Un protocole de montage sur bande pour l’imagerie Z-stack haute résolution des yeux composés de Drosophila

Summary

L’objectif principal de ce protocole est de permettre l’imagerie non destructive et l’analyse quantitative des yeux composés de Drosophila. Il combine une stratégie de montage sur bande avec l’acquisition stéréomicroscopique de la pile Z et la reconstruction à profondeur de mise au point étendue pour produire des images haute résolution et sans artefacts.

Abstract

Nous présentons ici un protocole de montage et d’imagerie non destructifs pour une analyse phénotypique à haute résolution de l’œil composé de Drosophila. Le phénotypage précis de l’œil composé de Drosophila est souvent limité par sa géométrie convexe et sa fragilité mécanique lors de la manipulation. Pour y remédier, nous détaillons un flux de travail d’imagerie polyvalent et non invasif qui permet une visualisation haute résolution sous plusieurs angles. Le protocole utilise une stratégie de montage adhésif personnalisée sur une plateforme à ruban inversé, fixant les mouches par le corps et les ailes tout en laissant la tête complètement intacte. De manière cruciale, cette configuration flexible permet des orientations de montage distinctes : une position latérale pour capter la convexité complète des yeux individuels, et une position frontale pour évaluer la symétrie de la tête entière. Cette méthode facilite également l’agencement de réseaux à haute densité, permettant le traitement rapide de 20 à 30 échantillons par session. En intégrant la stéréomicroscopie à lumière réfléchie avec l’acquisition par pile Z et la reconstruction en profondeur étendue (EDF), le flux de travail génère des images composites quasi-3D uniformément nettes. Cette approche préserve la pigmentation naturelle et produit des images haute fidélité et riches en contraste, adaptées à l’analyse phénotypique quantitative à l’échelle des organes.

Introduction

L’œil composé de Drosophila melanogaster est un modèle classique et puissant pour étudier la croissance, la structuration et la robustesse des organes pendant le développement. Composé d’environ 800 ommatidies hautement ordonnés, l’œil de mouche fournit une lecture sensible et quantifiable des perturbations génétiques affectant la prolifération, la différenciation et l’organisation^{tissulaire 1,2,3}. La manipulation génétique du développement oculaire a historiquement permis d’obtenir des connaissances fondamentales sur la conservation des voies de signalisation. Des études majeures ont démontré que l’expression ectopique du facteur de transcription sans œil est suffisante pour induire la formation de l’œil dans des tissus non rétiniens, établissant l’œil comme un paradigme de spécification et de plasticité^{des organes 4}. Des travaux ultérieurs ont identifié la voie de signalisation D. melanogaster Hippo comme régulateur central de la taille et du nombre cellulaire de l’œil grâce au contrôle coordonné de la prolifération et de l’apoptose ^5,6. Parallèlement, la signalisation Hedgehog et BMP a montré réguler la progression morphogénétique, la précision de la croissance et le schéma spatial au sein de la rétine en^{développement 7,8}.

Cependant, la capture d’images haute fidélité de l’œil composé adulte présente des défis optiques importants en raison de sa géométrie convexe et hémisphérique. La microscopie en champ clair standard est limitée par une faible profondeur de champ, rendant impossible la mise au point simultanée sur le point dorsal (pôle) et les bords marginaux (équateur) de l’œil lors d’une seule^{exposition 9}. Cette limitation entraîne souvent des images où des portions significatives de la surface rétinienne sont floues, ce qui entrave l’application d’analyses d’images haute résolution et d’outils d’apprentissage automatique conçus pour quantifier les phénotypes panacés. Pour caractériser pleinement la surface rétinienne, toute la courbure doit être visualisée sans artefacts optiques. Par conséquent, une méthode d’imagerie qui préserve la morphologie oculaire native tout en permettant une visualisation haute résolution de l’ensemble de la surface courbe de la rétine est nécessaire.

De plus, les méthodes traditionnelles de préparation des échantillons en microscopie compromettent souvent l’intégrité structurelle de la tête de mouche. Les techniques de montage conventionnelles reposent souvent sur des adhésifs capables de masquer les détails de surface ou impliquent une manipulation physique à la pince à épiler, exerçant une pression sur la capsule céphalique. Comme l’ont noté les études sur la morphogenèse rétinienne, l’intégrité structurelle de l’œil est primordiale. La pression directe ou la ponction provoque une fuite d’hémolymphe, entraînant une perte de pression interne et l’effondrement ou la « bosse » de la surface oculaire. Ces artefacts mécaniques peuvent imiter des phénotypes neurodégénératifs ou des défauts génétiques, conduisant à des résultats faux positifs lors de criblages à grande échelle. L’objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail de montage et d’imagerie non destructif pour la visualisation haute résolution des yeux composés intacts de Drosophila.

