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Article de recherche
Le lactone sesquiterpène XTT atténue efficacement les réponses inflammatoires induites par les lipopolysaccharides (LPS) chez les macrophages. XTT cible IKKα/β pour inhiber la signalisation NF-κB sans affecter l’activation de MAPK, exerçant ainsi de puissants effets anti-inflammatoires in vitro.
La dysrégulation de la cascade du facteur nucléaire-κB (NF-κB) est étroitement liée à la progression des troubles inflammatoires. Les kinases IκB (IKK) sont bien établies comme modulatrices centrales de l’activité du NF-κB, ce qui en fait des candidats thérapeutiques attrayants pour traiter les pathologies inflammatoires. Le lactone sesquiterpène 1β-hydroxyle-5α-chloro-8-épi-xanthatine (XTT) a été documenté pour exercer de puissants effets anticancéreux. Cependant, son activité anti-inflammatoire et ses mécanismes moléculaires sous-jacents restent incertains. Dans ce travail, la XTT a nettement supprimé la synthèse de l’oxyde nitrique (NO) et de la prostaglandine E2 (PGE2) dans les macrophages RAW264.7 activés par lipopolysaccharides (LPS). La XTT a également considérablement réduit les niveaux d’ARNm indusible déclenchés par le LPS tels que la synthase d’oxyde nitrique inducible (iNOS), la cyclooxygénase-2 (COX2), le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l’interleukine-1β (IL-1β) et l’interleukine-6 (IL-6). De plus, le XTT a sous-régulé les niveaux de protéines d’iNOS et de COX2 provoqués par le traitement LPS. Au niveau mécanistique, la XTT n’a pas modifié de manière significative l’activité de la cascade de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK). Inversement, XTT a fortement bloqué la phosphorylation et la dégradation inhibitrices de κBα (IκBα) déclenchées par le LPS en interagissant avec IKKα/β, altération ainsi la translocation nucléaire NF-κB. Pris ensemble, ces données montrent que la XTT provoque des effets anti-inflammatoires robustes in vitro en ciblant IKKα/β et en bloquant la signalisation NF-κB. Ces résultats suggèrent que le XTT pourrait servir de composé principal prometteur pour le développement d’agents anti-inflammatoires. D’autres études biochimiques et in vivo sont nécessaires pour valider l’inhibition directe de l’IKKα/β et le potentiel thérapeutique.
L’inflammation est un processus biologique strictement régulé qui permet aux organismes de répondre à une infection, à des lésions tissulaires et à d’autres défis environnementaux1. Bien que les réponses inflammatoires aiguës soient généralement protectrices, l’activation persistante des voies inflammatoires peut perturber l’homéostasie tissulaire et contribuer à l’apparition et à la progression de maladies chroniques, notamment la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) et la polyarthrite rhumatoïde (PR)2. De nombreux réseaux de signalisation intracellulaire participent à la régulation inflammatoire, parmi lesquels la voie du facteur nucléaire-κB (NF-κB) est l’une des plusétudiées 3.
Les membres de la famille NF-κB, dont p50, p52, p65 (RelA), RelB et c-Rel, fonctionnent comme des facteurs de transcription dimérique qui régulent l’expression des gènes impliqués dans l’immunité et l’inflammation 4,5. Dans des conditions basales, les dimères NF-κB restent inactifs dans le cytoplasme grâce à l’association avec un inhibiteur des protéines κB (IκB). Après stimulation par des médiateurs inflammatoires tels que le lipopolysaccharide (LPS) ou le facteur de nécrose tumeur-α (TNF-α), le complexe IκB kinase (IKK) s’active et phosphoryle IκBα, entraînant son ubiquitination et sa dégradation. Ce processus permet aux complexes NF-κB de s’accumuler dans le noyau et d’initier la transcription des médiateurs inflammatoires et descytokines 6. Parce qu’une activation excessive ou soutenue de la NF-κB est étroitement associée à diverses maladies inflammatoires et auto-immunes, une intervention pharmacologique au niveau de la signalisation IKK a suscité un intérêtconsidérable 7,8,9.
