenir plus de 500 μL de milieu afin que les chambres d’ensemencement des micromoules puissent être vidées.
      12. Transférez les organoïdes directement dans la chambre d’ensemencement cellulaire de chaque nouveau micromoule d’agarose en pipettant. Remet la plaque à 24 puits dans l’incubateur.
      13. Après 1 à 2 heures, ajoutez 250 μL supplémentaires du milieu souhaité autour de l’extérieur des micromoules d’agarose, en veillant à ne pas perturber les chambres de semis cellulaires.

Figure 6 : Les principaux types cellulaires ovariens sont préservés dans les organoïdes somatiques ovariens. (A) Images représentatives de (i) scellement d’un micromoule avec de l’agarose à la fin de la culture, (ii) un micromoule non coupé, et (iii) un micromoule sectionné intégré dans un bloc de paraffine. Les micropuits peuvent être visualisés en sections montées (iv), et la présence d’organoïdes dans des micromoules sectionnés peut (v) être confirmée au microscope avant (vi) la coloration histologique. (B) Images représentatives de sections de tissu ovarien de souris et de sections organoïdes somatiques ovariennes après coloration immunohistochimique utilisant des anticorps contre Vimentin, F4/80, Foxl2 et 3β-HSD. Barres d’écaille = 20 μm. Abréviations : H&E = hématoxyline et éosine. Cette figure a été adaptée avec la permission de Dipali et ^al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Co-culture d’organoïdes somatiques ovariens avec follicules et cellules cancéreuses de l’ovaire. (A) La sécrétion de cytokines organoïdes a été mesurée par micromoulure d’agarose au jour 5 de culture et a été normalisée en milieux conditionnés à partir de micromoules à agarose sans organoïdes. N = 4 micromoules d’agarose. (B) Images lumineuses représentatives transmises des follicules ovariens aux jours 0, 4 et 8 de culture avec ou sans organoïdes (témoins) et (i) un schéma du paradigme de co-culture. Barres d’échelle = 400 μm. Quantification de (ii) la survie folliculaire et (iii) la croissance sur 8 jours de culture avec ou sans organoïdes (témoins). Les données sont indiquées en moyenne ± SD. Certaines barres d’erreur sont trop petites pour être visualisées. N = 56 follicules par groupe. **P < 0,01. (C) Images représentatives de lumière transmise (en haut) et fluorescentes (en bas) des cellules somatiques ovariennes primaires cultivées dans un ratio 10:1 avec des cellules cancéreuses de l’ovaire marquées par une protéine fluorescente rouge (OVCAR8-RFP) dans des organoïdes aux jours 1, 3 et 5 de culture. Barres d’échelle = 400 μm. Abréviation : RFP = protéine fluorescente rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Conseils de dépannage

1. Problème 1 : Le nombre de cellules somatiques ovariennes primaires isolées est inférieur à ce que prévu.
   REMARQUE : Si les fragments de tissu ovarien sont systématiquement inférieurs à 1 mm ou invisibles à l’œil après une digestion enzymatique, le nombre cellulaire isolé peut être faible en raison d’une viabilité réduite due à une surdigestion. Si les fragments de tissu ovarien dépassent 1 mm après une digestion enzymatique, le nombre cellulaire isolé peut être faible en raison d’une digestion insuffisante du tissu ovarien.
   1. Si les fragments de tissu ovarien dépassent 1 mm après la digestion enzymatique, suivez les étapes 6.1.1.1–6.1.1.1.2.
      1. Confirmez que la collagénase IV et la DNase I sont dans leur durée de conservation recommandée et n’ont pas perdu d’activité enzymatique due à un stockage inadéquat ou, dans le cas de la DNase I, à des cycles répétés de congélation-décongélation.
      2. Augmenter la quantité de pipétage répété du tissu ovarien, diminuer la taille du forage de la pointe p1000 si elle a été coupée pour élargir l’ouverture, et/ou augmenter le temps d’incubation en EM.
   2. Si les fragments de tissu ovarien sont systématiquement beaucoup plus petits que 1 mm après digestion enzymatique, réduisez la quantité de pipetage répété du tissu ovarien, augmentez la taille du trou de la pointe p1000 en coupant pour élargir l’ouverture, et/ou diminuez l’incubation totale en EM.
2. Problème 2 : Plus de ~25 % des micromoules en agarose coulés présentent des défauts
   1. Confirmez que le moulage en silicone est exempt de toute agarose résiduelle ni débris. Si besoin, lavez les moulages en silicone dans du PBS et ré-stérilisez par autoclavage. Si nécessaire, réchauffez l’agarose à 1 % utilisé pour la coulée, car l’agarose en solidification peut ne pas remplir uniformément le moulage en silicone et/ou provoquer des bulles.
   2. Une fois pipetée dans la moule en silicone, laissez l’agarose se solidifier complètement, car un retrait prématuré du micromoule d’agarose de la moulage peut entraîner des micropuits perturbés.
   3. Vérifiez que les moulages en silicone ne sont pas sous-remplis, car cela peut réduire l’intégrité structurelle du micro-moule d’agarose, ce qui peut endommager lorsque le silicone est fléchi pour retirer le micromoule d’agarose.
   4. De plus, le fabricant des moulages en silicone recommande qu’ils soient autoclavés au maximum 12 fois. Si le moulage en silicone a subi une stérilisation excessive, remplacez-le.
3. Problème 3 : Les organoïdes ne se forment pas dans plus de 10 % des micropuits
   1. Vérifiez que les moulages en silicone ne sont pas trop remplis lors de la fonte des micromoules d’agarose, car cela peut entraîner une distribution irrégulière des cellules dans les micropuits, favorisant les micropuits centraux du micromoule d’agarose plutôt que les micropuits extérieurs.
   2. Évitez de créer des bulles lors de la distribution de la suspension cellulaire dans la chambre d’ensemencement des micromoules d’agarose, car les bulles peuvent perturber la distribution des cellules dans les micropuits.
   3. Si nécessaire, commencez par une suspension de cellules supérieure à 75 μL (à une densité de 3,33 × 10⁶ cellules vivantes par 1 mL) par micromoule afin de s’assurer que des bulles ne se créent pas en raison d’un volume insuffisant dans la pointe de la pipette.
   4. Augmenter l’intervalle entre l’ensemencement cellulaire et l’ajout de milieux organoïdes ovariens à l’extérieur du micromoule d’agarose afin d’assurer suffisamment de temps pour que les cellules se déposent dans les micropuits.

Résultats

Pour déterminer la composition cellulaire des organoïdes somatiques ovariens, nous avons réalisé une immunohistochimie des sections de tissu organoïde après 6 jours de culture en utilisant des anticorps contre les principaux types de cellules ovariennes. Les organoïdes contenaient des fibroblastes vimentin-positifs, des macrophages F4/80-positifs, ainsi que des populations cellulaires stéroïdogènes (Figure 6B)¹⁹. Nous avons utilisé un...

Discussion

Cet article décrit des méthodes pour isoler les cellules somatiques ovariennes primaires de la souris à partir d’une fraction enrichie en stroma de l’ovaire, de manière à maintenir l’hétérogénéité du compartiment somatique ovarien. Les cellules somatiques ovariennes primaires de souris peuvent être cultivées en monocouche 2D ou utilisées pour générer des organoïdes somatiques ovariens à l’aide de micromoules d’agarose sans échafaudage. Les micromoules d’agarose contiennent 96 micropuits ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102