Fenêtre du crâne optiquement transparent montée sur la tête (HOTS) pour l’imagerie transcrânienne profonde du cortex de la souris

Résumé

Ce protocole décrit une fenêtre de crâne optiquement transparent (HOTS) montée sur la tête, basée sur une procédure optimisée de nettoyage du crâne en deux étapes. Cette approche permet d’obtenir un crâne très transparent, permettant l’imagerie à deux photons du cortex cérébral adulte de la souris jusqu’à des profondeurs allant jusqu’à ~800 μm.

Résumé

L’imagerie à deux photons à haute résolution du cortex cérébral de la souris adulte est fortement limitée par la diffusion de la lumière provenant du crâne, qui atténue les signaux et limite la profondeur d’imagerie in vivo. Bien que des méthodes de nettoyage du crâne aient été développées pour fournir un accès optique au cortex via le crâne intact, leurs performances pratiques sont limitées par un temps de nettoyage limité et des cocktails de nettoyage sous-optimaux. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour mettre en œuvre une fenêtre de crâne optiquement transparent montée sur la tête (HOTS). Dans cette approche, un bonnet monté sur la tête était utilisé pour maintenir des solutions de dégagement sur le crâne, évitant ainsi une anesthésie prolongée ou une contrainte physique, et permettant un dégagement prolongé du crâne (plusieurs heures) chez des souris éveillées et se comportant librement. De plus, une procédure de dégagement en deux étapes a été réalisée à l’aide de réactifs (HOTS-S1 : 10 % en poids/v EDTA, 15 % en poids/v de D-mannose, 10 % en poids/v sulfolane, 0,5 % en poids/v Tween 20 ; HOTS-S2 : 70 % en poids/v de D-mannose, 5 % en poids/v sulfolane, 0,5 % en poids/v préadolescents 20) optimisés par dépistage chimique systématique. Nous proposons un protocole étape par étape incluant l’exposition et la stabilisation du crâne, la création et le montage du capuchon monté sur la tête, l’administration et le rafraîchissement des réactifs de dégagement, ainsi que la préparation ultérieure de l’imagerie. Chez les souris âgées de 6 semaines (~20 g), le protocole HOTS produit régulièrement un crâne hautement transparent qui permet l’imagerie à deux photons des structures corticales jusqu’à des profondeurs allant jusqu’à ~800 μm sous le pia, s’approchant de la performance des fenêtres à crâne ouvert. La fenêtre HOTS permet l’imagerie structurelle chez les souris Thy1-GFP-M et l’imagerie fonctionnelle du calcium chez les souris Thy1-GCaMP6. Nous pensons qu’en tant qu’approche pratique et peu invasive, la fenêtre HOTS facilitera significativement l’imagerie transcrânienne profonde ainsi que les manipulations optogénétiques, photopharmacologiques et autres basées sur la lumière in vivo.

Introduction

La surveillance intravitale des neurones corticaux est essentielle pour comprendre la structure et le fonctionnement du^{cerveau 1}. La microscopie à deux photons (TPM) est un outil clé pour ce type d’études in vivo ^2,3. Cependant, sa qualité d’imagerie et sa profondeur sont fortement limitées par une forte diffusion lumineuse provenant du crâne opaque recouvrant le^{cortex 4,5}.

Les fenêtres à crâne^{ouvert 6} et à crâne aminci ^7,8 ont grandement amélioré l’accès optique au cortex et sont largement utilisées, mais les deux approches présentent des limites inhérentes. Les fenêtres à crâne ouvert peuvent induire des lésions cérébrales aiguës et des réponses^{inflammatoires 9,10}, tandis que l’amincissement du crâne est techniquement exigeant et difficile à atteindre avec une épaisseur uniforme^11,12.