Les produits naturels ont longtemps été des sources vitales pour le développement de médicaments, y compris les thérapeutiquesanti-inflammatoires 10. 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-épi-xanthatine (XTT) est une lactone sesquiterpène isolée de Xanthium sibiricum 11,12. Des recherches antérieures ont montré que la XTT supprime la prolifération cellulaire et déclenche l’apoptose chez les cellules du carcinome hépatocellulaire humain via l’activation de l’ERK/p38 MAPK médiée par ROS et l’inhibition de JAK2/STAT3 causée par la déplétion duglutathion 13. Cependant, le potentiel anti-inflammatoire de la XTT et ses mécanismes moléculaires associés sont encore mal compris.
Les résultats actuels indiquent que le XTT présente des effets anti-inflammatoires importants in vitro. Les études mécanistiques indiquent que la XTT interagit avec l’IKKα/β et supprime la signalisation NF-κB, inhibant ainsi les réponses inflammatoires dans les macrophages activés. Ces résultats suggèrent que le XTT pourrait représenter un composé principal prometteur pour le développement d’agents anti-inflammatoires.
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Cette étude ne concernait que des lignées cellulaires commerciales établies et n’incluait pas de participants humains, d’échantillons cliniques ou d’expériences animales. Par conséquent, l’approbation éthique institutionnelle et le consentement éclairé n’étaient pas requis. Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives de sécurité des laboratoires institutionnels. Les réactifs dangereux étaient manipulés dans des hottes désignées, avec l’utilisation d’équipements de protection individuelle (EPI) appropriés. Les déchets chimiques et biologiques étaient éliminés conformément aux règlements institutionnels. Les produits chimiques, kits et réactifs utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Culture cellulaire
Les macrophages murins RAW264.7, les cellules de carcinome cervical humain HeLa et HEK293T cellules embryonnaires rénales humaines ont été achetés auprès de la Banque cellulaire de l’Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Toutes les cellules ont été maintenues dans le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. L’environnement de culture était fixé à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité saturée.
2. Analyse de viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été évaluée via un test Cell Counting Kit-8 (CCK-8). 264,7 cellules RAW264,7 (2,5 × 104 cellules/puits) ont été placées en plaques de 96 puits et cultivées toute la nuit à 37 °C. Les cellules ont ensuite été traitées avec des concentrations variables de XTT pendant 24 heures, avec ou sans LPS (0,5 μg/mL). La concentration de LPS et la durée du traitement ont été optimisées lors d’expériences préliminaires pour induire des réponses inflammatoires modérées sans provoquer de cytotoxicité significative. Par la suite, 10 μL de réactif CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été maintenue à 37 °C pendant 2 heures. L’absorbance a été mesurée à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
3. Détermination des niveaux de NO et PGE₂ dans le milieu de culture cellulaire
Les cellules RAW264,7 ont été placées en plaques à 24 puits à une densité de 2,5 × 10 cellulesde 5 puits et cultivées toute la nuit à 37 °C. Les cellules ont été prétraitées avec XTT pendant 2 heures avant la stimulation LPS ou TNF-α (15 ng/mL) pendant 24 heures supplémentaires. La période pré-traitement de 2 h a été choisie afin de permettre une interaction adéquate entre la XTT et les cibles cellulaires avant le défi inflammatoire. Les niveaux d’oxyde nitrique (NO) et de prostaglandine E₂ (PGE₂) dans le milieu de culture ont été quantifiés selon les protocoles du fabricant.
4. Réaction en chaîne quantitative en temps réel par polymérase (qRT-PCR)
264,7 cellules RAW264,7 (2 × 106 cellules) ont été placées en plaques à 6 puits pendant la nuit et prétraitées avec diverses doses de XTT pendant 2 heures avant le test LPS (0,5 μg/mL) pendant 24 heures. L’ARN total a été isolé à l’aide d’un réactif TRIzol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre, et des échantillons avec des rapports A260/A280 >1,8 ont été utilisés pour les analyses en aval.