Ici, nous présentons un flux de travail d’imagerie rapide et reproductible qui permet une visualisation haute résolution des yeux composés intacts de Drosophila et de la morphologie de la tête entière sans contact direct avec la tête. Dans cette méthode, les mouches adultes sont immobilisées à l’aide d’une stratégie de fixation adhésive flexible qui fixe le corps et les ailes, permettant un positionnement stable soit dans une orientation latérale — pour capturer la courbure complète d’un seul œil — soit sur une orientation frontale — afin d’évaluer la symétrie totale de la tête et les caractéristiques interoculaires. Cette stratégie de montage polyvalente minimise les dommages mécaniques et préserve la géométrie oculaire native en trois dimensions. Combinée à la stéréoscopie à lumière réfléchie, à l’acquisition par pile Z et à la reconstruction étendue en profondeur^{de champ 9}, cette approche génère des images uniformement nettes et de haute qualité sous plusieurs perspectives, adaptées à la fois à l’inspection qualitative et à l’analyse phénotypique quantitative. Cette méthode est particulièrement adaptée pour l’étude des perturbations génétiques, des phénotypes développementaux et du criblage à haut débit de la morphologie oculaire chez Drosophila.

Protocol

1. Collecte d’échantillons et synchronisation

REMARQUE : Pour garantir la comparabilité expérimentale, un contrôle strict du moment de l’éclosion est nécessaire. Dans des conditions de culture standard à 25 °C, l’éclosion se produit généralement 10 à 12 jours après la ponte. Les nymphes doivent être étroitement surveillées pendant cette période, car l’assombrissement de la coque nymphale indique une éclosion imminente.

1. Méthode de tapping direct (méthode standard)
   1. Tapotez doucement le flacon standard de culture Drosophila en plastique de 24 x 95 mm (scellé avec un bouchon en mousse) contre un tapis souple pour déloger les mouches adultes vers le fond.
   2. Retirez rapidement le bouchon et alignez la bouche d’un flacon de collecte fraîche avec celle de la culture en culture.
   3. Inversez la configuration pour que le flacon de culture soit au-dessus. Tapotez doucement les parois pour transférer les mouches dans la fiole de collecte.
      REMARQUE : Cette méthode n’est pas recommandée si le milieu alimentaire standard de semoule de maïs-agar est humide, car les mouches fraîchement écloses sont facilement piégées et tuées. Pour minimiser la mortalité, il faut d’abord recueillir les mouches dans un flacon vide de 24 x 95 mm. Après anesthésie (Étape 3), transférez les mouches sur la paroi interne d’un flacon de 24 x 95 mm contenant un milieu alimentaire frais.
2. Méthode de transfert de géotaxie négative (méthode anti-adhérence)
   1. Retirez le bouchon d’un flacon de collecte frais et inversez-le sur le dessus du plan de travail pour empêcher les mouches errantes d’entrer.
   2. Tiens la fiole de culture avec l’ouverture tournée vers le bas. Les mouches grimperont vers le côté de la nourriture, s’éloignant de l’ouverture.
   3. Une fois l’ouverture dégagée des mouches, débouchez rapidement le flacon de culture et alignez-le avec le flacon de collecte vide inversé de 24 x 95 mm sur le banc.
   4. Tapotez doucement le point de connexion contre le dessus de travail pour déposer les mouches dans le flacon de collecte.
      REMARQUE : Cette méthode réduit significativement la mortalité causée par l’adhésion alimentaire mais prend plus de temps que la collecte directe.
3. Méthode d’anesthésie CO₂ (méthode à haute efficacité)
   1. Inversez le flacon de culture pour que le bouchon soit orienté vers le bas.
   2. Insérez soigneusement l’aiguille du pistolet à anesthésie CO₂ entre la prise et la paroi du flacon.
   3. Engagez doucement la pédale et la valve à main pour libérer 100 % de CO₂ à un débit faible et doux.
   4. Une fois que les mouches sont anesthésiées et sont tombées sur le bouchon, placez le flacon de culture à l’horizontale. Retirez le bouchon, alignez-le avec un flacon de collecte vide, puis tapotez doucement le flacon de culture pour transférer les mouches anesthésiées dans le flacon de collecte.
      REMARQUE : Un flux d’air excessif peut souffler les mouches sur la surface alimentaire, provoquant adhérence et mort ; maintenir strictement un flux doux de_CO2 suffisant pour anesthésier les mouches sans les déplacer physiquement. Le varan vole de près pour détecter les premiers signes de récupération, comme de légers spasmes ou des mouvements des ailes et des pattes.
4. Étiquetage et entretien
   1. Étiquetez le flacon de la collecte avec le sexe, la date de prélèvement, la date d’éclosion, le génotype et les conditions de la culture.
   2. Séparation entre sexes : Si les mouches d’imagerie ont plus de 10 jours, séparez les mâles et les femelles dans différents flacons contenant de la nourriture pour éviter l’accouplement et l’émergence d’une génération F2, ce qui pourrait perturber l’environnement expérimental.
      REMARQUE : Les mouches peuvent être maintenues dans ces fioles contenant de la nourriture dans des conditions de culture antérieures (par exemple, 25 °C) jusqu’à atteindre l’âge souhaité pour l’imagerie.

2. Préparation de la plaque de montage

1. Obtenez une lame de microscope en verre standard et propre.
2. Coupez une bande de ruban adhésif blanc d’environ 2 cm plus longue que la culasse.
3. Placez le ruban sur la culasse avec le côté adhésif orienté vers le haut (côté non adhésif contre le verre). Assurez-vous que le ruban dépasse la culasse d’environ 1 cm aux deux extrémités.
4. Fixez les extrémités en surplomb en enroulant fermement deux bandes supplémentaires de ruban adhésif de ~5 mm autour de l’arrière de la glissière.
5. Assurez-vous que la surface adhésive est plate, tendue et sans plis.
6. Étiquetage : marquez les indicateurs d’orientation (par exemple, « Haut/Haut » et « Bas/Bas ») ou des identifiants d’échantillon sur les extrémités non adhésives du ruban pour faciliter l’orientation et le suivi de l’échantillon au microscope.
   REMARQUE : Lors du choix de mouches pour l’imagerie, évitez de choisir des individus présentant des disparités significatives de taille corporelle. Même avec un agrandissement identique, des variations de taille corporelle peuvent entraîner des surfaces oculaires composées non comparables.

3. Euthanasie et montée

1. Euthanasie
   1. Transférez les mouches dans un flacon de collecte scellé et vide.
   2. Placez le flacon scellé dans un congélateur à -80 °C pendant 15 à 20 minutes.
      ATTENTION : Ne crevez jamais ni ne serrez la braguette avec les pointes acérées d’une pince à épiler. Même une fuite hémolymphatique mineure provoque une perte rapide de pression hydrostatique interne, entraînant une bosse immédiate et un effondrement irréversible de l’œil composé, ce qui détruit la qualité de l’imagerie.
2. Montage pour vue latérale (œil à œil à poulies simple)
   1. Positionnement : Sous un stéréomicroscope standard (par exemple, Nikon SMZ745), utilisez une pince à pinces fines pour orienter la mouche euthanasiée en position latérale (couchée sur le côté).
   2. Transfert : À l’aide d’une pince à pointes fines, saisir doucement la braguette par l’aile (en maintenant la posture latérale) et transférer sur la plaque de fixation adhésive préparée.
   3. Fixation : Collez un côté du corps de la mouche sur le ruban adhésif. Écartez les ailes et collez-les à plat contre le ruban pour augmenter la stabilité.
   4. Gestion des appendices : Lors du montage, assurez-vous que les jambes n’obstruent pas l’œil composé. Si les pattes avant bloquent le champ de vision, utilisez une pince à épiler pour les éloigner soigneusement de l’œil et les coller fermement au ruban (par exemple, en les tendant vers le bas ou en les rapprochant sous le thorax).
   5. Fixation : Inclinez la pince et utilisez le côté de la pointe (pas la pointe tranchante) pour presser doucement le corps contre le ruban afin d’assurer une liaison solide.
   6. Réglage fin : Vérifiez si la tête est horizontale. Si l’œil n’est pas sur un seul plan focal, utilisez une pince à épiler pour micro-ajuster l’angle du corps.
3. Montage pour vue frontale (tête entière)
   1. Positionnement : Sur la plaque d’anesthésie, orientez la mouche en position ventralement vers le bas (couchée).
   2. Transfert : Utilisez une pince à épiler pour saisir une aile et soulever la brague. Transférez-le sur la plaque de fixation adhésive.
   3. Fixation initiale : Écartez doucement les deux ailes vers l’extérieur (gauche et droite) et pressez-les fermement sur la surface adhésive pour ancrer la mouche.
   4. Stabilisation du corps : Appuyez doucement sur le thorax pour assurer un contact complet avec la plaque adhésive. Utilisez une pince à épiler pour saisir légèrement l’arrière-ventre (queue) et tirez doucement pour redresser l’axe du corps avant d’adhérer l’abdomen au ruban.
   5. Orientation de la tête : Ajustez l’angle de la tête à l’aide d’une pince fine pour garantir que le plan frontal (face) soit parallèle à la surface adhésive. Les deux yeux composés doivent être à plat et visibles dans le même plan focal.
4. Arrangement
   1. Montez plusieurs mouches en rangées parallèles ou en grille sur la surface adhésive. Veillez à ce que les mouches individuelles ne se chevauchent pas pour éviter toute interférence de la pile Z, bien que le compactage rapproché soit autorisé pour maximiser le débit (par exemple, 20 à 30 mouches par diapositive). Alignez toutes les mouches avec la tête tournée dans la même direction (comme indiqué par les étiquettes à l’étape 2.6) pour faciliter l’imagerie systématique.
   2. Préparez des réseaux d’échantillons séparés pour l’imagerie latérale et frontale en utilisant différents groupes de mouches euthanasiées issues d’une même cohorte. Une fois qu’une mouche est collée au ruban, elle ne peut pas être retirée ou repositionnée en toute sécurité sans causer de graves dommages mécaniques à l’échantillon ; par conséquent, il ne peut pas être imaginé plusieurs vues séquentiellement à partir d’un même individu.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé d’imager les échantillons immédiatement après l’euthanasie et le montage afin d’éviter la dessiccation des tissus.

4. Acquisition d’images

1. Démarrage et initialisation du système d’imagerie motorisée de stéréomicroscope
   1. Allumez le PC, le moniteur et l’unité microscope en séquence.
   2. Lancez le logiciel LAS X.
   3. Lorsque l’invite « Initialiser/Auto-test » apparaît, assurez-vous que l’espace sous l’objectif est dégagé d’obstacles et cliquez sur Confirmer. Laissez le microscope effectuer l’étalonnage complet de l’axe Z.
      REMARQUE : Les étapes suivantes sont optimisées pour un stéréomicroscope avec le système logiciel LAS X.
2. Placement des échantillons et éclairage
   1. Transférez la plaque de montage préparée sur la plateforme de base du stéréomicroscope motorisé, en la positionnant manuellement pour centrer le premier échantillon dans l’ensemble sous l’objectif de l’appareil photo numérique.
   2. Allumez les sources de lumière transmise (base) et lumière incidente (en haut). Pour l’imagerie oculaire composée, utilisez principalement la lumière réfléchie. Ajustez l’ouverture pour assurer un éclairage uniforme.
3. Configuration logicielle
   1. Réglez le mode acquisition sur Z-stack. Dans les paramètres du projet, réglez la priorité de mouvement multidimensionnel sur « Z-first » afin d’assurer un fonctionnement continu et stable de l’entraînement moteur.
   2. Réglez le mode d’imagerie sur Lumière réfléchie.
   3. Activez la profondeur de mise au point étendue (EDF) pour permettre la synthèse d’une image entièrement focalisée.
   4. Dans les paramètres avancés de l’image, activez la plage dynamique élevée (HDR). Cela est fortement recommandé pour atténuer les reflets spéculaires et la surexposition souvent causés par la surface chitineuse très réfléchissante de l’œil composé.
4. Positionnement et balance des blancs
   1. Ajustez le bouton de grossissement au niveau approprié (par exemple, un facteur de zoom de 16x pour la vue latérale à un œil, et 12,5x pour la vue frontale de toute la tête), en veillant à ce que la région d’intérêt occupe entre 1/2 et 2/3 du champ de vision.
   2. Positionnez manuellement la plaque de fixation pour amener le thorax de la mouche au centre du champ de vision.
   3. Effectuez une calibration de la balance des blancs à l’aide du thorax pour corriger la température de couleur.
5. Paramètres d’exposition et d’imagerie (valeurs de référence)
   Exposition : 60–80 ms.
   Gain : 0–5 (Maintenez-vous bas pour minimiser le bruit).
   Intensité : 60 % à 80 %.
   Taille de l’étape de la pile Z : Standard : 8–12 μm.
   REMARQUE : Pour les yeux composés lisses et sains (par exemple, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), des tailles de pas allant jusqu’à 15 μm peuvent suffire, car la courbure continue et régulière nécessite moins de sections optiques. Cependant, pour des phénotypes oculaires rugueux ou irréguliers caractérisés par des changements topologiques abrupts, des pas plus petits (aussi bas que 5 μm) sont nécessaires pour capturer des détails structurels fins et améliorer significativement la précision de la reconstruction de l’EDF.
6. Définition et capture de la pile Z
   1. Pour la vue latérale : Définissez la plage de la pile Z du bord orbital (Start) à l’ommatidia centrale (End) en utilisant une taille de pas de 8 à 12 μm.
   2. Pour la vue frontale : ajustez le bouton de mise au point jusqu’à ce que le contour extérieur des yeux composés soit juste en mise au point (Start). Ajustez la mise au point dans la direction opposée jusqu’à ce que les ocelles centraux (yeux simples jaunes) sur le dessus de la tête soient juste en focus (fin). Cliquez sur Mettre fin.
   3. Cliquez sur Arrêter la diffusion pour figer l’aperçu.
   4. Cliquez sur Démarrer l’acquisition. Le système capture automatiquement les plans focaux définis et synthétise une image haute résolution et entièrement focalisée.
7. Sauvegarde des fichiers :
   1. Une fois la reconstruction EDF terminée, cliquez sur l’icône Enregistrer dans l’interface logicielle (ou allez jusqu’à Fichier > Enregistrer sous Fichier).
   2. Sélectionnez le répertoire de destination, saisissez le nom du fichier désigné, puis cliquez sur Enregistrer.
   3. Notez que chaque acquisition génère trois fichiers image distincts : a. Image brute/canal (niveaux de gris) ;b. Image d’aperçu couleur ; c. Image composite EDF (avec le suffixe « _Composite »)
      REMARQUE : L’image brute/canal ainsi que l’image composite EDF doivent être conservées pour analyse et documentation

Results

L’ensemble du pipeline expérimental, de la collecte des échantillons à l’acquisition d’images, est résumé à la Figure 1. L’efficacité du protocole modifié est démontrée par la création de réseaux d’échantillons à haute densité. Comme montré à la Figure 2A, 20 à 30 mouches anesthésiées peuvent être disposées en un motif en grille sur une seule plateforme à ruban inversé. Les marqueurs d’orientation écrits sur les extrémités non a...

Discussion

L’œil composé de Drosophila sert de puissant indicateur phénotypique pour le dépistage génétique, où des changements observables de taille, de rugosité ou de pigmentation ^2,3,8 indiquent souvent des perturbations dans les voies fondamentales de signalisation telles que Hippo ^5,6 ou ^{Hedgehog 7}. Cependant, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouteille de gaz de dioxyde de carbone (CO2)	Fournisseur local	N/A
Sairebaane anesthésie CO2	T& L	DG-08
Appareil photo de microscope numérique	Leica	DMC6200
Pince à pinces fines	VETUS	MOS-167B
Bouchons en mousse	Dongpeng	N/A
Logiciel d’acquisition d’images (LAS X)	Leica	3.7.1
Logiciel de traitement d’image (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
Éclairage LED pour dôme	Leica	LED5000 IDH
Éclairage LED à cou de poule	Cossim	LG-10
Stéréomicroscope motorisé	Leica	M205 FCA
Objectif	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Soupape de pédale pneumatique	DELIXI	FV-320
Fioles standard de culture de Drosophila	LAIBOER	2424951
Médium alimentaire standard pour Drosophila	N/A	Semoule de maïs-agar-mélasse
Lames standard de microscope en verre	Citotest	10127101P-G
Stéréomicroscope standard	Nikon	SMZ745
Ruban de masquage en papier blanc	UBWIN	25 mm de largeur