Imagerie sans marqueur en temps réel et analyse quantitative de la morphodynamique des macrophages à l’aide de la tomographie par diffraction optique

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail basé sur la tomographie par diffraction optique sans marque-t-eau pour l’imagerie en temps réel et l’analyse quantitative de la morphodynamique des macrophages. La méthode permet un suivi continu de la morphologie et de la migration d’une seule cellule, fournissant des mesures résolues dans le temps de la surface projetée, du périmètre et de la vitesse moyenne de migration lors de l’imagerie à long terme des cellules vivantes.

Résumé

Cette étude établit un flux de travail basé sur la tomographie par diffraction optique (ODT) sans marqueur pour l’imagerie et l’analyse des cellules vivantes afin d’observer les changements morphologiques dépendants du temps dans les macrophages. La méthode permet un enregistrement continu de la morphologie et des mouvements des cellules uniques sur de longues périodes dans des conditions environnementales stables et permet l’extraction de paramètres quantitatifs, notamment la surface projetée, le périmètre et la vitesse moyenne de migration. Ce flux de travail offre une approche pratique pour capturer les comportements cellulaires dynamiques au niveau de la cellule unique sans marquage exogène. En utilisant les macrophages RAW264.7 comme modèle, l’imagerie en accéléré a été réalisée sous stimulation par lipopolysaccharides avec prétraitement de la baicaline afin de capter les changements cellulaires dynamiques sous différentes conditions. Des cellules représentatives ont été sélectionnées pour le suivi et l’analyse quantitative. Les résultats montrent que ce flux de travail permet un suivi stable à long terme d’une seule cellule et reflète les changements temporels de morphologie et de motilité cellulaires. Cette approche offre une méthode sans étiquetage pour observer les comportements cellulaires dynamiques en réponse à différents stimuli et peut servir de complément utile aux tests conventionnels basés sur les objectifs de finalisation. Il peut également être applicable à d’autres types cellulaires adhérents pour des études de morphodynamique cellulaire.

Introduction

Les macrophages jouent un rôle central dans les réponses immunitaires innées et l’homéostasie tissulaire, et leurs états fonctionnels peuvent évoluer dynamiquement en réponse aux stimuli microenvironnementaux. Traditionnellement, les macrophages ont été décrits comme adoptant des phénotypes pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires/associés à la^{réparation 1,2}. Cependant, des preuves croissantes suggèrent que l’activation des macrophages est un processus continu et plastique plutôt qu’un état binaire discret3,4. Sous différents stimuli, les macrophages subissent des changements graduels au fil du temps, accompagnés de modifications de la morphologie cellulaire et du comportement^{migratoire 5}. Ainsi, la caractérisation résolue dans le temps des changements morphologiques et migratoires au niveau de la cellule unique constitue une approche importante pour étudier les réponses cellulaires dynamiques.

Les approches actuelles pour étudier les états des macrophages reposent principalement sur l’immunocoloration, la cytométrie en flux et les analyses transcriptomiques ou^{protéomiques 6}. Ces méthodes sont généralement basées sur des échantillons fixes ou des points temporels discrets, ce qui limite leur capacité à suivre des changements continus dans la même cellule en conditions^{de vie 7}. L’imagerie cellulaire vivante basée sur la fluorescence permet une observation dynamique mais peut être affectée par la phototoxicité et le photoblanchiment lors d’expériences à long^{terme 8,9}. La tomographie par diffraction optique (ODT) est une technique d’imagerie sans marque qui reconstruit la distribution tridimensionnelle de l’indice de réfraction des cellules afin de fournir des informations structurelles^{quantitatives 10}. Comme elle ne nécessite pas de marquage exogène, la TDO convient à l’imagerie à long terme des cellules vivantes et réduit les perturbations du comportement cellulaire. Ces dernières années, l’ODT a été appliquée à des études dynamiques sur divers modèles^{cellulaires 11}, les études précédentes se concentrant principalement sur la capacité d’imagerie et la caractérisation structurelle. En revanche, la présente étude établit un flux de travail standardisé et sans étiquetage pour l’analyse à long terme et résolue dans le temps à cellules uniques de la morphodynamique des macrophages sous une condition définie de stimulation in vitro.

Le flux de travail est démontré à l’aide d’un modèle macrophage in vitro RAW264.7 avec stimulation des lipopolysaccharides (LPS) et un prétraitement à la baïcaline (BAI). BAI a été utilisé comme modulateur expérimental représentatif pour établir une condition définie permettant de démontrer le flux de travail. L’imagerie continue permet d’extraire des paramètres quantitatifs de cellules uniques, notamment la surface projetée, le périmètre et la vitesse moyenne de migration, permettant une caractérisation temporelle des changements morphologiques et comportementaux. Cette approche vise à fournir une analyse descriptive des changements phénotypiques dynamiques plutôt qu’à définir des états fonctionnels ou la polarisation, et peut servir de méthode complémentaire aux tests basés sur les points d’extrémité en fournissant des informations temporelles. Le flux de travail est validé dans ce système modèle et peut être applicable à d’autres types de cellules adhérentes.

Protocole

1. Culture des macrophages

ATTENTION : Effectuez toutes les procédures dans un cabinet de biosécurité en portant des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire.

1. Préparez un milieu de culture complet (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute glycémie, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine).
2. Décongeler un flacon de cellules macrophages RAW264,7 dans un bain-marie à 37 °C pendant moins d'1 minute.
3. Transférer la suspension cellulaire en DMEM à haute glycémie, complétés avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.
4. Centrifugeuse à 300 × g pendant 5 minutes.
5. Jetez le surnageant.
6. Resuspendez les cellules dans un milieu complet et frais.
7. Faites les graines dans des plats de 60 mm à 2–5 × 10⁵ cellules par plat.
8. Incubez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂.
9. Ne changez pas de milieu dans les 12 à 24 heures après la décongélation.
10. Remplacez le substrat tous les 2 à 3 jours.
11. Surveillez la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope inversé.
12. Cellules du passage à 80–90 % de confluence par pipetage doux.
    REMARQUE : Évitez d’utiliser la trypsine. Utilisez les cellules aux passages 6 à 18. Sélectionnez des cellules avec une morphologie uniforme et sans vacuolisation pour les expériences. La lignée cellulaire a été authentifiée par un profilage STR et soumise à des tests de contrôle qualité. Des rapports détaillés et un résumé en anglais sont fournis dans les Dossiers Supplémentaires.

2. Traitement cellulaire

1. Collectez les cellules en phase de croissance logarithmique par pipetage doux.
2. Resuspendre les cellules dans un milieu complet.
3. Mesurez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules.
4. Ajustez la densité cellulaire à 4 × 10⁴ cellules/mL.
5. Semez 2 mL de suspension cellulaire dans chaque bol de 35 mm.
6. Attribuer les antennes à deux groupes : (i) groupe LPS, (ii) groupe BAI + LPS.
7. Incubez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 12 à 16 heures.
8. Préparez une solution BAI de 50 mM en DMSO. Conservez la solution d’origine BAI à −20 °C.
9. Ajouter le BAI au groupe BAI + LPS à une concentration finale de 100 μM. Diluer la solution de stock BAI directement dans un milieu de culture pour obtenir la concentration finale de travail.
10. Ajoutez un volume égal de DMSO au groupe LPS.
11. Préparez la solution LPS (1 mg/mL) dans un milieu complet.
12. Ajoutez la LPS aux deux groupes jusqu’à une concentration finale de 1 μg/mL. Diluez la solution de stock LPS directement dans un milieu de culture pour obtenir la concentration finale de travail.
13. Procédez immédiatement à l’imagerie et ne changez pas de support pendant l’imagerie.

3. Acquisition par tomographie par diffraction optique

1. Allumez le système d’imagerie ODT et lancez le module de contrôle environnemental.
2. Réglez la température de la scène à 37 °C.
3. Réglez la concentration de CO₂ à 5 %.
4. Laissez le système s’équilibrer pendant au moins 20 minutes.
5. Ouvre le logiciel d’acquisition.
6. Placez la gamelle de culture sur l’étage d’imagerie.
7. Utilisez un objectif 60x (NA = 1,42) pour localiser les cellules.
8. Sélectionnez des cellules isolées avec des limites claires pour l’imagerie.
9. Réglez l’intervalle d’imagerie à 8 minutes.
10. Réglez le nombre total d’images à 181.
11. Activez la fonction d’autofocus pour maintenir la mise au point lors de l’imagerie en accéléré.
12. Commencez l’acquisition en accéléré.
13. Surveillez la stabilité du système lors de l’acquisition.
    REMARQUE : La stabilisation autofocus a été appliquée tout au long de l’expérience pour minimiser la dérive focale.

4. Reconstruction d’image et analyse quantitative

1. Après l’acquisition de l’image, le logiciel effectue automatiquement la reconstruction d’image.
2. En utilisant l’algorithme standard intégré.
3. Attendez que la barre de progression soit terminée.
4. Ouvre le logiciel d’analyse (Intellyseg, v2.1.0).
5. Importez le jeu de données brut en sélectionnant Importer les données brutes.
6. Je navigue vers le dossier cible.
7. Choisissez le fichier cible et importez le jeu de données.
8. Cliquez sur « Cellule » pour effectuer une segmentation automatique en utilisant des paramètres cohérents sur les ensembles^{de données 13}.
9. Sélectionnez les cellules selon les critères suivants : (i) aucun chevauchement avec les cellules voisines, (ii) ne pas être en contact avec les frontières de l’image, (iii) être continuellement traçable tout au long de la série chronologique.
10. Sélectionnez un nombre fixe de cellules (n = 8) par champ de vision pour une analyse cohérente entre les ensembles de données.
11. Ouvrez le module « Suivi à long terme ».
12. Entrez le cadre de départ et le cadre de fin.
13. Cliquez sur « Suivre » pour lancer le suivi, qui est basé sur la cohérence de la position des cellules entre les¹⁴ trames consécutives.
14. Corrigez manuellement les erreurs de suivi si nécessaire pour assurer la continuité de la trajectoire : (i) Cliquez droit sur les mauvais masques et sélectionnez « Supprimer l’élément », (ii) Ouvrez « Segmentation manuelle », (iii) Sélectionnez « Cellule » et cliquez sur « Ajouter », (iv) Utilisez « Cliquer » ou « Boîte » pour ajouter les bons masques.
15. Cliquez sur « Exporter », puis sélectionnez « Export de données ».
16. Sélectionnez « Export vidéo » et sélectionnez les éléments de sortie.
17. Entrez les images de début et de fin.
18. Sélectionnez le chemin de sauvegarde et le format du fichier.
19. Cliquez sur « OK » pour exporter la vidéo.
20. Cliquez sur « Exporter », puis sélectionnez « Système de graphiques ».
21. Sélectionnez « Tableau des pistes ».
22. Choisissez « Cellule » comme catégorie de segmentation.
23. Entrez dans la plage de trames de suivi.
24. Sélectionnez les paramètres de sortie (par exemple, Zone, Périmètre).
25. Cliquez sur « Exporter image ou Excel » et enregistrez le fichier.
26. Calculez la vitesse moyenne de migration (μm/h) pour chaque cellule en fonction du déplacement du centroïde sur l’ensemble de la série chronologique.

5. Présentation des données

1. Les mesures quantitatives sont présentées de manière descriptive. Aucune inférence statistique n’a été réalisée. Chaque groupe de traitement comprenait cinq échantillons indépendants.
   Un aperçu du flux de travail expérimental est présenté à la Figure 1. Les principaux réactifs, instruments et logiciels sont listés dans le tableau des matériaux. Les conditions d’imagerie sont résumées dans le tableau 1.

Résultats

Pour évaluer la performance du flux de travail basé sur l’ODT, une imagerie en accéléré a été réalisée pour deux groupes de traitement (LPS et BAI + LPS), avec cinq échantillons indépendants par groupe. Tous les échantillons ont été prélevés dans des conditions d’imagerie identiques. En raison de la charge de travail élevée associée au suivi à long terme d’une seule cellule et à l’analyse quantitative, un échantillon représentatif de chaque groupe a été sélectionné pour l’analyse et la visualisation d’une seule cellule. ...

Discussion

Cette étude établit un flux de travail basé sur ODT sans étiquette pour l’imagerie continue et l’analyse quantitative de la morphodynamique des macrophages au niveau unicellulaire. Cette approche permet de mesurer en résolution temporelle de la surface projetée, du périmètre et de la vitesse moyenne de migration lors de l’imagerie à long terme de cellules vivantes. La densité d’ensemencement des cellules est un facteur clé influençant la segmentation et la performance de suivi. Une haute...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	Utilisé pour l'imagerie des cellules vivantes sans marquage
Logiciel d'acquisition	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	Utilisé pour l'acquisition d'images
Logiciel d'analyse	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	Utilisé pour la reconstruction, la segmentation et le suivi des images
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	Ligne cellulaire de macrophages murins utilisée pour des expériences de polarisation et d'imagerie in vitro.
Baicalin (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	Utilisé pour le prétraitement cellulaire
Lipopolysaccharide (LPS)	Solarbio	L8880	Utilisé pour stimuler les macrophages
Milieu DMEM	Gibco	C11995500BT	Milieu de culture cellulaire
Sérum bovin fœtal	Procell	164210	Supplément pour la culture cellulaire
Pénicilline–Streptomycine (100x)	Procell	PB180120	Antibiotiques pour la culture cellulaire
Plaques de culture de 60 mm	Corning	CLS430166	Utilisé pour la culture cellulaire
Plaques à fond en verre de 35 mm	Cellvis	D35-10-1.5-N	Utilisé pour l'imagerie ODT
Microscope inversé	OLYMPUS	CKX53	Utilisé pour l'observation et la surveillance de routine des cellules pendant la culture.
Compteur de cellules	RWD Life Science	C100	Utilisé pour la détermination de la densité cellulaire