L’ARN total (2 μg) a été rétrotranscrit en ADNc dans un volume de réaction final de 20 μL à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant la chimie verte SYBR sur un système de détection PCR en temps réel. Les séquences d’amorces étaient les suivantes :
iNOS avant : 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS marche arrière : 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 avant : 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 marche arrière : 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β avant : 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β inverse : 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 avant : 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 revers : 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α avant : 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α revers : 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH avant : 5′-TGC ACC ACC TGC TGC TTA GC-3′
GAPDH revers : 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
La procédure d’amplification par PCR s’est déroulée ainsi : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 minutes, suivie de 39 cycles à 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 30 s. Les niveaux relatifs d’expression génique ont été calculés à l’aide de la méthode 2−ΔΔCt avec le GAPDH comme contrôle interne.
5. Plaque western
Après traitement, les cellules RAW264,7 ont été homogénéisées dans un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Ces inhibiteurs étaient préparés frais immédiatement avant utilisation afin de prévenir la dégradation et la déphosphorylation des protéines. Les niveaux totaux de protéines ont été quantifiés à l’aide d’un kit de test BCA. Des quantités égales de protéines ont été séparées par électrophorèse en gel de dodécyle sulfate de sodium et polyacrylamide à 10 % et transférées sur des membranes de nitrocellulose. Après le transfert, les membranes ont été incubées avec 5 % de lait écrémé préparé dans un TBST contenant Tween-20 (TBST) pour le blocage, puis sondées avec des anticorps primaires (dilution 1:1 000) pendant la nuit à 4 °C. Les membranes ont ensuite été sondées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1:5 000) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été détectées à l’aide d’un système de détection de chimiluminescence, et les intensités des bandes ont été analysées par quantification densitométrique.
6. Dosage d’immunofluorescence
Les cellules HeLa ont été ensemencées en plaques à 6 puits et pré-traitées avec du XTT (8 μM) pendant 4 h avant la stimulation du TNF-α (15 ng/mL) pendant 30 minutes. Cette période de 4 heures avant l’incubation a été choisie pour maximiser l’engagement de la cible avant l’activation du NF-κB. Les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 15 minutes et perméabilisées avec 0,25 % de Triton X-100 pendant 15 minutes à température ambiante. Après un blocage avec 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 10 % de sérum de chèvre dilués dans du sérum tamponné phosphate (PBS), les cellules ont été incubées avec un anticorps primaire anti-p65 (dilution 1:250) pendant la nuit à 4 °C, suivies d’une sonde avec un anticorps secondaire conjugué au TRITC (dilution 1:1 000) pendant 1 h à température ambiante. Les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI (0,5 μg/mL) pendant 5 minutes dans l’obscurité. Des images de fluorescence ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les cellules HeLa ont été sélectionnées car leur important rapport cytoplasme/noyau facilite la visualisation de la translocation nucléaire p65.
7. Fractionnement cytoplasmique et nucléaire
Les cellules HeLa ont été pré-incubées avec du XTT pendant 4 heures puis stimulées avec du TNF-α (15 ng/mL) pendant 30 minutes. Les cellules ont été collectées, rincées avec du PBS froid, puis traitées pour l’extraction de protéines cytoplasmiques et nucléaires à l’aide d’un kit commercial d’extraction de protéines nucléaires et cytoplasmiques selon les instructions du fabricant. Toutes les interventions ont été réalisées sur la glace afin de préserver l’intégrité des protéines.
8. Essai de décalage thermique cellulaire (CETSA)
CETSA s’est déroulé comme décritprécédemment le 14. Environ 1 × 107 cellules HeLa ont été collectées et resuspendues dans 500 μL de PBS froid contenant des inhibiteurs de protéases, puis lysées via trois cycles de gel-dégel dans de l’azote liquide. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 20 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Les surnatants résultants étaient aliquotés en deux groupes également et traités soit avec du XTT (100 μM), soit avec du DMSO pendant 1 h à température ambiante. XTT (100 μM) a été appliqué pour améliorer la sensibilité à la détection dans les expériences CETSA. Les échantillons étaient ensuite aliquotés en sept tubes et chauffés à la température indiquée pendant 3 minutes, suivis d’une incubation à température ambiante pendant 3 minutes supplémentaires. Des fractions de protéines solubles ont été collectées pour une analyse d’immunoblottage.