Les techniques de clairiage optique in vivo du crâne offrent une alternative peu invasive qui permet l’imagerie à deux photons à résolution axonale chez la souris adulte. Cependant, la profondeur d’imagerie atteignable reste limitée (généralement 150–400 μm en dessous du pia⁾12,13,14,15. En pratique, le dégagement du crâne est généralement limité à une courte période sous anesthésie avec une fixation rigide de la tête, et l’optimisation systématique des cocktails de déminage pour la composition osseuse du crâne est restée^{sous-explorée} 12,13,14,15.

Pour surmonter ces limitations, nous avions auparavant développé une fenêtre de crâne optiquement transparent montée sur la tête (HOTS) qui permet un nettoyage prolongé du crâne hors ligne chez des souris en comportement libre (Figure 1A)¹⁶. Cette approche utilise une procédure de dégagement en deux étapes à l’aide de réactifs (S1 et S2), qui ont été optimisés par un dépistage chimique systématique dans nos travaux^{précédents 16}. L’optimisation systématique des réactifs de dégagement et la caractérisation de l’efficacité, de la réversibilité, de la biosécurité et de la performance d’imagerie in vivo de la fenêtre HOTS ont été rapportées dans nos travaux^{précédents 16}, qui ont également démontré une réponse astrogliale favorable après le traitement HOTS. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour établir la fenêtre HOTS afin de permettre l’imagerie transcrânienne profonde à deux photons chez la souris adulte. Dans des préparations représentatives, les profondeurs d’imagerie atteignent ~800 μm en dessous du pia, presque égales à celles réalisables avec des fenêtres à crâne ouvert. La fenêtre HOTS permet l’imagerie structurale profonde chez les souris Thy1-GFP-M et l’imagerie fonctionnelle du calcium chez les souris Thy1-GCaMP6 éveillées.

Protocole

Toutes les procédures de soins et expérimentales animales ont été approuvées par le Comité provincial de soins et d’utilisation des animaux du Guangdong et ont été menées conformément aux directives du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Institut de technologie avancée de Shenzhen, Académie chinoise des sciences. Les réactifs et équipements utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour les souris âgées de 6 semaines (poids corporel ~20 g), dont l’épaisseur du crâne est d’environ 100 μm.

1. Préparation de solutions de nettoyage du crâne

1. Préparer la solution de dégagement du crâne S1 (10 % en poids/v EDTA, 15 % en poids/v D-mannose, 10 % en poids/v sulfolane, 0,5 % en poids/v Tween 20 ; RI : 1,38 ; pH final : 7,0-7,4)
   1. Un poids de 0,35 g d’hydroxyde de sodium (NaOH). Ajoutez-le à 20 mL d’eau déionisée dans un bécher et remuez jusqu’à ce que ce soit complètement dissous. Cela augmente le pH de la solution, facilitant la dissolution ultérieure de l’EDTA.
      REMARQUE : Le NaOH est corrosif. Portez un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire, protection oculaire) et manipulez une hotte chimique anti-fumée.
   2. Ajoutez 4 g d’acide éthylédiaminétique tétraacétique (EDTA) à la solution de NaOH. Placez le bécher dans un bain-marie à 40 °C et remuez continuellement jusqu’à ce que l’EDTA soit complètement dissous.
   3. Refroidissez le mélange à température ambiante. Ajoutez 6 g de D-mannose, 4 g de sulfolane et 0,2 g de Tween 20 à la solution. Remuez à température ambiante jusqu’à ce que tous les composants soient complètement dissous.
   4. Ajoutez de l’eau déionisée pour porter le volume final à 40 mL. Mélangez soigneusement pour obtenir S1.
      REMARQUE : S1 peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois.
2. Préparer la solution de dégagement du crâne S2 (70 % en poids/v de D-mannouse, 5 % en poids/v de sulfolane, 0,5 % en poids/v Tween 20 ; RI final : 1,44 ; pH final : 7,0-7,4)
   1. Pèser 28 g de D-mannose, 2 g de sulfolane et 0,2 g de Tween 20 et transférez-les dans un bécher propre.
   2. Ajoutez de l’eau déionisée à environ 30 mL et remuez à température ambiante jusqu’à ce que tous les composants soient complètement dissous.
   3. Ajoutez de l’eau déionisée pour porter le volume final à 40 mL et mélangez soigneusement pour obtenir S2.
      REMARQUE : Un chauffage doux (25–30 °C) et un brassage continu accélèrent la dissolution du D-mannose. S2 peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois.

2. Préparation à l’opération

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux et stériliser soigneusement l’espace de travail avec 75 % d’alcool.
2. Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (p/v) (150–200 μL pour 20 g de poids corporel).
   REMARQUE : D’autres anesthésiques réversibles peuvent être utilisés comme alternatives au pentobarbital sodique.
3. Surveillez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du test de réflexe pincé des orteils et assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée avant de commencer l’opération.
4. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique et fixez la tête avec des barres d’oreilles.
5. Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’une bouillotte.
6. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter la sécheresse cornéenne.
   REMARQUE : Surveillez de près la respiration et les réflexes pour éviter une surdose d’anesthésie et une dépression respiratoire.

3. Chirurgie et montage de la plaque de tête

1. Exposition et nettoyage du crâne (Figure 1Ba)
   1. Retirez le cuir chevelu sur toute la surface dorsale du crâne à l’aide de pinces fines et de ciseaux chirurgicaux. Taillez la peau latéralement pour exposer les bords des muscles temporaux et vers l’arrière vers les muscles du cou.
   2. Retirez doucement le périoste de la surface du crâne à l’aide de pinces fines.
   3. Nettoyez la surface du crâne avec un applicateur humide à extrémité de coton et séchez le crâne avec un jet d’air doux.
   4. Si une localisation précise des zones fonctionnelles du cortex cérébral est requise, marquez des points de référence espacés de 1 mm à la surface du crâne à l’aide d’un appareil stéréotaxique.
2. Application de ciment dentaire et de plaque de tête (Figure 1Bb)
   1. Préparez le ciment dentaire selon les instructions du fabricant. Les ciments dentaires à forte adhérence et bonne durabilité, adaptés à une fixation à long terme, sont recommandés pour assurer une fixation stable.
   2. Appliquez une fine couche de ciment dentaire sur la surface exposée du crâne et les tissus environnants pour la protection, en laissant la zone désignée pour la fenêtre de défrichement non recouverte.
      REMARQUE : Après avoir mélangé les composants en poudre et liquide du ciment dentaire à un rapport de volume de 1:1, attendez environ 10 secondes que le ciment adhère à la pointe d’un cure-dent avant l’application. Cela réduit sa fluidité et améliore la tenue de route. Lors de l’application, appliquez le ciment depuis la périphérie vers la fenêtre de dégagement désignée, et gardez la zone de la fenêtre complètement dégagée de ciment. La région dégagée est définie par la limite du scellant dentaire (ciment dentaire et matériau doux) à la surface du crâne. Par conséquent, sa taille peut être ajustée, mais elle est limitée par les sutures crâniennes ou la taille du chapeau. Pour une application courante dans un hémisphère, la région dégagée mesure généralement ~3 à 5 mm de diamètre.
   3. Fixez une petite plaque frontale en titane (pour fixation sur un support personnalisé lors de l’imagerie ultérieure) au crâne à l’aide de ciment dentaire.
      REMARQUE : Différents modèles de plaques de tête peuvent être utilisés pour la fixation de la tête. Dans cette étude, des plaques de tête commercialement disponibles ainsi que des plaques de titane à deux trous personnalisées ont été utilisées avec succès. Quel que soit le design, la plaque frontale doit offrir une stabilité mécanique suffisante pour l’imagerie ultérieure et ne doit pas obstruer la fenêtre de dégagement/imagerie prévue.

4. Création d’une fenêtre HOTS

1. Scellez le crâne avec un matériau de doublure dentaire auto-durcissement (Figure 1Bc)
   1. Après que le ciment dentaire a complètement durci pendant environ 5 minutes, couvrez la couche de ciment, à l’exception de la zone de la fenêtre de dégagement, d’une fine couche de matériau doux auto-durcisseur pour former un joint continu sur le crâne.
      REMARQUE : Le matériau doux, le doublure souple améliore l’étanchéité et réduit les fuites lors d’une exposition prolongée aux réactifs de dégagement.
   2. Façonnez le matériau doux auto-durcisseur du liner de façon fluide autour du bord prévu de la fenêtre de dégagement, créant ainsi une surface d’étanchéité plate pour le bouchon.
2. Montage du bouchon (Figure 1Bd)
   1. Découpez la tête d’une pipette en plastique jetable (polyéthylène, PE) pour créer un petit bouchon cylindrique avec un dessus fermé et un fond ouvert. Le PE présente une bonne stabilité chimique et ne présente aucune dégradation ou réaction visible avec les solutions de dégagement S1 ou S2 pendant la procédure de déblaiement.
      REMARQUE : Le capuchon découpé à partir de la tête d’une ampoule de pipette de transfert de 1 mL mesure généralement ~12 mm de diamètre et ~10 à 14 mm de hauteur.
   2. Placez le bouchon sur la zone de fenêtre de dégagement désignée et pressez-le doucement sur le matériau souple du doublure.
      REMARQUE : La casquette est plus grande que la zone dégagée, et une partie du crâne sous la casquette qui n’est pas utilisée pour la zone dégagée peut être appliquée avec un scellant dentaire pour protéger le crâne de l’évacuation.
   3. Fixez le bouchon en place avec un matériau de doublure supplémentaire autour de sa base, en veillant à ce que la jonction entre la capsule et le crâne soit parfaitement scellée.
   4. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 26 G pour percer un ou plusieurs petits trous dans la paroi du bouchon afin de servir de ports pour injecter et retirer les solutions de dégagement.
   5. Laissez le matériau doux de la doublure être complètement durci. Vérifiez que le capuchon est bien fixé et qu’aucun espace visible ne reste à l’interface.
   6. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et placez-la dans une cage chaude jusqu’à la récupération complète de l’anesthésie.
      REMARQUE : C’est un point d’arrêt approprié. Effectuez la procédure de nettoyage du crâne après que le ciment dentaire et le matériau mou de la croisière ont complètement durci. Dans notre cabinet, la fenêtre HOTS peut être installée l’après-midi, suivie d’un nettoyage du crâne le lendemain matin, une fois que la souris s’est complètement rétablie de l’opération. Sinon, le dégagement du crâne peut commencer environ 15 minutes après l’installation de la fenêtre HOTS. Lors de l’installation de la fenêtre HOTS, le crâne reste structurellement intact, bien que le périoste soit retiré.

5. Éclaircissement du crâne chez des souris éveillées et insouciantes

REMARQUE : Pendant la phase de dégagement, la souris reste éveillée et se comporte librement dans sa cage d’origine. Utilisez une brève anesthésie isoflurane uniquement pour l’injection en solution et l’échange via le capuchon monté sur la tête.

1. Chargement initial de S1
   1. Placez la souris dans une chambre d’induction et induisez une anesthésie brève contenant 3 à 4 % d’isoflurane dans l’air à un débit de 300 à 500 mL/min jusqu’à ce que la souris devienne immobile. Aucune anesthésie d’entretien n’a été appliquée.
   2. Immobilisez doucement la souris et stabilisez la coiffe montée sur la tête à la main.
   3. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 26 G pour injecter lentement environ 1 mL de S1 dans le bouchon monté sur la tête.
   4. Ramenez la souris dans une cage d’attache et laissez S1 agir sur le crâne pendant 2 heures.
      REMARQUE : Pendant l’incubation S1 et S2, logez la souris individuellement dans une cage standard.
2. Rafraîchissements de la saison 1
   1. À 2 heures après le chargement initial de S1, anesthésiez brièvement la souris à nouveau avec de l’isoflurane.
   2. Aspirez S1 à partir du condensateur à l’aide d’une seringue de 1 mL.
   3. Remplissez le bouchon avec du S1 frais à l’aide d’une seringue de 1 mL.
   4. Ramenez la souris dans la cage et laissez S1 agir encore 2 heures.
   5. Répétez les étapes 5.2.1–5.2.4 à 4 heures après le chargement initial pour effectuer un second remplacement de S1.
   6. Après le second remplacement, laissez S1 continuer à agir jusqu’à ce qu’un temps d’exposition total de 6 h soit atteint.
      REMARQUE : Ce protocole (1 mL S1 pour 6 heures) est optimisé pour des souris âgées de 6 semaines (~20 g). Pour les animaux plus âgés avec un crâne plus épais, le temps d’incubation de S1 peut être progressivement prolongé. Tout ajustement doit être accompagné d’un suivi attentif du bien-être animal et d’une qualité d’imagerie finale afin d’éviter un ramollissement excessif du crâne.
3. Application de S2
   1. Après 6 heures de traitement S1, anesthésiez brièvement la souris avec de l’isoflurane.
   2. Aspirez S1 du condensateur avec une seringue de 1 mL et remplacez-la par 0,7 mL de S2.
   3. Ramenez la souris dans la cage et laissez S2 agir sur le crâne pendant 1 heure pour renforcer la transparence et assurer une correspondance de l’indice de réfraction.
      REMARQUE : Dans ces conditions, la phase combinée de déminage S1 et S2 est généralement achevée en 7 h (6 h S1 + 1 h S2). Le nettoyage réussi est indiqué par une surface du crâne visiblement transparente sans saignement. Le crâne peut devenir légèrement ramolli après le dégagement ; lorsqu’elle est doucement touchée avec des pinces fines, elle doit montrer une légère souplesse mais rester structurellement intacte. Évitez une pression excessive sur la surface du crâne.

6. Préparation à l’imagerie

1. Anesthésie et fixation de la tête pour l’imagerie
   1. À la fin de l’incubation de S2, anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (p/v) à 150–200 μL pour 20 g de poids corporel.
   2. Confirmez une anesthésie adéquate à l’aide du test du réflexe pincé des orteils.
   3. Fixez la tête de la souris en vissant la plaque de tête en titane à un support de tête conçu sur mesure.
   4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter la sécheresse lors de l’imagerie.
   5. Maintenez la température corporelle à ~37 °C à l’aide d’une bouillotte.
2. Exposant la surface du crâne dégagée (Figure 1Be,Bf)
   1. Aspirez la solution de S2 du bouchon à l’aide d’une seringue.
   2. Découpez soigneusement le bouchon en plastique avec des ciseaux fins et retirez-le à l’aide de pinces, évitant ainsi une force excessive sur le crâne.
   3. Décollez doucement le matériau doux, le doublure autour de la fenêtre de clairière pour exposer complètement la région dégagée du crâne.
   4. Appliquez une petite goutte de solution S2 directement sur le crâne dégagé pour servir de milieu d’immersion correspondant à l’indice de réfraction lors de l’imagerie.
      REMARQUE : Des objectifs d’immersion dans l’eau standard ont été utilisés dans cette étude, incluant un objectif 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) et un objectif 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Lorsque vous utilisez S2 comme milieu d’immersion, ajustez le collier de correction de l’objectif, si disponible, au réglage approprié pour l’indice de réfraction de S2 afin de réduire les aberrations sphériques. Dans les expériences ici, le crâne dégagé a maintenu une clarté optique suffisante pendant environ 2 heures d’imagerie à deux photons, sans dégradation évidente de la qualité de l’image lors de l’observation de la colonne dendritique. Après environ 2 jours, une nouvelle autorisation était nécessaire pour des examens d’imagerie supplémentaires, et le temps de réautorisation était considérablement plus court que celui initial, permettant une imagerie répétée efficace sur le même animal.
3. Imagerie éveillée à tête fixe (optionnelle)
   REMARQUE : Pour l’imagerie éveillée, habituez la souris à la fixation de la tête avant l’expérience. Anesthésiez brièvement la souris avec de l’isoflurane, puis fixez la plaque frontale implantée au support pendant 15 à 30 minutes par séance, et répétez cela pendant 2 à 3 jours.
   1. Utilisez une anesthésie à l’isoflurane brève pour faciliter la manipulation. Fixez uniquement la plaque de tête implantée au support, permettant au corps de se déplacer librement sur la roue ou la plateforme.
   2. Suivez les étapes 6.2.1–6.2.4 pour exposer la surface du crâne dégagée et appliquez S2 avant l’imagerie.

7. Rétablissement

1. Après l’imagerie, aspirez doucement et retirez toute solution résiduelle de S2 à la surface du crâne.
2. Rincez la région du crâne dégagée plusieurs fois avec du sérum physiologique tamponné phosphaté (PBS) pour favoriser la restauration progressive de l’état opaque naturel du crâne.
3. Séchez doucement le liquide résiduel du crâne et des tissus environnants avec des cotons-tigeons stériles, évitant ainsi les dommages mécaniques à l’os.
4. Si l’animal est maintenu en vie pour des expériences ultérieures, appliquez une couche du scellant biocompatible Kwik-Cast (WPI) sur la fenêtre du crâne pour protéger l’os pendant la période de survie.
5. Laissez la couche protectrice complètement durcir.
6. Détachez la souris du porte-tête et placez-la dans une cage chaude. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli de l’anesthésie, puis ramenez-le dans sa cage d’origine.

Résultats

En suivant le protocole, la fenêtre du crâne optiquement transparent montée sur la tête (HOTS) permet l’imagerie transcrânienne profonde à deux photons chez la souris adulte tout en préservant l’intégrité du crâne. Une préparation réussie s’explique par deux résultats clés : (1) la vascularisation corticale devient clairement visible à travers le crâne lors du dégagement (Figure 1Bf), et (2) le crâne dégagé présente une légère indentation so...

Discussion

La méthode HOTS utilise une fenêtre de crâne optiquement transparent (HOTS) montée sur la tête qui combine un bouchon contenant des réactifs de nettoyage avec une procédure en deux étapes pour améliorer la transparence crânienne chez les souris adultes tout en préservant l’intégrité du crâne. Selon le protocole standard (6 h chez S1 et 1 h chez S2 chez les souris de 6 semaines), la fenêtre résultante permettait de manière fiable l’imagerie transcrânienne profonde à deux photons et permet...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL de pipette jetable	Beijing Biotopped  ; Science   ; & Technologie & nbsp ; Co., Ltd.	N/A
Ciment dentaire	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannose	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
Isoflurane	Propulsion	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Un scellant biocompatible
NaOH	Macklin	S832169
Auto-durcissement   ;   ;   ;   ; dentaire & nbsp ;   ;   ;   ;   ; Matériau doux, liner,	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Pentobarbital sodique	Biopike	N/A
Appareil stéréotaxique	Propulsion	N/A
Seringue jetable stérile	Minank	N/A	1 mL ; Aiguille 26 G
Sulfolane	Macklin	S817950
Souris Thy1-GFP-M		N/A	Fourni   ; par le Professeur Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  ; souris	Laboratoire Jackson
Préadolescent 20	Sigma-Vetec	V900548
Objectif d’immersion dans l’eau & nbsp ;	Nikon	N25X-APO-MP	25× ;/NA 1.1 objectif   ;
Objectif d’immersion dans l’eau & nbsp ;	Nikon	N16XLWD-PF	16 fois ; /NA 0,8 objectif ;