Cytométrie à flux multicentrique pour la leucémie myéloïde aiguë avec des populations enrichies en cellules souches leucémiques aiguës avec LAIP/DfN et CD34+CD38- enrichi en cellules souches

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail de cytométrie à flux multicentrique pour la quantification mesurable de la maladie résiduelle mesurable par leucémie myéloïde aiguë, utilisant l’analyse immunophénotype/différente de la normale associée à la leucémie (LAIP/DfN) et des populations enrichies en ^{cellules souches} leucémiques définies phénotypiquement.

Résumé

Le suivi de la maladie résiduelle mesurable (MRD) est recommandé pour l’évaluation de la réponse au traitement dans les essais cliniques sur la leucémie myéloïde aiguë (LMA) selon les recommandations ELN 2025. L’objectif de cette étude était de mettre en œuvre un suivi standardisé des patients en utilisant une approche harmonisée de flux MRD dans 30 laboratoires d’hématologie français participant à des essais cliniques sur la LMA. Pour obtenir des résultats comparables, le réseau a établi des recommandations allant des procédures de laboratoire humide aux rapports cliniques. Nous avons conçu un panel à 3 tubes avec des marqueurs communs obligatoires de 8 couleurs par tube, selon les recommandations de l’ELN, afin d’identifier les schémas immunophénotypiques associés à la leucémie/différents de la normale (LAIP/DfN) dans les cellules en vrac et les populations enrichies en cellules souches leucémiques (LSC) dans la fraction CD34⁺CD38⁻ . Une colonne vertébrale composée de CD34/CD38/CD45/CD117 était utilisée, complétée par des marqueurs de lignée pour le premier tube, des marqueurs associés à la LSC pour le second, et des marqueurs monocytiques et de différenciation pour le troisième tube. Ce panneau peut être utilisé en formats 8, 10 et 12 couleurs et est implémenté sur plusieurs plateformes conventionnelles de cytomètres à débit. Nous proposons des réglages du cytomètre à débit adaptés à chaque plateforme.

L’harmonisation de la sensibilité entre les quatre plateformes a été réalisée à l’aide de billes arc-en-ciel à 8 pics. L’immunocoloration a été réalisée après la lyse de masse. Pour détecter les biais entre les plateformes, l’indice de coloration a été testé à partir d’échantillons de moelle osseuse saine fraîche en parallèle sur les quatre plateformes. Des échantillons réguliers de contrôle de la qualité de la moelle osseuse ont été partagés entre laboratoires pour l’évaluation externe de la qualité humide (EQA) afin de vérifier toutes les étapes du protocole. Enfin, la standardisation de la stratégie d’analyse des données obtenue dans les centres a été évaluée à l’aide d’EQA sec en partageant les fichiers de données MRD FCS. La faisabilité de cette approche multicentrique nécessite l’harmonisation de la sensibilité des instruments et de la préparation des échantillons, ainsi que la formation et la formation systématique des opérateurs analytiques.

Introduction

La maladie résiduelle mesurable (MRD) désigne le petit nombre de cellules leucémiques qui persistent pendant ou après le traitement et qui sont indétectables par morphologie, en particulier dans les cas de rémission complète avec moins de 5 % de blastoblasts dans la moelle osseuse. La surveillance de la MRD est recommandée pour l’évaluation de la réponse au traitement dans les essais cliniques sur la leucémie myéloïde aiguë (LMA) selon les directives ELN 2025¹. Outre les méthodes de biologie moléculaire, notamment la transcriptase inverse PCR (RT-qPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS), la cytométrie à flux multiparamétrique (MFC) est une approche^{couramment utilisée 2}.

Pour obtenir des résultats cohérents sur la MRD, en particulier dans les essais cliniques, deux stratégies sont possibles : centraliser la mesure de la MRD dans un seul laboratoire ou mettre en œuvre un protocole garantissant la reproductibilité entre les différents laboratoires impliqués dans la détermination de la MRD. Le nombre d’échantillons, la taille de l’essai et la capacité des laboratoires à traiter des volumes d’échantillons plus grands ou plus petits peuvent déterminer le choix entre ces stratégies. Si une stratégie multicentrique est choisie, les différences entre les plateformes cytométriques et le besoin d’analyses comparables entre les sites doivent être pris en compte.

À cette fin, nous décrivons une approche standardisée de flux MRD multicentre et multiplateforme combinant une analyse immunophénotypique/différente de la normale associée à la leucémie (LAIP/DfN) et une détection enrichie par cellules souches leucémiques (CSL) définies phénotypiquement par CD34⁺CD38⁻, mise en œuvre dans 30 laboratoires d’hématologie français sur la base des recommandations ELN et des rapports^{précédents 3,4}.

La cytométrie en flux permet de définir, au moment du diagnostic, la « signature » de la leucémie qui intègre l’expression spécifique des marqueurs sur les blastocystes du patient : LAIP. Après traitement, le flux de MRD permet de surveiller les LAIP identifiés au moment du diagnostic. Puisque les blastes leucémiques peuvent évoluer et modifier leur immunophénotype sous pression thérapeutique, une seconde stratégie doit être mise en œuvre de manière systématique : l’approche DfN, qui repose sur l’identification des cellules présentant des caractéristiques les différenciant de l’hématopoïèse normale. Cette technique peut également détecter l’apparition de nouveaux marqueurs sur les blastocystes au cours de la maladie et de son traitement.

Dans le groupe d’écoulement AML français, la conception du panneau était basée sur l’étude HOVON précédemment publiée sur la définition du motif des cellules leucémiques. Il n’existe pas de LSC universel ni de marqueur LAIP, nous avons donc conçu un panneau à 3 tubes permettant l’identification simultanée des populations enrichies en LAIP, DfN et CD34⁺CD38⁻ LSC. Une colonne vertébrale basée sur CD34/CD38/CD45/CD117 était utilisée dans tous les tubes, complétée par des marqueurs de lignée dans le premier tube, des marqueurs associés à LSC dans le second, et des marqueurs de lignée monocytaire ou de différenciation dans le troisième tube pour compléter la définition du LAIP en LMA avec blasts monocytiques. Les trois tubes sont prélevés au moment du diagnostic et dans des échantillons de suivi.

Compte tenu de la physiopathologie de la leucemogenèse, l’attention s’est déplacée de l’étude du volume blastogène à l’identification de la fraction la plus immature comme étant des populations enrichies en cellules souches leucémiques. Dick et ses collègues ont démontré l’hétérogénéité de la leucémie en décrivant les CSL CD34⁺CD38⁻ susceptibles de générer une leucémie chez des souris^{immunodéficientes 5,6}. Dans la quantification des CSL au diagnostic et au suivi, des efforts sont déployés pour standardiser les panels d’anticorps et les stratégies d’analyse au sein du groupe de travail ELN^{DAVID 1,7}. Actuellement, deux bilans, HOVON et ALFA, utilisent des marqueurs dichotomiques de LSC pour distinguer les populations enrichies en LSC des cellules souches hématopoïétiques normales dans l’espace CD34⁺CD38^{− 8,9}.

La méthode décrite ici combine la préparation standardisée de l’échantillon, la conception commune par panel d’anticorps, des réglages de sensibilité adaptés à la plateforme, une analyse enrichie en LSC pour LAIP/DfN et CD34⁺CD38⁻ , une évaluation externe de la qualité et un rapport clinique harmonisé pour la surveillance multicentrique du flux de MRD AML.

Protocole

Le protocole suit les recommandations et directives des comités d’éthique des Centres hospitaliers universitaires français. Tous les patients ont signé le consentement éclairé conformément à la législation française. Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité d’éthique humaine de la CHU Lyon et le Comité d’éthique du Conseil d’éthique institutionnel de la CHU de Lille conformément à la Déclaration d’Helsinki (observatoire HDF-AML, CNIL 2214454v0). Pour l’allogeffe, les donateurs ont été inclus dans la base de données européenne ProMISE basée sur Internet et ont donné un consentement éclairé pour la collecte de leurs données personnelles. L’extraction et l’analyse des données ont été effectuées conformément au Comité d’éthique local (CNIL2093819). Tous les fichiers de flux FCS utilisés pour la révision réseau étaient entièrement anonymisés à l’aide d’un script Python.

1. Réglage du cytomètre

1. Déterminez les valeurs cibles adaptées à chaque cytomètre à l’aide de billes arc-en-ciel à 8 pics.
2. Réglez chaque machine selon les valeurs ciblées indiquées dans le tableau 1. Assurez-vous que chaque canal atteint la valeur cible ± 5 %. Vérifiez ce réglage de manière systématique afin de maintenir la sensibilité longitudinale de chaque plateforme.
3. Établir la matrice de compensation à l’aide de tubes colorés à une seule teinte pour chaque anticorps, en utilisant des billes de compensation et/ou des cellules selon chaque plateforme.
4. Enregistrez la matrice de réglage et de compensation comme test ou protocole identifié comme MRD LAIP/DfN, LSC et MonoGran (T1, T2, T3). Utilisez ce test ou protocole pour l’acquisition afin de quantifier l’écoulement du MRD AML.

2. Procédure en laboratoire humide

1. Moelle osseuse aspirée
   1. Prélever 1 à 2 mL de moelle osseuse d’EDTA au moment du diagnostic et aux moments de surveillance, y compris MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 et rechute.
   2. Envoyez les tubes au laboratoire de référence en flux dans les 24 à 48 heures.
2. Préparation du frottis de moelle osseuse pour l’examen morphologique
   1. Placez une goutte d’aspiration de moelle osseuse sur une lame en verre. Étalez doucement l’échantillon à l’aide d’une couverture ou d’une autre lame.
   2. Après 30 minutes de séchage, colorez la tache avec May-Grünwald-Giemsa (Fichier Supplémentaire 1).
3. Lyse globale
   1. Ajoutez 15 mL de solution lysante NH₄Cl à 1 à 2 mL d’échantillon de moelle osseuse. Mélangez doucement et faites couver pendant 10 minutes à température ambiante.
   2. Centrifugez à 450 × g à température ambiante pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
   3. Resuspendez la pellete cellulaire dans 10 mL de PBS/0,1 % de BSA. Centrifugez à 450 × g à température ambiante pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
   4. Resuspendez le pellet cellulaire à une concentration de 30 × 10⁶ globules blancs/mL dans PBS.
4. Immunocoloration de la suspension cellulaire
   1. Distribuez les anticorps monoclonaux dans les tubes T1, T2 et T3 selon la plateforme (Tableau 2). Fournissez le clone, le volume, la référence du catalogue et le fournisseur pour chaque anticorps dans une table d’anticorps.
      REMARQUE : Pour chaque tube utilisant des teintures violettes brillantes, utilisez un tampon colorant brillant avant d’ajouter les anticorps.
   2. Ajoutez 2-3 ×10⁶ cellules lysées par tube dans 100 μL de suspension cellulaire. Incubez les cellules avec des anticorps pendant 15 minutes dans le noir à température ambiante.
   3. Lavez les cellules avec 3 mL de PBS. Centrifugez pendant 5 minutes à 450 × g et jetez le surnageant.
   4. Resuspendez les cellules colorées à 300 μL de PBS.
      REMARQUE : Des cocktails d’anticorps prémélangés ou des tubes à anticorps secs validés peuvent être utilisés.

3. Acquisition du cytomètre en débit

1. Ouvrir le protocole d’essai ou d’acquisition MRD avec la matrice de réglage et de compensation adaptée pour la mesure MRD LAIP/DfN et LSC.
2. Acquérir un minimum de 500 000 à 1 000 000 de globules blancs dans chaque tube au diagnostic et dans des échantillons de suivi MRD afin d’améliorer le regroupement des cellules MRD et la confiance dans les MRD de faible niveau.
   REMARQUE : Pour la mesure des CSL, acquérir un minimum de 1 000 000 de globules blancs dans le tube 2 afin d’obtenir une sensibilité adéquate pour la quantification des CSL (LOQ 0,002 % et LOD 0,001 %).
3. Sauvegardez les fichiers de données FCS provenant des échantillons de diagnostic et MRD. Consignez la date d’acquisition et l’identification du patient pour faciliter le suivi des analyses MRD et LSC.

4. Stratégie d’analyse

1. Utilisez un modèle commun et une séquence commune de points intégrant une stratégie de gating harmonisée prédéfinie adaptée au logiciel d’analyse utilisé dans chaque centre.
2. Appliquer la stratégie de gating pour identifier les cellules leucémiques en utilisant trois approches : LAIP, DfN et analyse LSC dans ^{la fraction} CD34⁺CD38-.
3. Identifier et exclure les événements non spécifiques potentiels et les populations physiologiques normales, y compris les basophiles, les cellules plasmacytoïdes dendritiques, les hématogones, les plasmocytes, les érythroblastes, les amas de plaquettes, les débris et les érythrocytes non lysés.

5. Définition des populations LAIP/DfN et physiologiques

1. Pour capturer le LAIP en explosions massives, dessinez une grille à cellule unique basée sur FSC-W versus FSC-H.
2. Dessinez une grille de cellules vivantes basée sur FSC versus SSC.
3. Dessinez une barrière sur un^DIMB/SSC du CD45.
4. Dessinez la porte de marqueurs primitive en utilisant CD34/CD117.
5. Utilisez des diagrammes de points biparamétriques fixes pour dessiner les portes LAIP pertinentes, y compris LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 et LAIP8.
6. Populations physiologiques
   1. Hématogones de grilles utilisant la séquence suivante : cellules vivantes, MNC sur le diagramme de points FSC/SSC, diagramme de points CD19/SSC, et diagramme de points CD34/CD38. Backgate en utilisant CD45/SSC.
   2. Basophiles à grilles utilisant la séquence suivante : cellules vivantes, MNC sur le diagramme de points FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), excluant les hématogones CD19⁺ . Backgate en utilisant CD45/SSC.
   3. Cellules dendritiques plasmacytoïdes à grilles utilisant la séquence suivante : cellules vivantes, MNC sur le diagramme de points FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), excluant les hématogones CD19⁺ . Backgate en utilisant CD45/SSC.
   4. Identifiez les érythroblastes, les amas de plaquettes, les débris et les érythrocytes non lysés à l’aide du diagramme des points CD36/CD45. Backgate utilisant CD45/SSC et FSC/SSC.
7. Approche LAIP
   1. Définissez MRD dans les AML primitives CD34⁺ OU CD117⁺ en utilisant les opérateurs booléens comme suit : LAIP1 ET LAIP2 ET LAIP3 ET LAIP4 ET LAIP5 ET LAIP6 ET LAIP7 ET LAIP8 ET NON CD36^{clair bright+}/CD45 ET cellules uniques ET cellules vivantes ET marqueurs primitifs CD34^+/CD117^+/ ET (grille d’explosion CD45/SSC OU MNC CD34⁺) (Figure 1).
   2. Définissez MRD dans CD34-CD117^- AML en utilisant des opérateurs booléens comme suit : LAIP1 ET LAIP2 ET LAIP3 ET LAIP4 ET LAIP5 ET LAIP6 ET LAIP7 ET LAIP8 ET PAS CD36^{clair bright+}/CD45 ET cellules uniques ET cellules vives ET CD34CD117 ET CD45/SSC (Figure 2).
8. Approche DfN
   1. Utilisez le même modèle que l’approche LAIP et appliquez l’espace vide défini sur les échantillons de moelle osseuse de référence (Tableau 3).
   2. Définir les populations anormales lorsque le groupe de cellules anormales est séparé des cellules normales par 0,5 décennie sur l’échelle^{logarithmique 12}.
   3. Pour capturer le DfN en blasts en masse, dessinez des cellules vivantes à l’aide de FSC/SSC.
   4. Dessinez des cellules simples en retirant les doublets en fonction de la zone de pic/SSC du FSC.
   5. Dessinez la porte MNC en utilisant FSC/SSC.
   6. Appliquer une barrière de nettoyage pour éliminer les lymphocytes à l’aide de CD45/CD36/SSC.
   7. Installez une barrière de nettoyage pour éliminer les érythroblastes et les débris en utilisant CD45/CD36.
   8. Utiliser deux portes d’entrée, CD34⁺/CD45/SSC et CD117⁺/CD45/SSC, pour définir les boîtes vides selon les publications^{précédentes 12,13}.
   9. Prélever chaque boîte vide de DfN en fonction des populations témoins internes, y compris les lymphocytes pour les marqueurs croisés et les précurseurs myéloïdes normaux pour la perte, la diminution ou la surexpression.
   10. Comparez les boîtes vides avec des échantillons de moelle osseuse de référence, incluant la moelle osseuse régénérante, inflammatoire et saine du donneur.

6. Définition de la population du CSL CD34⁺CD38^-

1. Identifier les cellules enrichies en LSC au diagnostic dans l’espace CD34⁺CD38^- à partir des marqueurs LSC présentant une expression dichotomique et une absence d’expression dans les cellules souches hématopoïétiques normales de la moelle osseuse saine.
2. Définissez la porte d’entrée LSC comme MNC34⁺ en utilisant la séquence de porte suivante : cellules vivantes, cellules uniques, MNC et CD34⁺ dans le diagramme de points CD45/CD34.
3. Définissez la fraction CD34⁺CD38^- (P6) en utilisant un seuil rigoureux basé sur le niveau de fluorescence moins un (FMO) du CD38.
4. Définir les cellules enrichies en LSC dans le tube 1 dans la fraction P6 en utilisant des opérateurs booléens comme suit : P6CD7⁺ OU P6CD33⁺ OU P6CD19⁺ OU P6CD56⁺ ET NON propres CD36^bright+ ET cellules uniques ET cellules vivantes ET MNC ET MNC CD34⁺.
5. Définir les cellules enrichies en LSC dans le tube 2 de la fraction P6 en utilisant des opérateurs booléens comme suit : P6CD45RA⁺ OU P6MIX⁺ OU ^P6CD123+ ET NON propres CD36^bright+ et cellules uniques ET cellules vivantes ET MNC CD34⁺.
6. Utilisez CD36 pour nettoyer les événements non spécifiques dans la porte finale du MRD LSC (Figure 3).

7. Définition du seuil CD38^- dans la population de CD34⁺

1. Réglez le canal CD38 suffisamment haut pour distinguer les populations CD38^- des populations CD38^+/ avec une bonne résolution.
2. Définissons P6 comme CD34⁺CD38^-, P7 comme CD34⁺CD38^bas, et P8 comme CD34⁺CD38^haut.
3. On base le réglage du canal CD38 sur les populations de CD38 bright, en identifiant les plasmocytes comme les populations les plus brillantes et les hématogones selon la plage de mesure de chaque plateforme.
4. Définir la population CD34⁺CD38^- (P6) en utilisant l’approche FMO CD38 validée par un groupe isoclonique CD38.
5. Définissez la^faible population (P7) de CD34⁺CD38 en utilisant le niveau négatif de l’hématogone.
6. Définissez la population^élevée de CD34⁺CD38 (P8) en utilisant le niveau de positivité de l’hématogone et le niveau négatif des cellules plasmatiques (Figure 4).
7. Utiliser le même seuil CD38^- à travers le groupe harmonisé en utilisant des méthodes robustes telles que CD38^- FMO ou le contrôle isoclonique CD38.
8. Utiliser au moins un immunophénotype aberrant dans la fraction CD34⁺CD38^- pour définir les cellules enrichies en LSC. Inclure des marqueurs LSC tels que CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 ou des marqueurs de lignée tels que CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Appliquer les seuils suivants : sensibilité au test LOQ ^10-4 et LOD ^10-5 ; La positivité des LSC au diagnostic ≥ 1 % des blastocystes CD45/SSC ; et la positivité des LSC dans le suivi des MRD ≥ 0,01 % des globules blancs.

8. Rapport de flux clinique harmonisé

1. Fournir les informations suivantes pour chaque résultat : qualité de la moelle osseuse, stratégie utilisée pour l’identification des MRD, description du LAIP, LOD et LOQ, seuils et interprétation des résultats.
2. Hémodilution et représentativité de la moelle osseuse
   1. Évaluer l’hémodilution pour chaque rapport clinique de flux MRD afin d’évaluer la robustesse du résultat.
   2. Utilisez l’une des méthodes d’hémodilution décrites précédemment lorsque cela est applicable (Tableau 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. En complément, calculez la représentativité de la moelle osseuse en utilisant le rapport observé CD34/WBC45 comparé au rapport attendu observé dans les échantillons de référence de moelle osseuse (Figure 5).
   4. Utilisez la formule suivante :
      P : pourcentage de pureté = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s : proportion de cellules MNC CD34⁺ dans le sang périphérique normal : 0,0005
      m : proportion de cellules MNC CD34⁺ dans la moelle osseuse normale : 0,035
      L : nombre de leucocytes WBC45⁺ dans l’échantillon de patient MRD
      n : nombre de cellules MNC CD34⁺ dans l’échantillon de patient MRD
   5. Rapporter la représentativité de la moelle osseuse comme une évaluation de qualité de l’échantillon. N’utilisez pas cette valeur pour normaliser les résultats de la MRD.
   6. Interprétez la représentativité de la moelle osseuse comme suit : 100 % à 10 %, faible influence sur la proportion de cellules CD34⁺ dans la moelle osseuse ; 10 % à 1 %, avertissement pour l’interprétation des résultats de la MRD ; et < 1 %, résultat non interprétable.
3. Quantification des CSL au diagnostic
   1. Rapportez le profil utilisé pour identifier les cellules enrichies en LSC, par exemple CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Rapportez les résultats des LSC au diagnostic comme le pourcentage observé des blastocystes CD45/SSC.
   3. Utilisez le LSC ≥ 1 % du total des blastocystes comme seuil pour un mauvais pronostic.
4. Suivi MRD par LAIP/DfN
   1. Rapportez le profil LAIP utilisé pour identifier MRD, par exemple, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Rapporter la sensibilité de l’analyse comme étant la valeur la moins sensible entre le seuil technique et la valeur de robustesse observée pour le profil LAIP par rapport aux échantillons de moelle osseuse de référence.
   3. Utiliser un cluster minimum de 50 cellules entre les événements WBC acquis comme limite de quantification. Par exemple, avec 500 000 cellules de globules blancs, le LOQ est de 0,01 % (1 × ^10-4).
   4. Déclarez les résultats du LAIP/DfN comme positifs, négatifs, détectables mais en dessous du seuil clinique, ou non détectables.
   5. Rapporter la positivité du LAIP/DfN à ≥ 0,1 %, exprimée en pourcentage total de leucocytes CD45⁺ .
   6. Rapportez une négativité LAIP/DfN à < 0,1 %.
   7. Pour des résultats détectables mais en dessous du seuil, indiquez la valeur représentative et le seuil de sensibilité.
   8. Pour les résultats non détectables, signalez que le résultat est inférieur au seuil de sensibilité à l’analyse et ajoutez un commentaire si nécessaire, comme une hémodilution, une faible spécificité LAIP ou un seuil technique insuffisant.
5. MRD de suivi par LSC
   1. Rapportez le profil utilisé pour identifier les cellules enrichies en LSC, par exemple CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Utiliser un cluster minimum de 20 cellules entre les événements WBC acquis comme limite de quantification. Par exemple, avec 1 000 000 de cellules de globules blancs, le LOQ est de 0,002 % (2 × ^10-5).
   3. Déclarez les résultats des CSL comme positifs, négatifs, détectables mais en dessous du seuil clinique, ou non détectables.
   4. Déclarez la positivité des LSC à ≥ 0,01 %, exprimée en pourcentage total de leucocytes CD45⁺ .
   5. Déclarez la négativité des LSC à < 0,01 %.
   6. Pour des résultats détectables mais en dessous du seuil, indiquez la valeur représentative et le seuil de sensibilité.
   7. Pour les résultats non détectables, signalez que le résultat est inférieur au seuil de sensibilité à l’analyse et ajoutez un commentaire si nécessaire, comme une hémodilution, une faible spécificité de la CSL ou un seuil technique insuffisant.
6. Intégrer l’interprétation du flux MRD avec les points temporels de surveillance précédents. Indiquer la modulation du profil phénotypique pendant le traitement et la dynamique du flux de MRD, incluant la repositivité, l’augmentation, la stabilité ou la diminution.
7. Transmettez les résultats au clinicien et à l’investigateur demandeur en utilisant le rapport de flux clinique selon le délai du laboratoire de flux de référence.
8. Synsumez le rapport de flux clinique harmonisé en utilisant les éléments suivants : qualité de la moelle osseuse, stratégie d’identification des MRD, description du LAIP, LOD et LOQ, seuils et interprétation comme MRD positif, MRD négatif avec valeur LOD, ou MRD détectable mais non quantifiable.

Résultats

Miroir de plateforme

Pour la comparaison initiale sur deux plateformes entre CANTO et NAVIOS, les réglages de tension ont été ajustés en obtenant des billes arc-en-ciel 8 crêtes non compensées afin d’atteindre des valeurs MFI cibles prédéfinies. Les valeurs de cible de la plateforme CANTO de référence ont été transposées vers la seconde plateforme NAVIOS en utilisant la conversion suivante : nouvelle cible MFI = cible MFI de référence/256^22. Pour détecter les biais entre les plateformes, 10 échantillons régénératifs régénératifs de moelle osseuse d’EDTA ont été testés en parallèle. L’indice de coloration entre les populations positives et négatives a été comparé entre échantillons et plateformes et a montré une séparation comparable (Fichier Supplémentaire - Figure S3).

Au cours de l’étude, les plateformes ont été progressivement améliorées, passant de configurations 8 et 10 couleurs à LYRIC et DxFLEX 12 et 13 couleurs (Fichier Supplémentaire 1). Le miroir a été étendu sur quatre plateformes à l’aide de perles arc-en-ciel à 8 pics et de moelle osseuse saine teintée acquise avec le même panneau. Le chevauchement des pics a été vérifié en ajustant uniquement les échelles logarithmiques de représentation. Après application des réglages définis, les motifs de coloration des cellules se sont superposés, la principale différence étant la translation des nuages cellulaires selon les échelles logarithmiques (Figure 6 et Fichier Supplémentaire S4 et Figure S5).

Évaluation de la qualité et reproductibilité dans les laboratoires de flux

Après la mise en œuvre de la procédure opérationnelle standard initiale et ses mises à jour lors des mises à niveau de la plateforme, une évaluation de qualité externe humide (EQA) a été réalisée régulièrement à partir d’échantillons de moelle osseuse de référence fraîches partagés entre les centres participants. L’EQA humide a été utilisée pour vérifier la procédure de laboratoire humide, les paramètres de plateforme et la stratégie d’analyse de porte commune. Les populations rapportées comprenaient les cellules MNC CD34⁺ dans le dénominateur WBC CD45⁺ et les cellules CD34⁺CD38⁻ P6 dans le dénominateur WBC CD45⁺ . Les résultats ont été analysés par z-score et/ou représentation graphique (Figure 7).

Cinq rondes d’EQA humide ont été réalisées depuis 2017, avec respectivement 22, 15, 17, 26 et 25 laboratoires participants. Pour les cellules %CD34⁺CD38⁻ dans les globules blancs CD45⁺ et %MNC CD34⁺ dans les globules blancs CD45⁺, les résultats étaient les suivants : EQA1, valeurs moyennes 0,015 % et 1,01 % (DE 0,09 % et 0,24 %) ; EQA2, 0,09 % et 1,02 % (DE 0,046 % et 0,36 %) ; EQA3, 0,097 % et 1,46 % (DE 0,024 % et 0,32 %) ; EQA4, 0,024 % et 2,16 % (DE 0,015 % et 0,59 %) ; et EQA5, 0,027 % et 1,9 % (DE 0,008 % et 0,45 %).

Pour répondre à la standardisation de la stratégie d’analyse MRD entre centres, l’EQA humide a été complétée par l’EQA sèche utilisant des fichiers FCS partagés pour le diagnostic, le suivi MRD et la moelle osseuse de référence. Plus de 90 % des données analysées localement ont été incluses dans l’intervalle centralisé basé sur la moyenne en série ± 2 DE : 95,6 % et 91,3 % pour DryEQA2017, avec 22 des 23 laboratoires participants, et 100 % pour DryEQA2024, avec 24 des 25 laboratoires participants (Figure 8). Deux séries d’EQA sèche ont été effectuées pour le %MRD LAIP dans les globules blancs CD45⁺ et %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ dans les globules blancs CD45⁺. DryEQA2017 a montré une valeur moyenne de LAIP de 11,9 % (DE 1,35 %) et une valeur moyenne de CSL de 0,16 % (DE 0,05 %). DryEQA2024 a montré une valeur moyenne de LAIP MRD de 0,35 % (DE 0,26 %) et une valeur moyenne de MRD de LSC CD34⁺CD38⁻ de 0,18 % (DE 0,06 %).

Exemple de mesure de débit multimodale AML MRD utilisant des stratégies LAIP/DfN et LSC

Pour quantifier la MRD, trois approches ont été systématiquement utilisées. La première approche a établi la cartographie LAIP des blasts leucémiques au diagnostic en utilisant des portes booléennes, et cette cartographie a été appliquée à des échantillons de moelle osseuse de suivi (Figure 9A). La seconde approche a utilisé l’analyse DfN pour identifier des cellules anormales présentant des schémas d’expression atypiques non observés dans les zones de « boîte vide » définies à partir d’une différenciation myéloïde normale (Figure 9B). La troisième approche quantifiait les cellules enrichies en LSC dans la fraction CD34⁺CD38⁻ à l’aide de marqueurs dichotomiques de LSC et de gating booléen (Figure 10).

Échantillons de référence de moelle osseuse

Un total de 135 échantillons de moelle osseuse de référence ont été étudiés, dont 25 échantillons de moelle osseuse saine de donneurs, 34 échantillons inflammatoires de moelle osseuse et 76 échantillons de moelle osseuse régénératrice. La moelle osseuse saine d’un donneur a été obtenue auprès de donneurs sains, avec un âge médian de 31 ans et une fourchette de 21 à 49 ans. La moelle osseuse inflammatoire a été obtenue chez des patients orientés pour cytopénie, y compris anémie, neutropénie ou thrombopénie, les aspirates de moelle osseuse ne présentant aucune malignité hématologique ; L’âge médian était de 52 ans, avec une fourchette de 25 à 82 ans. La régénération de la moelle osseuse a été obtenue lors du suivi de la LMA à différents moments de chimiothérapie, notamment après induction ou consolidation, avec négativité de l’évaluation moléculaire de la MRD pour les transcrits NPM1 ou CBF ; L’âge médian était de 54 ans, avec une fourchette de 18 à 65 ans.

La qualité de ces échantillons a été validée par un examen microscopique. Le pourcentage théorique attendu de cellules CD34⁺ dans les échantillons de moelle osseuse non diluée a également été calculé à l’aide de la formule de Brooimans, avec des résultats de >90 % pour tous les échantillons. Ces échantillons ont été utilisés pour établir des seuils pour l’analyse LAIP/DfN et LSC ainsi que pour calculer la formule d’hémodilution et de pureté. La variation de l’expression des marqueurs MFI selon le statut de la moelle osseuse a été étudiée pour des échantillons de donneurs sains, d’inflammation et de régénération (Fichier supplémentaire - Figure S6). Les valeurs de référence ont été déterminées pour les paramètres les plus pertinents, notamment %MNC CD34⁺ à partir de WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ à MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim à MNC CD34⁺, et %P8 CD34^{+CD38 élevé} dans MNC CD34⁺ (Figure de fichier supplémentaire S6).

Évaluation de la sensibilité et de la linéarité

La sensibilité a été évaluée pour les portes spécifiques au LAIP/DfN et aux LSC en mesurant le nombre d’événements anormaux dans un ensemble d’échantillons de moelle osseuse de référence, incluant la moelle osseuse régénératrice, inflammatoire et saine du donneur. La dilution en série d’un nombre connu de blastocystes dans la moelle osseuse saine a été utilisée pour vérifier la limite de quantification et la linéarité de la mesure de la MRD (Figure 11 et Figure 12).

Figure 1 : Stratégie de gating pour l’analyse MRD LAIP en AML utilisant des marqueurs primitifs (CD34⁺/CD117⁺) dans le tube 1. Première ligne : gating séquentiel du temps, cellules vivantes basées sur FSC versus SSC, cellules uniques basées sur FSC-W versus FSC-H, CELLULES WBC CD45⁺ sur CD45 versus SSC, blasts sur^{CD45 dim}/SSC, cellules mononucléaires (MNC) sur FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ sur le graphique CD45 versus CD34, et la porte de marqueurs primitive sur le graphique CD34 versus CD117. Deuxième et troisième rangées : des points biparamétriques fixes utilisés pour définir les portes LAIP les plus pertinentes (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP a été défini selon la stratégie booléenne suivante : temps ET cellules vivantes ET cellules uniques ET (blasts OR MNC CD34⁺) ET marqueurs primitifs (CD34^+/−CD117^+/−) ET LAIP1 ET LAIP2 ET LAIP3 ET LAIP4 ET LAIP5 ET LAIP6 ET LAIP7 ET LAIP8. Dans le cas illustré, la MRD représentait 6,8 % des globules blancs au jour 45⁺ de J, contre 0,04 % ± 0,03 dans la moelle osseuse saine. À droite : back-gate de la porte MRD finale utilisée pour la quantification, permettant le nettoyage des événements non spécifiques, des érythroblastes et des débris. Abréviations : LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; FSC = diffusion avant ; SSC = diffusion latérale ; Les globules blancs = globules blancs ; MNC = cellules mononucléaires ; hBM = moelle osseuse saine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Stratégie de gating pour l’analyse LAIP MRD dans la LMA utilisant des blasts matures (CD34⁻CD117⁻) dans le tube 3. Première ligne : saisie séquentielle du temps, cellules vivantes basées sur FSC versus SSC, cellules uniques basées sur FSC-W versus FSC-H, CELLULES WBC CD45⁺ sur CD45 versus SSC, blasts sur^{CD45 dim}/SSC, cellules mononucléaires (MNC) sur FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ sur le graphique CD45 versus CD34, et la grille de blast mature sur le graphique CD34 versus CD117.
Deuxième et troisième rangées : des points biparamétriques fixes utilisés pour définir les portes LAIP les plus pertinentes (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP a été défini selon la stratégie booléenne suivante : temps ET cellules vivantes et cellules uniques ET blasts et blasts CD34⁻CD117⁻ ET LAIP1 ET LAIP2 ET LAIP3 ET LAIP4 ET LAIP5 ET LAIP6 ET LAIP7 ET LAIP8. Dans le cas illustré, la MRD représentait 15 % du taux de globules blancs au CD45⁺, contre 0,09 % ± 0,02 dans une moelle osseuse saine.
À droite : back-gating de la porte MRD finale utilisée pour la quantification, permettant le nettoyage des événements non spécifiques. Abréviations : LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; FSC = diffusion avant ; SSC = diffusion latérale ; Les globules blancs = globules blancs ; MNC = cellules mononucléaires ; hBM = moelle osseuse saine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Stratégie de verrouillage pour les cellules souches hématopoïétiques normales (nHSC) et les cellules enrichies en cellules souches leucémiques (LSC) dans la fraction CD34⁺CD38⁻ (Tube 2). (A) Cellules souches hématopoïétiques normales (nHSC) et (B) cellules enrichies en cellules souches leucémiques (LSC) dans la fraction CD34⁺CD38⁻ (Tube 2). Première ligne : filtrage séquentiel du temps, cellules vivantes basées sur FSC versus SSC, cellules uniques basées sur FSC-W versus FSC-H, cellules WBC CD45⁺ sur CD45 versus SSC, blasts sur CD45dim/SSC, cellules mononucléaires (MNC) sur FSC-A/SSC-A, et cellules MNC CD34⁺ sur le graphique CD45 versus CD34.
Deuxième à quatrième rangées : des diagrammes biparamétriques fixes utilisés pour définir P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^bas) et P8 (CD34⁺CD38^haut), ainsi que les marqueurs dichotomiques LSC les plus pertinents, y compris MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 et CD45RA. MRD LSC a été défini selon la stratégie booléenne suivante : temps ET cellules vivantes et cellules uniques ET blasts ET MNC CD34+ ET P6 ET (P6 LSC MIX⁺ OU P6 LSC CD123⁺ OU P6 LSC CD45RA⁺).
À droite : back-gating de la porte finale MRD LSC utilisée pour la quantification, permettant le nettoyage des événements non spécifiques.
(A) nHSC dans un échantillon sain de moelle osseuse : les nHSC (événements violets) étaient CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ et CD90⁺. La fraction nHSC CD34⁺CD38⁻ représentait 0,02 % des globules blancs CD45⁺, et les cellules LSC CD34⁺CD38⁻ étaient négatives. Les seuils de test rapportés étaient LOQ de 0,0001 % et LOD de 0,001 %.
(B) Cellules enrichies en LSC dans un échantillon de LMA : les cellules enrichies en LSC (événements orange) étaient CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ et CD90⁺. La fraction du CSL au jour 34⁺CD38⁻ représentait 3,7 % du nombre de globules blancs au jour 45⁺. Abréviations : nHSCs = cellules souches hématopoïétiques normales ; LSC = cellule souche leucémique ; MNC = cellules mononucléaires ; Les globules blancs = globules blancs ; SSC = diffusion latérale ; MIX = CLL1/TIM3/CD97 ; HLA-DR = antigène leucocytaire humain-DR ; LOQ = limite de quantification ; LOD = limite de détection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Définition du seuil CD38⁻ dans la population CD34⁺ en utilisant le canal de fluorescence moins un (FMO) CD38. Première rangée : gating des populations de référence, incluant les blasts sur les cellules CD45/SSC, les cellules MNC CD19⁺ et les cellules MNC CD34⁺.
Deuxième rangée : niveau de signal sur le canal FMO CD38. La première ligne montre les cellules blast, la deuxième montre les cellules MNC CD19⁺ , et la troisième ligne montre les cellules MNC CD34⁺ . La ligne orange indique le seuil définissant la porte P6 CD34⁺CD38⁻ .
Troisième rangée : niveau de signal CD38 PE-Cy7. La première ligne montre les cellules blastiques, la deuxième montre les cellules MNC CD19⁺ avec le niveau d’hématogone CD38 utilisé pour définir P8 CD34^{+CD38 élevé}, et la troisième ligne montre les cellules MNC CD34⁺, avec P6 CD34⁺CD38⁻ en orange, P7 CD34⁺CD38^basses en vert, et P8 CD34⁺CD38^haut Des cellules en bleu. Abréviations : FMO = fluorescence moins un ; MNC = cellules mononucléaires ; SSC = diffusion latérale ; PE-Cy7 = phycoythrine-cyanine 7 ; P6 = fraction CD34+CD38− ; P7 = CD34+CD38 fraction basse ; P8 = CD34+CD38 fraction haute. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Évaluation de la représentativité des échantillons de moelle osseuse basée sur les cellules MNC CD34⁺. (A) Stratégie de gating pour les cellules MNC CD34⁺ et paramètres utilisés pour le calcul des formules : n, nombre de cellules MNC CD34⁺ ; L, nombre ^{de cellules} CD45+ de globules blancs ; s, proportion de cellules MNC CD34⁺ dans le sang périphérique normal ; et m., proportion de cellules MNC CD34⁺ observées dans la moelle osseuse normale de référence. (B) Représentation schématique de l’impact de la dilution de la moelle osseuse (BM) par le sang périphérique (PB) sur l’origine des cellules CD34⁺ dans les échantillons de BM. (C) Critères utilisés pour interpréter la pureté des BM. Abréviations : BM = moelle osseuse ; PB = sang périphérique ; MNC = cellules mononucléaires ; Les globules blancs = globules blancs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Comparaison des schémas d’expression sur quatre plateformes de cytomètres à flux.
Un échantillon de moelle osseuse normale (BM) a été testé simultanément sur quatre plateformes cytométriques en utilisant les réglages définis pour chaque plateforme et l’ajustement de l’échelle. La première ligne montre les cellules MNC sur le diagramme de points CD45/CD33 ; la deuxième ligne montre les cellules MNC sur le diagramme de points du marqueur primitif CD34/CD117 ; la troisième ligne montre les cellules blast sur le diagramme de points CD34/CD38 ; et la quatrième ligne montre les cellules P6 CD34⁺CD38⁻ sur le diagramme de points CD45RA/CD90. Abréviations : BM = moelle osseuse ; MNC = cellules mononucléaires ; P6 = fraction CD34⁺CD38⁻ . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Reproductibilité de l’EQA en laboratoire humide entre les laboratoires de flux participants. (A) Graphique de violon montrant la distribution des cellules %P6 CD34⁺CD38⁻ dans les cellules WBC CD45⁺ à travers les cinq rondes d’EQA en laboratoire humide et les laboratoires d’écoulement participants. (B) Graphique de violon montrant la répartition des cellules %MNC CD34⁺ dans les cellules WBC CD45⁺ à travers les cinq rondes d’EQA en laboratoire humide et les laboratoires de flux participants. Abréviations : EQA = évaluation externe de la qualité ; P6 = fraction CD34+CD38− ; Les globules blancs = globules blancs ; MNC = cellules mononucléaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Évaluation à sec EQA des mesures de LAIP/DfN et de MRD des LSC. (A) Exercice EQA2017 sec pour la mesure de LAIP/DfN et LSC MRD utilisant six fichiers FCS partagés d’un groupe de 8 couleurs, incluant le diagnostic de LMA, la MRD AML et les fichiers de référence de moelle osseuse normale pour l’analyse du LAIP du tube 1 et du LSC du tube 2. L’exercice a été partagé avec 23 laboratoires participants. (B) Exercice EQA2024 sec pour la mesure de LAIP/DfN et de MRD LSC en utilisant six fichiers FCS partagés d’un groupe de 12 couleurs, incluant le diagnostic de LMA, la MRD AML et les fichiers de référence de moelle osseuse normale pour l’analyse du LAIP du tube 1 et du LSC du tube 2. L’exercice a été partagé avec 24 laboratoires participants. (C) Comparaison interplateforme des cellules %MNC CD34⁺ et des cellules %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ dans les cellules WBC CD45⁺ mesurées pendant le Wet EQA2025, partagée avec 25 laboratoires participants. Les valeurs attendues étaient de 1,6 % pour les cellules MNC CD34⁺ et de 0,02 % pour les cellules nHSC P6 CD34⁺CD38⁻. Abréviations : EQA = évaluation externe de la qualité ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; DfN = différent de la normale ; LSC = cellule souche leucémique ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; FCS = norme de cytométrie en flux ; LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MNC = cellules mononucléaires ; nHSC = cellules souches hématopoïétiques normales ; Les globules blancs = globules blancs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 9 : Mesure représentative de MRD utilisant les approches LAIP/DfN. (A) Exemple de mesure MRD utilisant la méthode LAIP/DfN. Le côté gauche montre la cartographie LAIP des cellules leucémiques dans l’échantillon de diagnostic, et le côté droit montre l’application de la même cartographie LAIP à l’échantillon de suivi, avec la population MRD affichée en noir. (B) Exemple de mesure MRD utilisant la méthode DfN. Chaque paire de diagrammes de points compare la moelle osseuse saine (hBM ; normal, graphique gauche) avec un échantillon de moelle osseuse de suivi MRD (DfN, graphique de droite). La zone de la « boîte vide » est définie sur la moelle osseuse normale, et la présence de cellules leucémiques dans cette boîte vide est évaluée dans l’échantillon de suivi, la population anormale étant indiquée en noir. Abréviations : MRD = maladie résiduelle mesurable ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; DfN = différent de la normale ; hBM = moelle osseuse saine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 10 : Mesure représentative des cellules enrichies en LSC CD34⁺CD38⁻ au diagnostic et au suivi. (A) Exemple de mesure cellulaire enrichie en LSC dans un échantillon de diagnostic de LMA. Le côté gauche présente le profil enrichi en LSC, la population orange exprimant MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR et CD36 dans la fraction CD34⁺CD38⁻.
(B) Échantillon de suivi du même patient montrant la persistance de cellules enrichies en MRD LSC avec le même profil immunophénotypique (population orange). Abréviations : LSC = cellule souche leucémique ; LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; MIX = CLL1/TIM3/CD97 ; HLA-DR = antigène leucocytaire humain-DR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 11 : Sensibilité analytique de la détection des CSL. (A) Évaluation de la limite de blanc (LOB) pour la détection des CSL. Le côté gauche montre la quantification des événements CD34⁺CD38⁻ dans une fusion de cinq fichiers FCS à partir de cinq échantillons de moelle osseuse saine (5 148 000 événements WBC acquis). Le côté droit montre le nombre d’événements appartenant à la porte booléenne du LSC rétro-grillée sur le diagramme de points CD45/SSC (14 événements), correspondant à un LOB de <0,0005 % (5 × ^10-6). (B) Évaluation de la linéarité pour la quantification des CSL. Le côté gauche montre une dilution en série par spik-in de cellules enrichies en LSC dans un échantillon sain de moelle osseuse. Le côté droit montre la corrélation entre les valeurs de MRD mesurées et les valeurs théoriques, correspondant à une limite de quantification (LOQ) de 2 × ^10-5 (0,002 %). Abréviations : LSC = cellule souche leucémique ; LOB = limite de blanc ; FCS = norme de cytométrie en flux ; Les globules blancs = globules blancs ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; LOQ = limite de quantification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 12 : Linéarité et plage de quantification de la mesure des LAIP MRD. (A) Évaluation de la linéarité pour la quantification des LAIP MRD par dilution en série de blasts avec différents LAIP dans la moelle osseuse saine, montrant la corrélation entre les valeurs mesurées de MRD et les valeurs théoriques, avec une LOQ variable selon les différents LAIP et LOQ <0,1 %. (B) Plage de quantification selon différents LAIP. La ligne rouge indique le seuil clinique de 0,1 %. Le LOQ a atteint le seuil clinique pour tous les LAIP testés. Abréviations : MRD = maladie résiduelle mesurable ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; LOQ = limite de quantification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fluoro Chrome	Sommet	LYRIC12c	Sommet	DxFlex13c	Sommet	NAVIOS10C	Sommet	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
EPS	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tableau 1 : Valeurs cibles pour chaque plateforme utilisant des perles arc-en-ciel à 8 pics. Des valeurs cibles spécifiques sont indiquées pour chaque plateforme de cytomètre (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Les pics conservés ont été choisis pour être proches de l’IMF observé pour les cellules blastiques. Cela est particulièrement important pour les cytomètres basés sur la PMT, où l’intensité du signal n’augmente pas linéairement avec l’augmentation de la tension PMT. En revanche, sur les cytomètres basés sur les APD, l’intensité du signal augmente linéairement avec le gain, permettant d’utiliser le même pic pour tous les détecteurs, tandis que des pics différents sont nécessaires pour chaque canal sur les cytomètres à base de PMT. Abréviations : MFI = intensité médiane de fluorescence ; PMT = tube photomultiplicateur ; APD = photodiode d’avalanche. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

CHANT 8C /NAVIOS 8c

FITC

EPS

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tube 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tube 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Souple Mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIQUE 10-12c

FITC

EPS

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tube 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tube 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Souple Mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

EPS

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3 (2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Souple Mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

EPS

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13C

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13C

CD90 5μL

MIX3 (2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Souple Mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tableau 2 : Configurations des panneaux d’anticorps pour l’analyse AML MRD LAIP/DfN et LSC. Le tableau résume les configurations de panneaux 8, 10, 12 et 13 couleurs selon la plateforme cytométrique. Le tube 1 est utilisé pour l’analyse LAIP/DfN, le tube 2 pour l’analyse cellulaire enrichie en LSC CD34⁺CD38⁻ , et le tube 3 pour les marqueurs de différenciation monocytique/granulocytique. Les volumes d’anticorps et les affectations fluorochromes sont affichés pour chaque plateforme. MIX3 correspond à CD97, TIM3 et CLL1. Abréviations : LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; DfN = différent de la normale ; LSC = cellule souche leucémique ; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Perte complète des marqueurs exprimés normalement sur les précurseurs myéloïdes

CD13++CD33-/CD34+ ou CD117+

CD13-CD33++/CD34+ ou CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Expression croisée des marqueurs lymphoïdes sur les précurseurs myéloïdes

CD7+CD13+/CD34+ ou CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ ou CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ ou CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ ou CD117+

CD19+CD117+/ ou CD13+ ou CD33+

Surexpression sur les précurseurs myéloïdes

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Diminution de l’expression des précurseurs myéloïdes

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tableau 3 : Définitions de « boîtes vides » basées sur le LAIP. Le tableau présente des motifs prédéfinis de « boîtes vides » différents de la normale (DfN) utilisés pour identifier les populations anormales de précurseurs myéloïdes. Les catégories incluent la perte complète des marqueurs normalement exprimés, l’expression des marqueurs lymphoïdes inter-lignées, la surexpression des marqueurs et la diminution de l’expression des marqueurs sur les précurseurs myéloïdes. Abréviations : LAIP = immunophénotype associé à la leucémie ; DfN = différent de la normale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Pureté de la moelle osseuse = (1 − (GRMO/GR SG) x (GBSG/GB MO)) x 100	>80 %
Björlund et al.19	GPA > 15 %
	CD3 < 20 %
Loken et al.18	Taux élevé de CD16 < 30 %
Theunissen et al.20 ; Dworzak et al.21
Débit ou Ctr cytologique DIL : PNN < 40 %, Ebl > 5 %, Ly < 20 %	CD16++ CD11b++ < 40 %
	GPA > 5 %
	CD3 < 20 %
Pureté des BM % : MNC 34+/WBC45+	Pureté des BM 100-10 %

Tableau 4 : Méthodes de contrôle de la dilution de la moelle osseuse pour la déclaration des flux de MRD AML. Le tableau résume les méthodes publiées de dilution de la moelle osseuse et de contrôle de la représentativité pouvant être utilisées pour les rapports cliniques de flux de MRD de la LMA. Au moins une méthode de dilution-contrôle doit être appliquée pour soutenir l’interprétation des résultats de la MRD. L’approche de pureté de la moelle osseuse CD34/WBC45⁺ est incluse comme évaluation complémentaire de la qualité. Abréviations : LMA = leucémie myéloïde aiguë ; MRD = maladie résiduelle mesurable ; BM = moelle osseuse ; Les globules blancs = globules blancs ; CD34/WBC45⁺ = cellules CD34⁺ parmi les globules blancs CD45⁺ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1 : Contexte supplémentaire, harmonisation de plateforme, référence de la moelle osseuse et supports pronostiques. Ce fichier complémentaire contient des figures et tableaux de soutien liés à l’identification des LSC, à l’hétérogénéité phénotypique des LMA, au miroir interplateforme, à l’optimisation spécifique à la plateforme, aux profils d’expression des marqueurs de moelle osseuse de référence, à l’évolution des panneaux longitudinaux, ainsi qu’au seuil pronostique utilisé pour la quantification des CSL au moment du diagnostic. Ces documents fournissent un contexte supplémentaire pour le flux de travail de cytométrie à flux multicentrique MRD, incluant la justification de l’évaluation cellulaire enrichie en LSC CD34⁺CD38⁻ , la base technique de l’harmonisation de la plateforme, ainsi que les données de soutien utilisées pour interpréter le fond de la moelle de référence, la migration des panneaux et la sélection des seuils cliniques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Étapes critiques du protocole

La qualité de l’échantillon est cruciale pour une quantification précise des MRD et des LSC. Les échantillons de moelle osseuse fraîche doivent être transportés à température ambiante et traités idéalement dans les 24 à 48 heures, et, si nécessaire, dans les 72 heures suivant la^23e collecte. L’hémodilution doit être évaluée à chaque moment et incluse dans le rapport de flux clinique. Le clinicien doit spécifier le moment du traitement, par exemple après induction, consolidation, immunothérapie ciblée, traitement moins intensif comme l’azacitidine/vénétoclax ou l’allogaffe. Le paysage de différenciation est étroitement lié au traitement et au moment opportun, et il est important de l’intégrer dans l’interprétation des MRD. Lors du suivi longitudinal, la même sensibilité de l’instrument et la fiabilité de l’analyse doivent être maintenues par des contrôles réguliers des valeurs cibles avec des billes de contrôle arc-en-ciel, un EQA régulier et une revue collégiale des fichiers FCS tout au long de l’étude.

Un haut niveau de standardisation et de fiabilité intercentre de la quantification des flux MRD est maintenu grâce à des formations éducatives régulières en ligne dans le groupe de flux. Au moins une session de formation web par mois a été réalisée, et plus de 100 cas de quantification MRD LAIP/DfN, MRD LSC ou LSC diagnostique ont été discutés et examinés au cours de ces années. Cette formation continue est importante car l’interprétation des données de flux nécessite un biologiste hautement qualifié, en particulier pour les MRD de faible niveau, les populations de fond physiologique, la régénération de la moelle et les commutateurs phénotypiques sous traitement.

La quantification des populations enrichies en LSC en CD34⁺CD38⁻ est une autre étape cruciale. Il n’existe pas de marqueur universel pour capturer les cellules souches hématopoïétiques normales ou les CSL. Le groupe HOVON a introduit la surveillance des CSL dans le diagnostic et le suivi des LMA à l’aide d’un panel à 8 couleurs incluant un ensemble de marqueurs « dichotomiques » pertinents^{des CSL 3}. Les marqueurs dichotomiques sont définis comme ne présentant aucune expression dans les cellules souches hématopoïétiques normales mais une expression positive dans les populations enrichies en LSC, avec des motifs faibles, intermédiaires, élevés, hétérogènes ou bimodaux. Il est intéressant d’inclure un mélange de marqueurs dichotomiques spécifiques de LSC, tels que CLL1, TIM3 et CD97, dans un seul canal, car si un seul est positif, des cellules enrichies en LSC peuvent tout de même être détectées. D’autres marqueurs doivent être utilisés séparément dans des canaux spécifiques car leur expression peut chevaucher celle des cellules souches hématopoïétiques normales, selon l’état de la moelle osseuse, y compris la moelle²⁴ en régénération ou stressée. La définition complète des cellules enrichies en LSC repose sur des opérateurs booléens, incluant l’expression aberrante des marqueurs dans la fraction CD34⁺CD38⁻ . Puisque cela reste une définition phénotypique, la population doit être interprétée comme des cellules enrichies en LSC CD34⁺CD38⁻ plutôt que comme des LSC fonctionnellement prouvés dans chaque échantillon. Ce panel LSC est également applicable aux patients atteints de MDS avec excès de blastocystes et de MRC AML utilisant le même protocole.