9. Amarrage moléculaire
L’analyse du docking moléculaire a été réalisée comme décritprécédemment 14. Les structures cristallines d’IKKβ (IDs PDB : 3BRT et 4KIK) ont été extraites de la Protein Data Bank (PDB). Les structures protéiques ont été prétraitées avec PyMOL (version 2.3.4) pour éliminer les molécules d’eau, les ligands originaux et les impuretés, suivies d’une addition d’atomes d’hydrogène. Les charges de Gasteiger ont été calculées, et les poches actives identifiées à l’aide d’AutoDock Tools (version 1.5.6). Les structures protéiques étaient ensuite stockées au format PDBQT.
La structure XTT a été générée dans Chem3D (version 15.1) et optimisée via la minimisation d’énergie. Le docking semi-flexible a été réalisé avec AutoDock Vina (version 1.1.2). Des boîtes de grille ont été construites pour couvrir entièrement les poches actives, tandis que tous les autres paramètres restaient aux réglages par défaut. Les poses d’amarrage avec les énergies de liaison les plus faibles et les conformations les plus stables ont été sélectionnées pour analyse. Des énergies de liaison inférieures à −5 kcal/mol étaient considérées comme indicatives d’une forte affinité de liaison selon les critères publiés. PyMOL a également été utilisé pour visualiser les modes de liaison et évaluer les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, les interactions de van der Waals et les sites potentiels de liaison.
10. Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 5.0. Les données sont présentées comme la moyenne ± l’erreur standard de la moyenne (MEB) issues de trois expériences indépendantes. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test post hoc de Dunnett. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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XTT inhibait la production de NO et PGE₂ dans les macrophages RAW264.7 stimulés par LPS ou TNF-α
Pour déterminer si les effets anti-inflammatoires de la XTT étaient indépendants de la cytotoxicité, la viabilité cellulaire de RAW264.7 a été évaluée après un traitement par XTT en présence ou en absence de LPS. Aucune réduction appréciable de la viabilité cellulaire n’a été détectée à des concentrations allant de 0,5 à 8 μM, indiquant que le composé était bien toléré dan...
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Les lactones sesquiterpènes sont une classe de produits naturels aux diverses activités pharmacologiques, notamment des effets antiseptiques, anti-inflammatoires, antipyrétiques etdétoxifiants 15. Des études antérieures ont montré que le XTT, un lactone sesquiterpène de type xanthanolide isolé de Xanthium sibiricum, présente de puissants effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques dans les cellules du carcinome hépatocellulairehumain 13...
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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82004031), le projet de recherche sur l’Administration provinciale du Sichuan de la médecine traditionnelle chinoise (n° 2024MS566) et le Programme national clé de recherche et développement de Chine (n° 2023YFC3504402).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | se lie spécifiquement à l'anticorps primaire |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | reconnaît spécifiquement la protéine sous-unité NF-κB p65 |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorber les molécules de protéine |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | composés monomériques naturels | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcrire |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | quantification totale des protéines |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | mesure de la viabilité cellulaire |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquérir et traiter les signaux de luminescence |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubiliser les composés |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | acquisition et analyse d'images |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | température d'apparillage de gradient |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | quantification du NO |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | cellules dérivées de l'homme |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | cytokines pro-inflammatoires |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | établir des modèles inflammatoires |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | cellules dérivées de souris |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | séparer les protéines cytoplasmiques et nucléaires |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | inhibiteur MEK |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | détécter le niveau de phosphorylation de la protéine ERK |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | inhibiteur IKK spécifique |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | séparation des protéines |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | lyse cellulaire |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | inhibiteur de p38 MAPK |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | inhibiteur de JNK |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | Pour la quantification en temps réel |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | isolement d'ARN total |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |