Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

Summary

Cette étude présente un protocole multiome spatial Trekker–CUT&Tag combinant le codage à barres spatial direct d’une section tissulaire avec l’analyse multiome unicellulaire. Cette approche permet simultanément un profilage spatial de l’expression génique par une seule cellule et la modification de l’histone H3K27ac, offrant des perspectives mécanistes sur la régulation génique dans le contexte de la microanatomie tissulaire.

Abstract

Les technologies multiomiques spatiales combinées au profilage unicellulaire offrent des opportunités sans précédent pour élucider l’architecture moléculaire et cellulaire de tissus complexes. La combinaison du codage à barres spatiale des noyaux au sein de cryosections individuelles préparées à partir de blocs tissulaires intégrés dans un milieu de congélation à température de coupe optimale (OCT) avec des tests multiomiques monocellulaires dans un flux de travail simple et efficace peut faciliter l’annotation et l’analyse moléculaire spatialement résolue des cellules dans des types de tissus. Cette étude rapporte une approche multiome de clivage spatial sous cibles & tagmentation (CUT&Tag) qui profile simultanément la modification de l’histone H3K27ac et l’expression génique dans une seule section cérébrale gelée. Après le codage spatial, des noyaux uniques sont isolés et soumis à CUT&Tag, capture combinée d’ADN, ARN et codes-barres spatiaux étiquetés, préparation de bibliothèque et séquençage. Le flux de travail génère des profils épigénomiques et transcriptomiques annotés spatialement à partir des mêmes noyaux, permettant d’attribuer l’information multiomiques à des coordonnées anatomiques. L’intégration des informations épigénomiques avec les données transcriptomiques spatiales augmente la fidélité de l’identification des types cellulaires et révèle des programmes régulateurs spatialement organisés ainsi que des interactions cellule-cellule au sein des tissus intacts.

Introduction

La biologie spatiale est un domaine en rapide évolution qui cartographie la localisation, l’organisation et les interactions des molécules, cellules et tissus dans leur environnement naturel ^1,2,3. Contrairement aux méthodes monocellulaires ou en masse qui nécessitent la dissociation tissulaire et entraînent une perte d’information positionnelle, les approches spatiales préservent les coordonnées physiques des analytes ou des cellules/noyaux, permettant une étude directe de la manière dont l’architecture tissulaire influence l’identité cellulaire, la communication intercellulaire et la fonction^biologique 4,5,6,7 . Bien que la transcriptomique spatiale et la protéomique spatiale soient actuellement les modalités les plus adoptées, le domaine s’étend rapidement vers le profilage multi-omique^{spatial 3,8,9}. Le co-profilage de l’expression génique et des états épigénomiques au sein d’un même tissu est particulièrement puissant, car il relie directement la production transcriptionnelle aux mécanismes régulateurs — tels que l’accessibilité à la chromatine et les modifications histoniques — qui régissent l’activité génique et qui varient selon les domaines^spatiaux 10,11,12 . Ainsi, une analyse intégrée de l’épigénome spatial et du transcriptome fournira des informations cruciales sur la manière dont les programmes régulateurs façonnent l’identité cellulaire et l’organisation tissulaire.

Plusieurs stratégies multiomiques spatiales ont été développées pour permettre un profilage épigénomique et transcriptomique simultané. Le codage à barres déterministe dans le séquençage tissulaire (DBiT-seq) utilise des canaux microfluidiques pour livrer des codes-barres spatiaux directement ou indirectement, via un estampage avec des plaques de gel, aux sections tissulaires, permettant l’annotation spatiale des analytes. Cette approche facilite le co-profilage spatialement résolu des caractéristiques épigénomiques et^{transcriptomiques} 12,13,14,15. La méthode Slide-tag, commercialisée sous le nom de plateforme Takara Trekker, introduit directement des codes-barres spatiaux dans le tissu intact avant la dissociation, permettant ainsi de traiter les noyaux indexés spatialement selon des flux de travail standard monocellulaires et de les projeter computationnellement vers leurs coordonnées tissulaires^{d’origine 16}. En revanche, le test spatial pour la chromatine accessible, les lignées cellulaires et l’expression génique par séquençage (SPACE-seq) utilise une stratégie de cible hors dans laquelle des cibles épigénétiques poly(A)-queues et des ARNm sont capturés sur une séquence capturant poly-dT dans les tuiles transcriptomiques^{spatiales 17}.

Le clivage sous cibles & la marquage (CUT&Tag) est un outil puissant pour cartographier les interactions entre l’ADN et les protéines histones ou non histones à partir d’échantillons d’entrée extrêmement^{faibles 18}. CUT&Tag repose sur la fragmentation de la chromatine médiée par la transposase Tn5 et le marquage ADN (marquage), utilisant du Tn5 conjugué à la protéine A guidé par anticorps pour le clivage spécifique au locus et le marquage moléculaire. Alors que le test CUT&Tag conventionnel implique plusieurs étapes d’incubation et de lavage, un flux de travail simplifié et rationalisé CUT&Tag a été utilisé pour améliorer l’efficacité de CUT&Tag dans les applications multiomes monocellulaires en aval¹⁹.

Figure 1 : Aperçu du flux de travail et du contrôle qualité de l’essai spatial Trekker–CUT&Tag multiome. (A) Schéma du flux de travail spatial multiome Trekker–CUT&Tag. Une coupe coronale de tissu cérébral de souris fraîchement congelée est montée sur une tuile spatiale Trekker et soumise à un codage spatial. Après la lyse tissulaire, les noyaux sont isolés et évalués pour leur rendement et leur qualité. Environ 50 000 noyaux sont utilisés pour H3K27ac CUT&Tag, et les noyaux marqués sont soumis au codage à barres monocellulaire en utilisant 10x billes de gel Genomics Chromium Multiome après comptage. L’ADN unicellulaire codé par code-barres est préamplifié et divisé en deux fractions. La bibliothèque indexée CUT&Tag est générée directement par PCR indexée. Pour l’expression génique et les bibliothèques de codes-barres spatiales, l’ADN pré-amplifié est encore amplifié et sélectionné par taille. Des fragments correspondant à des tailles typiques d’ADNc sont utilisés pour la préparation de la bibliothèque d’expression génique, tandis que des fragments d’ADN plus courts sont utilisés pour générer la bibliothèque de codes-barres spatiale. Les bibliothèques sont séquencées et cartographiées selon les directives 10x de Genomics et Curio Trekker. La chronologie expérimentale attendue est indiquée à gauche. (B) Points clés de contrôle qualité (QC) et considérations critiques tout au long du flux de travail. La QC des noyaux inclut l’évaluation du rendement, de l’intégrité, de l’agrégation et de la teneur en débris. Le pré-séquençage de la QC inclut l’évaluation des distributions de taille de l’ADN et la contamination par les dimères d’amorce pour toutes les bibliothèques. La spécificité de la bibliothèque CUT&Tag est évaluée par PCR quantitative (qPCR), mesurant l’enrichissement des régions génomiques cibles sur le fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Cette étude présente un test multiome spatial Trekker CUT&Tag qui présente simultanément la modification de l’histone H3K27ac associée à des éléments cis-régulateurs actifs et à l’expression génique dans des sections de tissu fraîchement gelées. Ce protocole fournit des procédures étape par étape pour le codage spatial Takara Trekker, la dissociation tissulaire et l’isolement des noyaux, le comptage et le contrôle qualité des noyaux, le profilage CUT&Tag à faible entrée de la modification H3K27ac, la capture de cibles moléculaires sur 10x billes de gel multicellulaire monocellulaire Genomics, ainsi que la préparation de bibliothèques. Le flux de travail a été démontré à l’aide d’une coupe coronale de tissu cérébral de souris. Contrairement au flux de travail standard 10x Genomics Multiome, dans lequel l’accessibilité à la chromatine est mesurée par un test pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq), ce protocole remplace les fragments d’ADN dérivés de CUT&Tag par des fragments d’ATAC, permettant une interrogation directe des paysages de modification des histones à résolution monocellulaire. Pour relier les codes-barres spatiaux Trekker avec 10x codes-barres unicellulaires Genomics, des codes-barres spatiaux poly(A)-tailés et des transcripts d’ARNm sont capturés par les séquences poly-dT des billes de gel Multiome, tandis que les fragments d’ADN CUT&Tag sont capturés par les séquences espaceures. Cette stratégie de double capture permet la récupération simultanée d’informations épigénomiques, transcriptomiques et spatiales à partir d’un même noyau unique. À notre connaissance, il s’agit du premier flux de travail multiomique spatial qui intègre directement l’annotation spatiale Trekker en code-barres avec un test multiome à cellule unique pour co-profiler la distribution génomique d’une marque d’histone et le transcriptome. Les paysages multiomiques spatialement résolus qui en résultent, intégrant l’occupation du H3K27ac et les données d’expression génique, permettent de projeter les profils unicellulaires vers leurs coordonnées tissulaires d’origine et fournissent un lien direct entre les mécanismes régulateurs épigénomiques et les programmes transcriptionnels en relation avec l’architecture tissulaire intacte.

Protocol

Les souris adultes ont été euthanasiées par inhalation de CO₂ (IACUC # : A48315-15-R24) avant le prélèvement de tissu. Le cerveau a été entièrement retiré après une craniotomie sagittale et l’ablation de la calvaire coupée par deux. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Montage d’une section de tissu sur la tuile de code-barres Trekker pour le codage à barres spatial

1. Préparez ce qui suit avant de commencer.
   1. Équilibrez le bloc tissulaire optimal intégré à la température de coupe (OCT) dans un cryostat avant la coupe. Préparez les tampons pour la clivage UV, la dissociation tissulaire et l’isolement des noyaux.
      REMARQUE : La température optimale pour la coupe peut varier selon le type de tissu.
   2. Pour l’isolation des noyaux, prérefroidissez la centrifugeuse avec des seaux oscillants pour des tubes de 1,5 mL à 4 °C. Prérefroidissez une plaque à 12 puits avec un joint torique Trekker sur glace.
   3. Réglez le sonomètre UV à la limite maximale de courant (1,2 A) et à la puissance maximale.
2. Notez l’ID de la tuile de code-barres spatial (par exemple, U0001_001) de la tuile Trekker à utiliser.
   REMARQUE : Chaque tuile Trekker contient des coordonnées de code-barres uniques. L’identifiant de tuile est nécessaire pour récupérer le fichier correct pour la cartographie spatiale par code-barres des données de séquençage.
3. Coupez le tissu. Un coupement coronal d’une épaisseur de 25 μm à la position approximative de la bregme de -1 mm a été réalisé à −18 °C (Figure 1A).
   REMARQUE : L’épaisseur peut être augmentée à 30 μm lorsqu’on travaille avec des tissus de faible cellulité.
4. Positionnez la section (ou la région d’intérêt) sur la dalle spatiale et faites-la fondre en posant doucement un doigt sous le verre culissable.
   ATTENTION : Si nécessaire, vérifiez les procédures via les mesures de contrôle qualité des noyaux à l’aide de la tuile d’entraînement Trekker.
5. Utilisez une pince à pince pour retirer le carrelage de l’adhésif transparent et placez-le dans un puits de plaque de culture tissulaire à 12 puits sur de la glace au-dessus du joint torique Trekker. Pipettez immédiatement 30 μL de tampon de clivage UV Trekker sur la tuile, en vous assurant que tout le tissu est recouvert de tampon.
6. Placez la lampe UV (réglage 1,2 A) sur la plaque directement au-dessus du puits. Éclairez pendant 1 minute pour libérer les codes-barres tout en gardant tout au frais.
   ATTENTION : Portez des lunettes UV protectrices lorsque vous utilisez la lampe UV.
7. Éteignez la lampe UV et incubez la tuile sur de la glace pendant 7,5 minutes. Pendant l’incubation, retirez une chambre de lavage Trekker 10 x 10 et remplissez les chambres 1 et 2 avec 400 μL de tampon de lavage à noyaux froids Trekker pour un échantillon sur glace.
8. Soulevez soigneusement le carrelage avec une pince à épiler sans toucher aux perles et lavez le carrelage dans la chambre 1 pour 5 secondes. Lavez les carreaux dans la chambre 2 pendant 5 secondes. Placez soigneusement la tuile dans un puits de la plaque à 12 puits sur glace. La section de tissu doit être teintée en bleu et facilement visible.

2. Dissociation tissulaire et isolement des noyaux

1. Injectez 175 μL de tampon Invent Minute A en visant le tissu. Répétez 3 fois de plus pour obtenir un total de 700 μL. À chaque distribution, visez différentes parties de la tuile pour détacher tout le tissu de la tuile.
   REMARQUE : Évitez la contamination des perles causée par des rayures sur les carreaux ou la chute des perles.
2. Continuez à dissocier le tissu du carrelage en aspirant le tampon sur le côté du puits et en le distribuant sur les régions du carrelage recouvertes de tissu, en maintenant la plaque sur la glace autant que possible. Répétez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de tissu sur le carrelage. Une fois tout le papier retiré du carrelage avec précaution, utilisez soigneusement une pince à épiler pour transférer le carrelage dans un puits vide.
3. Utilisez une pipette P1000 pour dissocier mécaniquement les noyaux avec trituration répétée dans le même puits. Répétez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de morceaux de tissu visibles.
4. Transférez soigneusement la suspension des noyaux vers une cartouche filtrante avec un tube de collecte provenant du kit d’isolation à noyau unique Invent Minute pour les tissus/cellules neuronales. Incubez le tube avec le bouchon ouvert à –20 °C pendant 10 minutes. Bouchez la cartouche du filtre et centrifugez immédiatement à 13 000 x g pendant 30 secondes dans une microcentrifugeuse réfrigérée.
5. Jetez la cartouche filtrante et resuspendez la pastille en pipettant doucement 10 à 20 fois. Faites tourner le tube dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux pivotants à 600 x g pendant 5 minutes. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez la pellete dans 200 μL de tampon Trekker C.
6. Ajoutez 1 mL de tampon Minute Invent B à froid à un tube Eppendorf à faible liaison de 1,5 mL et superposez soigneusement 200 μL de suspension de noyaux sur le tampon Minute B en expulsant lentement contre la paroi du tube pour éviter le mélange des couches. Faites tourner le tube dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux pivotants à 500 x g pendant 10 minutes. Retirez soigneusement la couche lactée et le surnageant.
7. Resuspendez doucement les noyaux avec 24 μL de tampon Trekker C et procédez aux mesures de contrôle qualité des noyaux isolés.

Figure 2 : Évaluation du contrôle qualité des noyaux isolés. Images représentatives en champ lumineux de noyaux isolés à partir de tissu cérébral de souris. Les noyaux ont été colorés avec 0,4 % de bleu de Trypan et imagés à un grossissement de 40x afin d’évaluer l’intégrité nucléaire et la présence de débris. La préparation des noyaux illustrée à gauche présente des noyaux de haute qualité, intacts, adaptés aux essais en aval, tandis que la préparation à droite illustre des noyaux de mauvaise qualité avec des agrégats tissulaires partiellement lysés. Les noyaux endommagés ou rompus sont indiqués par des pointes de flèches remplies. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Comptage et mesures de contrôle qualité des noyaux isolés

1. Pour le comptage des noyaux, prenez 2 μL de la suspension de noyaux dans 8 μL de tampon Trekker C. Mélangez 10 μL de suspension diluée des noyaux avec 10 μL de solution colorante AO/PI. Comptez les noyaux selon les instructions du fabricant.
2. Pour évaluer la qualité des noyaux isolés, diluez 2 μL de suspension de noyaux en 8 μL de solution de bleu de trypan à 4 %. Examinez les noyaux au microscope à fluorescence à un grossissement de 40X, en vérifiant la morphologie intacte de la membrane nucléaire et la teneur en débris non nucléaires (Figure 2).
3. Procéder immédiatement à l’essai multiome CUT&Tag mononucleus (CUT&Tag sur H3K27ac + expression génique).
   ATTENTION : Passez aux étapes suivantes si au moins 30 000 noyaux de haute qualité sont récupérés.

4. Tagment CUT & Tag sur des noyaux isolés

1. Préparez le tampon d’incubation CUT & Tag I. Placez-le sur la glace.
2. Préparez l’anticorps primaire et la transposase activées par le conjugué enzymatique guide (TAG).
   1. Ajoutez 46,23 μL de tampon d’incubation CUT&Tag I et 1,33 μL d’enzyme TAG dans un tube PCR sur glace. Ajoutez une quantité optimisée d’anticorps primaire à la trompe. Mélangez lentement en pipettant 10 fois.
      REMARQUE : 2,43 μL d’anticorps anti-H3K27ac ont été ajoutés à la réaction. Le lot d’anticorps a été validé pour des tests CUT&Tag en vrac et in situ . Optimisez la quantité d’anticorps pour la conjugaison de l’enzyme TAG par test en masse. L’anticorps optimal a été défini comme la concentration la plus faible atteignant le rapport signal sur bruit maximal, tel que déterminé par qPCR aux loci cibles positifs et négatifs.
   2. Faites une petite tournée et placez le tube sur un rotateur à 18 tours. Incubez à température ambiante pendant 1 heure. Le mélange obtenu peut être préparé à l’avance et posé sur glace pendant jusqu’à 5 heures.
      REMARQUE : L’incubation d’anticorps-TAG peut être effectuée simultanément ou avant l’isolement du noyau.
3. Incubation de noyaux isolés avec conjugué enzymatique anticorps-TAG.
   1. Faites tourner le tube (Étape 2.7) des noyaux isolés dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux à oscillation à 500 x g pendant 10 minutes. Retirez le surnageant sans déranger la pastille et laissez ~5 μL de surnageant.
   2. Ajoutez 25 μL de tampon d’incubation CUT&Tag I (Étape 4.1) et resuspendez en pipettant doucement 10 fois. Transférez les noyaux dans le tube (Étape 4.2.2) contenant le conjugué anticorps-TAG en utilisant la même pointe de pipette. Mélangez doucement en pipettant 10 fois et placez le tube sur un rotateur doux.
   3. Couver toute la nuit à 4 °C.
4. Le lendemain (jour 2), préparez 1X tampon CUT&Tag pour les nuyaux et placez-le sur la glace.
5. Tag CUT&Tag
   1. Récupérez le tube de réaction (Étape 4.3.3) du rotateur. Ajoutez 5 μL d’activateur CUT&Tag et transférez le mélange dans un nouveau tube de 1,5 mL. Incubez pendant 1 heure à 37 °C sur le ThermoMixer à 550 tr/min.
   2. Récupérez le tube, ajoutez 20 μL de tampon de trempe CUT&Tag, et mélangez doucement la réaction en pipettant 10 fois. Centrifugez le tube dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux pivotants à 500 x g pendant 10 minutes. Retirez le surnageant sans perturber la pastille de noyaus, laissant ~5 μL de surnageant au fond du tube.
   3. Ajoutez 100 μL de tampon pour les noyaux 1X CUT&Tag et resuspendez les noyaux en pipettant doucement 10 fois. Faites tourner le tube dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux pivotants à 500 x g pendant 10 minutes. Retirer 85 μL du surnageant, en laissant ~15 μL. Resuspendre les noyaux en pipettant doucement et lentement 10 fois.
6. Comptage des noyaux marqués et détermination du nombre de ciblage
   1. Ajouter 1 μL de suspension de noyaux marqués dans 9 μL de solution séline tamponnée phosphate et mélanger avec 10 μL de solution colorante AO/PI. Compter les noyaux marqués comme décrit à l’étape 3.1.
   2. Utilisez 1,6 fois le nombre cible de noyaux pour la génération de GEM à cellule unique afin d’obtenir le nombre désiré de noyaux capturés.
   3. Faites tourner le tube dans la centrifugeuse prérefroidie avec des seaux pivotants à 500 x g pendant 10 minutes et retirez soigneusement le surnageant, laissant un volume final de 8 μL.

5. Codage à barres unicellulaire des noyaux marqués et préamplification des ADN codés à barres

1. Ajoutez 7 μL de tampon ATAC B à 8 μL des noyaux marqués avec le nombre attendu de noyaux ciblants pour votre expérience.
   REMARQUE : Voir plus de détails sur les configurations de réaction et le fonctionnement de l’instrument Chromium X dans le protocole « GEM Generation & Barcoding » du Guide utilisateur Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. Génération et codage à barres GEM utilisant l’instrument Chromium X.
   1. Ajoutez 60 μL de mélange maître GEM au tube contenant les noyaux marqués. Mélangez doucement en pipettant et chargez sur la rangée 1 de la puce Chromium Next GEM.
   2. Préparez des billes de gel multiome monocellulaire et chargez 50 μL de billes de gel sur la rangée 2. Distribuez 45 μL de pétrole de partition dans les puits de la rangée 3.
   3. Placez la puce assemblée J avec le joint dans le plateau de l’instrument Chromium X et faites passer l’instrument.
   4. Aspirez lentement 100 μL de GEM à partir des points les plus bas des puits de récupération dans la rangée supérieure 3. Distribuez lentement les GEM dans le nouveau tube PCR sur glace, avec les pointes de la pipette contre les parois latérales des puits.
   5. Incubez les GEM collectés dans un thermocycleur (température du couvercle à 50 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 37 °C pendant 45 minutes, un cycle à 25 °C pendant 30 minutes, et 4 °C pour le maintien en main.
   6. Ajoutez 5 μL d’agent de trempe et mélangez lentement en pipettant 10 fois.
3. Nettoyage de l’incubation post-GEM et purification de l’ADN
   REMARQUE : Voir plus de détails dans le protocole « Post GEM Incubation Cleanup » du Guide utilisateur ATAC + Gene Expression Kit de Chromium Next GEM Single-Cell Multiome + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. Ajoutez 125 μL d’agent de récupération rose au tube à température ambiante et inversez doucement le tube 10 fois. Centrifugeuse brièvement. Retirez lentement et jetez 125 μL d’agent de récupération/huile de partition (rose) du fond du tube.
   2. Ajoutez 200 μL de mélange de nettoyage Dynabeads dans le tube et mélangez en pipettant 10 fois. Incubez 10 minutes à température ambiante. Placez le tube sur le support magnétique jusqu’à ce que la solution disparaisse. Retirez le surnageant.
   3. Ajoutez 300 μL d’éthanol fraîchement préparé à 80 % à la pellete. Incubez 30 secondes et retirez le surnageant. Ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % au pellet, incubez 30 secondes, puis retirez le surnageant. Faites tourner le tube brièvement et placez-le sur l’aimant. Retirez le surnageant restant.
   4. Retirez le tube de l’aimant. Ajoutez immédiatement 50,5 μL de solution d’élution I. Mélangez en pipettant et incubez pendant 1 minute à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe. Transférez 50 μL de solution dégagée dans un nouveau tube.
   5. Purification de l’ADN par des billes paramagnétiques
      1. Ajoutez 90 μL de billes paramagnétiques (1,8X) à chaque échantillon et mélangez en pipettant soigneusement. Incubez 5 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe. Retirez le surnageant.
      2. Ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % au pellet. Incubez pendant 30 secondes. Retirez l’éthanol. Répétez cela encore une fois.
      3. Tournez brièvement et placez le tube sur l’aimant. Retirez le surnageant restant.
      4. Retirez le tube de l’aimant. Ajoutez 46,5 μL de tampon EB et mélangez par pipette. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      5. Transférez 46 μL d’ADN purifié dans un nouveau tube.
4. Pré-amplification des ADN codés à barres.
   1. Ajoutez 54 μL de mélange de préamplification à chaque échantillon. Mélange de pipettes et centrifuge brièvement.
   2. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 105 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 72 °C pendant 5 minutes ; un cycle à 98 °C pendant 3 minutes ; un total de 7 cycles à 98 °C pendant 20 s, 63 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 minute ; un cycle à 72 °C pendant 1 minute ; et une garde à 4 °C. Conserver à 4 °C toute la nuit.
   3. Le lendemain (jour 3), purifiez les ADN pré-amplifiés par des billes paramagnétiques (1,6X) comme décrit à l’étape 5.3.5. Ajoutez 80,5 μL de EB tampon au tube et mélangez par pipetage. Incubez 2 minutes à 22 °C (température ambiante). Faites tourner brièvement et placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
   4. Transférer 80 μL d’ADN pré-amplifié dans un nouveau tube. Utilisez 40 μL pour générer la bibliothèque CUT&Tag. Stockez les ADN préamplifiés restants à 4 °C.
      REMARQUE : 40 μL des ADN préamplifiés restants seront utilisés plus tard pour l’expression génique et les bibliothèques de codes-barres spatiales.

6. Préparation de la bibliothèque pour CUT&Tag, expression génique et codes-barres spatiaux

1. Préparation de la bibliothèque scCUT&Tag
   1. Transférez 40 μL d’ADN pré-amplifiés dans un nouveau tube et ajoutez 60 μL de mélange PCR index d’échantillon. Mélangez en pipettant et en filant brièvement.
   2. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 105 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 98 °C pendant 45 s ; un total de 12 cycles de 98 °C pendant 20 s, 67 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 20 s ; un cycle à 72 °C pendant 1 minute ; 4 °C pour la retenue).
      REMARQUE : Le nombre de cycle optimal dépend du nombre initial de noyaux et de la marque d’histone à profiler. Douze cycles d’amplification ont été utilisés pour la marque H3K27ac dans l’expérience.
   3. Double sélection de taille et purification de l’ADN par billes paramagnétiques (0,6X, 1,55X)
      1. Ajoutez 60 μL de billes paramagnétiques (0,6X) à chaque échantillon et mélangez en pipettant soigneusement. Incubez 5 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      2. Transférez 150 μL de surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez 95 μL de billes paramagnétiques (1,55X) à chaque échantillon (surnageant) et mélangez par pipetage. Incubez 5 minutes à température ambiante. Placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe. Retirez le surnageant.
      3. Ajoutez 300 μL d’éthanol à 80 % à la pellete. Attends 30 s. Retirez l’éthanol. Répétez-le encore une fois. Tournez brièvement et placez le tube sur l’aimant. Retirez le surnageant restant.
      4. Retirez le tube de l’aimant. Ajoutez 20,5 μL de tampon EB au tube et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      5. Transférez 20 μL de bibliothèques CUT&Tag purifiées et indexées vers de nouveaux tubes.
2. Vérification QC pour la bibliothèque CUT&Tag
   1. Analyse de la répartition de la taille de l’ADN dans la bibliothèque
      1. Mélangez 1 μL d’ADN de bibliothèque purifié avec 1 μL de tampon à faible TE.
      2. Mélangez l’ADN dilué avec un tampon de travail Fragment Analyzer et faites fonctionner sur l’instrument avec le kit de fragments HS NGS à haute sensibilité (1-6000 bp) (Figure 3A).
   2. Évaluer l’enrichissement d’un locus génomique H3K27ac-positif avant le séquençage et la cartographie.
      1. Mélangez 1 μL d’ADN de bibliothèque purifié avec 4 μL d’eau sans nucléase. Utilisez 1 μL d’ADN de bibliothèque dilué pour les mesures qPCR de trois loci génomiques.
         REMARQUE : Pour H3K27ac CUT&Tag, l’amorce positive a été conçue à partir du locus Actb-TSS, tandis que les amorces ciblant le T1-TSS et un locus intergénique servaient de contrôles^{négatifs 20} (Tableau 1). L’ADN génomique de la souris a été utilisé comme contrôle d’entrée pour normaliser l’efficacité de la PCR (Figure 3B).
      2. Préparez un total de 20 μL du mélange réactionnel comme suit : 1 μL d’ADN de bibliothèque dilué, 2 μL de mélange amorce 10 μM, 10 μL de 2X SYBR Green Master Mix, et 7 μL d’eau sans nucléase.
      3. Exécutez la plaque qPCR préparée sur le système de PCR en temps réel CFX Opus en utilisant le programme de cycle approprié pour la détection SYBR Green.
3. Amplification des ADNc et des ADN de codes-barres spatiaux.
   1. Transférez 35 μL d’ADN pré-amplifiés (étape 5.4.4) dans un nouveau tube et ajoutez 65 μL de mélange de réaction d’amplification d’ADNc. Mélangez en pipettant et en filant brièvement. L’amorce utilisée pour l’amplification de l’ADN par cDNA et code-barres spatial est les Feature cDNA Primers 2.
   2. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 105 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 98 °C pendant 45 s ; un total de 8 cycles à 98 °C pendant 20 s, 63 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 minute ; un cycle à 72 °C pendant 1 minute ; 4 °C pour la réserve.
      REMARQUE : Le nombre optimal de cycles doit être déterminé en fonction du type cellulaire, de la teneur en ARN et du nombre initial de noyaux. Dans cette expérience, 8 cycles d’amplification ont été réalisés.
   3. Purification des ADNc amplifiés
      1. Double sélection de taille et purification de l’ADN par billes paramagnétiques (0,6X, 2,0X) comme décrit à l’étape 6.1.3. Ajoutez 60 μL de billes paramagnétiques (0,6X) à chaque échantillon et mélangez par pipette. Incubez 5 minutes à température ambiante. Placez l’aimant sur la solution jusqu’à ce qu’elle disparaisse.
      2. Transférez et économisez 75 μL de surnageant dans un nouveau tube sans déranger la pastille. Maintenez-le à température ambiante.
         ATTENTION : Ne jetez pas le surnageant, car il contient de l’ADN enrichi pour des fragments plus courts qui serviront à générer la bibliothèque de codes-barres spatiale.
      3. Retirez le surnageant restant de la pastille. Lavez deux fois avec de l’éthanol à 80 % comme décrit à l’étape 6.1.3.
      4. Ajoutez 40,5 μL de EB tampon au tube et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      5. Transférez 40 μL d’ADNc amplifiés vers un nouveau tube. Gardez-le sur glace pour préparer une bibliothèque d’expression génique indexée.
         REMARQUE : Cette fraction enrichit les ADN pour la taille typique des ADNc.
   4. Purification des ADN amplifiés à code-barres spatial
      1. Ajoutez 70 uL de billes paramagnétiques (2,0X) à 75 μL du surnageant précédemment sauvegardé (Étape 6.3.3.2). Mélangez en pipettant et en filant brièvement. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe. Retirez le surnageant.
      2. Lavez deux fois avec de l’éthanol à 80 % comme décrit à l’étape 6.1.3.
      3. Ajoutez 40,5 μL de EB tampon au tube et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      4. Transférez 40 μL d’ADN à codes-barres spatials amplifiés et purifiés dans un nouveau tube. Stockez à −20 °C pour la génération ultérieure de la bibliothèque de codes-barres spatiale indexée.
   5. Analyse des tailles d’ADNc par l’analyseur de fragments. Mélangez 1 μL d’ADNc amplifié avec 1 μL de tampon à faible TE. Analysez les ADN dilués par analyseur de fragments comme décrit à l’étape 6.2.1.
   6. Préparation de la bibliothèque d’expression génique indexée
      1. Transférez 10 μL d’ADNc amplifiés (Étape 6.3.3.5) vers un nouveau tube. Ajoutez 25 μL de tampon EB et 15 μL de mélange de fragmentation. Mélangez en pipettant sur de la glace. Faites une courte rotation et transférez le tube dans le cycleur thermique pré-refroidi à 4 °C.
      2. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 65 °C) en initiant le protocole suivant : un cycle à 32 °C pendant 5 minutes ; un cycle de 65 °C pendant 30 minutes ; 4 °C pour la réserve.
      3. Double sélection de taille et purification de l’ADN par billes paramagnétiques (0,6X, 0,8X) comme décrit à l’étape 6.1.3. Ajoutez 50,5 μL de tampon EB et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      4. Transférez 50 μL d’échantillon dans un nouveau tube. Ajoutez 50 μL de mélange de ligature adaptateur et mélangez en pipettant. Tourne brièvement. Incubez dans un thermocycleur (température du couvercle à 30 °C) selon le protocole suivant : un cycle de 20 °C pendant 15 minutes et 4 °C pour la retenue.
      5. Purification de l’ADN par billes paramagnétiques (0,8X) comme décrit à l’étape 5.3.5. Ajoutez 30,5 μL de EB tampon et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe. Transférez 30 μL de l’échantillon dans un nouveau tube.
      6. Index PCR de la bibliothèque d’expression génique. Ajoutez 50 μL de mélange d’ampères et ajoutez 20 μL d’un ensemble TT double index A à chaque échantillon.
      7. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 105 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 98 °C pendant 45 s ; un total de 11 cycles de 98 °C pendant 20 s, 54 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 20 s ; un cycle à 72 °C pendant 1 minute ; 4 °C pour la réserve.
         REMARQUE : Le nombre optimal de cycles doit être déterminé en fonction du type cellulaire, de la teneur en ARN et du nombre initial de noyaux. Dans cette expérience, un total de 11 cycles d’amplification ont été utilisés.
      8. Double sélection de taille et purification de l’ADN par billes paramagnétiques (0,6X, 0,8X) comme décrit à l’étape 6.1.3. Ajoutez 35,5 μL de tampon EB au tube et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Faites tourner brièvement et placez sur l’aimant jusqu’à ce que la solution se dissipe.
      9. Transférer 35 μL de bibliothèque d’expression génique purifiée et indexée dans un nouveau tube.
4. Analyse de la distribution de la taille de l’ADN dans la bibliothèque d’expression génique. Mélangez 1 μL d’ADN de bibliothèque avec 1 μL de tampon à faible TE. Analysez les ADN dilués comme décrit à l’étape 6.2.1. (Figure 3A).
5. Préparation d’une bibliothèque de codes-barres spatiales indexées
   1. Préparez un total de 100 μL du mélange PCR index de l’échantillon comme suit : 50 μL de mélange d’ampères (issu du kit de codes-barres caractéristiques GEM-X Single-Cell 3'), 25 μL de tampon EB, 20 μL d’amorce du Double Index Plate TT Set A, et 1 μL d’ADN à code-barres spatial purifié (Étape 6.3.4.4) dilués dans 4 μL de tampon EB.
   2. Incuber dans un thermocycleur (température du couvercle à 105 °C) selon le protocole suivant : un cycle à 98 °C pendant 45 s ; un total de 7 cycles de 98 °C pendant 20 s, 54 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 20 s ; 72 °C pendant 1 minute ; 4 °C pour la réserve.
   3. Purification de l’ADN par billes paramagnétiques (1,2X) comme décrit à l’étape 5.3.5. Ajoutez 35,5 μL de tampon EB au tube et mélangez en pipettant. Incubez 2 minutes à température ambiante. Placez le tube sur l’aimant jusqu’à ce que la solution soit claire.
   4. Transférer 35 μL d’ADN de bibliothèque de codes-barres spatiales purifiés et indexés dans un nouveau tube. Conserver à 4 °C jusqu’à 72 heures ou à −20 °C pour un stockage à long terme.
6. Vérifiez la répartition des tailles d’ADN dans la bibliothèque de codes-barres spatiale indexée. Mélangez 1 μL d’ADN de bibliothèque purifié avec 1 μL de tampon à faible TE. Analysez les ADN dilués avec un analyseur de fragments comme décrit à l’étape 6.2.1 (Figure 3A).

Figure 3 : Évaluations de contrôle qualité des bibliothèques indexées. (A) Profils de taille dans les ADN amplifiés et les bibliothèques indexées. L’ADN est analysé par un analyseur de fragments afin d’évaluer la qualité et la répartition de la taille de l’ADN. Sont présentés les profils représentatifs pour la bibliothèque indexée CUT&Tag, l’ADN amplifié utilisé pour la préparation de la bibliothèque d’expression génique et de codes-barres spatial, la bibliothèque d’expression génique indexée et la bibliothèque de codes-barres spatiale indexée. (B) La bibliothèque CUT&Tag est analysée par qPCR pour évaluer l’enrichissement d’une région génomique H3K27ac positive (c’est-à-dire ACTB) sur le signal de fond H3K27ac négatif (c’est-à-dire T1 et un locus intergénique). La différence de pliement entre les régions positive/négatives est calculée comme enrichissement²¹. Un enrichissement de plis supérieur à 10 est considéré comme idéal dans ce test²⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

7. Séquençage des bibliothèques

1. Séquencez la bibliothèque de codes-barres spatiale Trekker à une profondeur de 5 000 paires de lectures par noyau capturé.
2. Séquencez la bibliothèque CUT&Tag H3K27ac à une profondeur de 25 000 paires de lectures par noyau capturé.
3. Séquencez la bibliothèque d’expression génique à une profondeur d’au moins 20 000 paires de lectures par noyau capturé.

8. Bioinformatique et analyse de données

1. Traiter l’expression génique et les lectures CUT&Tag en utilisant Cell Ranger ARC v2.0.2 avec --min-atac-count=100 et --min-gex-count=1000. Intégrer les sorties ARC de Cell Ranger avec les informations de code-barres Trekker en utilisant le pipeline Trekker v1.3.0 avec les paramètres par défaut pour assigner des positions spatiales.
2. Effectuez le contrôle qualité avec Signac. Les cellules répondant à l’un des critères suivants ont été retirées de l’analyse en aval : pour CUT&Tag, le nombre total de fragments ≥ 1 000 000 ou ≤ 100, et l’enrichissement TSS ≤ 2 ; pour l’expression génique, le nombre total d’UMI ≥ 100 000 ou ≤ 1 000, et le nombre total de gènes détectés ≥ 10 284 ou ≤ 200.
3. Retirez les doublets avec scDblFinder pour l’expression génique et AMULET pour CUT&Tag. Les cellules répondant à l’un des critères suivants ont été classées comme doublets : (1) score scDblFinder ≥ 0,6 ; (2) score scDblFinder ≥ 0,3 et AMULET ≤ 0,01 ; et (3) dans les amas avec un pourcentage élevé de doublets.
4. Normaliser les données d’expression génique à l’aide de LogNormalize et CUT&Tag avec TF-IDF. Calculez les embeddings ARN PCA et CUT&Tag LSI, en utilisant les dimensions LSI 2–50 pour la modalité chromatine. Construisons un graphe de voisins le plus proche pondéré en utilisant FindMultiModalNeighbors et génèrent des plongements UMAP basés sur le graphe de voisins multimodaux.
5. Annoter les données post-QC Trekker en utilisant le transfert d’étiquettes Seurat basé sur FindTransferAnchors et une stratégie de projection PCA avec paramètres par défaut. Les données scRNA-seq de l’ABC Atlas (version 20230630) ont été utilisées comme référence. Les prédictions de type cellulaire incompatibles avec l’anatomie tissulaire connue ont été retirées lors d’une curation manuelle.
   REMARQUE : Les scripts pour l’analyse bioinformatique sont disponibles sur GitHub : https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

En utilisant une coupe coronale (épaisseur de 25 μm, couvrant environ 70 % d’une tuile spatiale de 10 × 10 mm) de tissu cérébral de souris fraîchement congelé, le flux de travail décrit ici a permis de produire systématiquement 50 100 noyaux de haute qualité (DE = 12 200, n = 8), suffisants pour un profilage multiomique monocellulaire en aval (Figure 1). Suite au codage spatial Trekker de la section tissulaire, les noyaux ont été isolés par dissociation tissulaire douce et purifiés davantage avec le kit d’isolation à noyau unique Invent. Cette procédure a permis de produire un minimum de débris et de faibles niveaux d’agrégation nucléaire, produisant des préparations de noyaux adaptées aux essais monocellulaires. Des images représentatives des noyaux isolés sont présentées à la Figure 2.

Pour les tests à noyau unique en aval, y compris le profilage multiome CUT&Tag (CUT&Tag + expression génique), environ 50 000 noyaux ont généralement été traités ici. Pour maximiser la récupération nucléaire, un protocole simplifié et rationalisé CUT&Tag à faible entrée a été mis en place en utilisant un ciblage direct anticorps–pA/Tn5 et une marquage, minimisant ainsi les temps d’incubation et les étapes^{de lavage 19}. Grâce à cette approche, environ 25 000 noyaux marqués ont été récupérés, correspondant à un rendement moyen de 48,3 % (DE = 6,1, n = 3). Ces noyaux ont ensuite été utilisés pour le codage à barres monocellulaire avec les 10x billes de gel Genomics Chromium Multiome. Pour la génération de GEM, environ 15 000 noyaux ont été ciblés avec l’attente de récupérer ~10 000 noyaux indexés spatialement après filtration de qualité. Sur la base du décodage spatial par code-barres Trekker, 81,3 % des noyaux (SD = 9, n = 3) du jeu de données monocellulaire pouvaient être attribués en toute confiance à des positions spatiales au sein de la tuile.

Le flux de travail multiome spatial Trekker–CUT&Tag génère trois bibliothèques indexées : CUT&Tag, l’expression génique et les bibliothèques de codes-barres spatiales. L’ADN préamplifié à code-barres était divisé en deux fractions, chacune utilisée pour la préparation de la bibliothèque selon la chimie de capture des cibles sur les billes de gel. Les bibliothèques CUT&Tag ont été directement amplifiées à partir d’ADN pré-amplifié et ont montré des distributions de taille de fragments caractéristiques de la tagmentation CUT&Tag, correspondant à l’ADN sans nucléosomes et aux ADN nucléosomique (Figure 3A). La bibliothèque a montré un bon enrichissement du locus Actb positif H3K27ac sur les loci génomiques H3K27ac^{négatifs 20,21} (c’est-à-dire une différence de 68 fois, dépassant la coupure de 10 fois précédemment établie pour l’analyse par immunoprécipitation par chromatine et séquençage de H3K27ac²⁰) (Figure 3B). Pour l’expression génique et les bibliothèques spatiales de codes-barres, l’ADN pré-amplifié a d’abord été amplifié selon le protocole d’amplification 10x Genomics cDNA, puis séparé en deux fractions selon la taille des fragments grâce à la purification par billes paramagnétiques. La bibliothèque de codes-barres spatiale indexée a été préparée à partir de la fraction enrichie pour les fragments plus courts et a montré un pic net à la taille attendue du fragment. Les bibliothèques d’expression génique ont montré une distribution caractéristique de taille centrée autour de fragments d’ADNc amplifiés (Figure 3A).

Figure 4 : Représentation unicellulaire et spatiale du test multiome spatial Trekker–CUT&Tag dans le tissu cérébral de la souris. (A) Identification des types cellulaires par analyse à cellule unique. Les graphiques d’approximation et projection de variété uniforme (UMAP) montrent des populations cellulaires annotées dérivées uniquement de H3K27ac CUT&Tag, de l’expression génique seule, et du jeu de données multiome intégré (CUT&Tag + expression génique). (B) Représentation spatiale des données spatiales multiomes Trekker–CUT&Tag. Les noyaux issus de l’ensemble de données multiome intégré sont attribués à des coordonnées spatiales à l’aide de codes-barres Trekker, révélant des distributions anatomiquement organisées des types cellulaires à travers la section du tissu cérébral de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Le séquençage et la cartographie des bibliothèques CUT&Tag et d’expression génique ont été réalisés en utilisant Cell Ranger ARC v2.0.2 selon 10x les directives de Genomics, tandis que les bibliothèques de codes-barres spatiales ont été traitées avec Trekker v1.3.0 selon les recommandations de Takara Trekker. Les options de cartographie ATAC-seq à cellule unique suggérées ont été appliquées aux bibliothèques CUT&Tag. Des ensembles de données à noyau unique ont été générés uniquement pour CUT&Tag, pour l’expression génique seule, et le multiome combiné (CUT&Tag + expression génique). Les cellules présentant des UMI totaux pour CUT&Tag (≥ 1 000 000 ou ≤ 100) ou l’expression génique (≥ 100 000 ou ≤ 1000) ont été filtrées à l’aide de Signac²². La prédiction du doublet a été réalisée en utilisant une combinaison de scDblFinder²³ pour l’expression génique et AMULET²⁴ pour CUT&Tag. Les cellules répondant à l’un des critères suivants ont été supprimées : 1) scDblFinder.score > 0,6 ; 2) scDblFinder.score entre 0,3 et 0,6, et amulet.score < 0,01. L’annotation par type cellulaire a été réalisée à l’aide de FindTransferAnchors²⁵ de Seurat, basée sur les données^{de référence 26} de l’Allen Brain Cell Atlas. Pour la bibliothèque d’expression génique de cette étude, le nombre médian d’UMI par cellule était de 15 378, et le nombre médian de gènes par cellule était de 4 378. Pour la bibliothèque CUT&Tag, 11 860 cellules ont été détectées, avec une médiane de 6 631 fragments de haute qualité par cellule et un score d’enrichissement TSS de 7,66. Pour la bibliothèque de codes-barres spatiale Trekker, 92,43 % des noyaux ont reçu des positions spatiales, et 51,54 % des noyaux ont été assignés à un seul emplacement spatial. Les données brutes de séquençage et les données traitées issues d’analyses secondaires sont disponibles via GEO sous le numéro d’accès GSE327406. L’objet Seurat annoté post-QC final est disponible sur Zenodo sous le numéro d’accession 19475899. Les embeddings représentatifs UMAP avec annotations de type cellulaire sont présentés à la Figure 4A. En reliant des codes-barres unicellulaires à des codes-barres spatiaux, les noyaux individuels étaient renvoyés à leur emplacement spatial dans le tissu pour générer une carte spatiale (Figure 4B). Cette carte correspond étroitement aux caractéristiques anatomiques observées dans les sections adjacentes et s’aligne avec une section cérébrale coronale dans l’Allen Brain^{Atlas 27}, une référence standard pour l’anatomie cérébrale de la souris. L’analyse conjointe de l’expression génique spatiale et des profils H3K27ac à résolution unicellulaire a permis d’identifier les principaux types de cellules cérébrales et de révéler des schémas anatomiquement organisés de la distribution cellulaire à travers la section tissulaire.

Discussion

Ce protocole décrit un flux de travail spatial multiome Trekker–CUT&Tag qui intègre le code-barres spatial, le profilage CUT&Tag à faible entrée de H3K27ac, la capture simultanée de plusieurs cibles moléculaires sur les 10x billes multiome monocellulaires de Genomics, et la préparation de la bibliothèque en aval pour le séquençage Illumina. En couplant l’indexation spatiale avec les lectures épigénomiques et transcriptomiques unicellulaires, cette approche répond à une limitation fondamentale des tests multiomes monocellulaires conventionnels, qui manquent de contexte tissulaire natif. Cette étude démontre avec succès la faisabilité du profilage multiome spatial CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + expression génique) et établit une base pour le co-profilage spatial de l’expression génique et des cibles régulatrices telles que les marques d’histones et les protéines associées à la chromatine.

Un contrôle qualité rigoureux à plusieurs étapes du flux de travail est essentiel pour la mise en œuvre réussie de ce flux (Figure 1). Bien que la procédure décrite ici commence par des étapes post-coupe, la qualité même de la section tissulaire est essentielle pour obtenir des résultats optimaux. L’épaisseur de la section doit être ajustée en fonction du type de tissu et de la cellulité attendue. Lors de la dissociation tissulaire et de l’isolement des noyaux, maximiser le rendement des noyaux tout en préservant l’intégrité nucléaire est essentiel pour la performance globale des tests multiomes unicellulaires basés sur Trekker. Un faible rendement des noyaux peut résulter d’une dissociation tissulaire sous-optimale, d’une isolation inefficace des noyaux ou d’une épaisseur de section insuffisante. Une faible intégrité nucléaire peut résulter d’une perturbation mécanique excessive, de temps de traitement prolongés ou d’une surlysie. L’isolation des noyaux représente un point majeur de dépannage pour la mise en œuvre réussie du flux de travail multiome monocellule basé sur Trekker. Par conséquent, une optimisation spécifique au tissu du protocole d’isolation des noyaux est fortement recommandée avant d’initier le test multiome monocellulaire basé sur Trekker. Les noyaux isolés doivent être évalués quantitativement et qualitativement. Le comptage des noyaux à l’aide de colorants nucléaires permet d’estimer le rendement, tandis que l’examen microscopique permet d’évaluer l’intégrité de la membrane nucléaire, l’agrégation et la présence de débris non nucléaires. Après la préparation des bibliothèques, toutes les bibliothèques doivent être évaluées pour la distribution de la taille des fragments et l’absence de dimères adaptateurs. Pour les bibliothèques CUT&Tag, l’enrichissement des régions génomiques cibles sur le fond doit être évalué par PCR quantitative, fournissant une indication précoce de la spécificité du test et de la qualité globale de la bibliothèque avant le séquençage. Le contrôle qualité post-séquençage est tout aussi important pour une interprétation précise des données multiomes spatiales. Des indicateurs tels que les taux de cartographie, le nombre de fragments par noyau, l’enrichissement du site de début de transcription, les scores fragment-in-pic pour CUT&Tag, la complexité du gène et la profondeur de lecture par cellule doivent être évalués selon les recommandations de 10x Genomics et Takara Trekker. L’évaluation conjointe de ces métriques à travers les modalités épigénomiques et transcriptomiques permet d’identifier des artefacts techniques et assure une intégration fiable des informations spatiales, épigénomiques et transcriptionnelles.

Bien que la faisabilité de l’approche à code-barres basée sur Trekker combinée à un test multiome CUT&Tag à cellule unique soit démontrée dans cette étude, l’approche décrite présente également des limites. Par exemple, la méthode est actuellement limitée aux tissus frais congelés, et sa faisabilité n’a été démontrée que pour le profilage d’une seule modification d’une histone (H3K27ac) dans un seul type de tissu (cerveau de souris) sans réplication biologique. De plus, l’approche repose sur deux plateformes commerciales propriétaires (Takara Trekker et 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Une évaluation supplémentaire sur divers types de tissus et des marques épigénétiques supplémentaires sera nécessaire pour évaluer l’applicabilité, la performance, la généralisation et la reproductibilité plus larges de cette technologie.

En résumé, le protocole multiome spatial Trekker–CUT&Tag présenté ici démontre la capacité de coprofilage spatial à une seule cellule des caractéristiques épigénomiques et transcriptomiques. En combinant le codage à barres spatial avec la chimie multiome unicellulaire établie, il permet une investigation mécaniste de la régulation génique au sein de l’architecture tissulaire intacte et offre une plateforme puissante pour de futures applications en biologie spatiale. Parmi les usages potentiels notables figurent l’évaluation de l’impact de divers stimuli expérimentaux et environnementaux sur le contrôle épigénétique de l’expression génique dans des types cellulaires spécifiques — par exemple, les effets des stimulations nerveuses pourraient être analysés dans des types spécifiques de neurones des systèmes nerveux central et périphérique, ou l’impact sur les cellules voisines des cellules immunitaires infiltrantes pro- et anti-inflammatoires pourrait être révélé dans les maladies inflammatoires et les cancers.