Modifications et dépannage de la méthode

Lors de l’évolution des plateformes et des panneaux, l’approche de standardisation/harmonisation doit être maintenue au sein du réseau de laboratoires, notamment lors du passage des panneaux 8 à 10 couleurs aux panneaux 12 à 13 couleurs. Avec l’évolution des machines, il est nécessaire de maintenir une colonne vertébrale commune d’anticorps et la même sensibilité dans la détection des anomalies phénotypiques tout au long des études cliniques. Lors de l’évolution de la plateforme, les fluorochromes des anticorps dans la colonne vertébrale restent stables et communs à toutes les machines (CD34/CD38/CD45/CD117). Cependant, pour certains canaux, un changement de fluorochromes est nécessaire en raison de la banque optique spécifique à la machine, qui nécessite une approche d’harmonisation. Lors du passage d’un cytomètre détecteur PMT à un cytomètre détecteur APD, il faut prendre en compte la sensibilité élevée des détecteurs APD à hautes longueurs d’onde. Par conséquent, dans certains cas, le choix des fluorochromes pour certains anticorps doit être ajusté afin de maintenir le même indice de coloration et d’éviter une propagation excessive entre les canaux, adoptant ainsi une approche d’optimisation. Les cytomètres cliniques actuels prennent en charge des panels de 12 à 13 couleurs, ce qui augmente la spécificité dans la détection du LAIP et améliore l’interprétation grâce à l’ajout de marqueurs éliminant les cellules contaminantes dans la porte MRD. Cependant, cela augmente également la complexité de^{l’analyse 23}.

La mise à niveau des panneaux 8 à 12 couleurs a amélioré la sensibilité et la spécificité de l’évaluation MRD dans certains cas (Fichier Supplémentaire 1). Dans le tube 1, HLA-DR, CD36, CD10 et CD56 ont été ajoutés, séparés du CD7. Dans le tube 2, HLA-DR, CD36, CD200 et CD19 ont été ajoutés. Dans le tube 3, CD4, CD64, CD38, CD36 et CD14 ont été ajoutés. HLA-DR, désormais systématiquement combiné avec CD38 dans chaque tube, fournit une définition plus claire du LAIP et des schémas de différenciation modifiés. CD36, désormais systématiquement inclus dans chaque tube, est un marqueur clé pour identifier les érythroblastes, globules rouges, plaquettes et débris, ainsi que pour affiner la porte finale MRD. Le CD19 dans la sonde LSC aide également à identifier les hématogones. La combinaison des marqueurs de différenciation des monocytes et des granulocytes dans un seul tube permet une meilleure délimitation des schémas de différenciation monocytaires et granulocytaires et aide à distinguer les aberrances pour identifier les LAIP. Lors du passage des panneaux 8 à 10 couleurs, l’amélioration principale est venue de la détection LAIP, notamment avec l’ajout de HLA-DR et CD56 séparés de CD7 dans le tube 1, HLA-DR et CD19 dans le tube 2. En passant des panneaux 10 à 12 couleurs, l’amélioration est venue d’un meilleur nettoyage des grilles de souffle et LSC avec l’ajout du CD36 dans chaque tube, complété par le CD10 dans le tube 1 et le CD200 dans le tube 2. Cela était particulièrement utile pour les patients présentant une MRD de faible intensité au-delà de la limite de détection mais en dessous de la limite de quantification. Pris dans leur ensemble, la plupart des patients présentant une positivité MRD au seuil clinique ≥ 0,1 % étaient déjà identifiés avec le panel à 8 couleurs ; cependant, l’utilisation plus grande de marqueurs dans les tubes a amélioré la spécificité et l’interprétation de l’évaluation des MRD, en particulier pour les MRD de faible intensité comme mentionné dans les recommandations ELN 2025.

Limites de la méthode

Choisir une approche multicentrique peut être un défi. La faisabilité de ce concept nécessite des étapes obligatoires avant la mise en œuvre du flux MRD dans les essais cliniques AML : harmonisation de la sensibilité des instruments et de la préparation des échantillons, ainsi que formation et éducation systématique pour les opérateurs^{analytiques 25}. À mesure que les plateformes évoluent, la stratégie multicentre et multiplateforme doit être adaptée afin de maintenir la robustesse et la reproductibilité des résultats. Cela inclut la standardisation, l’utilisation du même panneau et des mêmes réglages pour le même type de plateforme ; l’harmonisation, utilisant le même panneau sur plusieurs plateformes avec des réglages harmonisés ; et l’optimisation, utilisant un panneau et des réglages spécifiques adaptés à chaque plateforme.

L’hémodilution est l’un des points les plus difficiles et critiques pour la quantification des flux de MRD. La formule de représentativité CD34/WBC décrite dans ce protocole doit être utilisée comme mesure complémentaire de contrôle qualité pour l’échantillon de moelle osseuse et ne doit pas être utilisée pour normaliser les résultats de MRD. Son interprétation peut être influencée par la régénération de la moelle, les effets du traitement, la maladie résiduelle et des schémas moins intensifs. De même, des marqueurs tels que CD56, CD123 et CD45RA ne doivent pas être interprétés comme des marqueurs DfN ou LSC autonomes. Ils doivent être interprétés dans l’ensemble de la stratégie de portail, des barrières de nettoyage, des références de la moelle osseuse et du contexte clinique.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes ou alternatives

Selon les directives ELN 2025, la MRD est un marqueur pronostique majeur chez les patients atteints de LMA, quelle que soit la technique ou le moment de l’évaluation. L’utilisation de différentes techniques et marqueurs de flux MRD est très complémentaire. La MRD multimodale, incluant l’analyse LAIP/DfN et LSC, est utile à condition que l’analyse soit réalisée au sein d’un réseau standardisé avec un rapport harmonisé des résultats. L’évaluation MRD permet une meilleure définition de la réponse thérapeutique et de la rechute. Le flux multicentrique et multimodal de MRD, ainsi que la MRD moléculaire, joueront un rôle stratégique dans les futurs essais cliniques dans un paysage thérapeutique de plus en plus complexe qui inclut de nouvelles thérapies ciblées, des traitements de première et deuxième ligne, des transplantations allogéniques et des thérapies à faible intensité.

Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques

Les groupes HOVON et ALFA ont rapporté que la quantification des populations enrichies en LSC CD34⁺CD38⁻ au diagnostic de LMA a un impact clinique (Fichier Supplément 1). Il semble crucial de définir des seuils cliniquement significatifs pour les CSL en fonction de la méthode de quantification. Comme précédemment rapporté avec la méthode décrite ici, un seuil de LSC de ≥1 % était associé à un résultat défavorable (Fichier Supplémentaire 1)²⁶. Dans la prise en charge de la LMA, l’intégration différentielle de la MRD, du suivi des LSC et de l’hématopoïèse clonale peut aider à affiner l’interprétation thérapeutique. Le principal défi réside dans la distinction entre la MRD, qui peut nécessiter un traitement supplémentaire, des clones pré-leucémiques stables, qui peuvent ne pas être²⁷. Un système intégré de déclaration pour calculer le pourcentage de blastocystes a récemment été recommandé pour le suivi de la LBA dans les directives EHA/ELN 2025²⁸. Il intègre les résultats de la MRD avec la comparaison morphologique pour une évaluation harmonisée des blasts et devrait faciliter un rapport cohérent dans les essais cliniques afin de définir les catégories de réponse chez les patients atteints de LMA.

L’étude HOVON et l’étude ALFA/FILO BIG1 montrent qu’un score combinant les approches LAIP/DfN et LSC a permis de classer les patients en quatre groupes : ^LAIP−/^LSC−, ^LAIP+/^LSC−, ^LAIP−/^LSC+, et ^LAIP+/^LSC+, avec des taux de survie globaux différents^{sur 3 ans 3,26,29}. Dans l’ensemble, ces résultats illustrent l’impact clinique pronostique du statut combiné MRD LAIP/DfN et LSC. Dans le contexte de la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques, la présence de cellules enrichies en LSC CD34⁺CD38⁻ a également été rapportée comme un indicateur d’échec post-transplantation, même lorsque le nombre total de blastocystes est inférieur à 5 ^%30. Ces données cliniques confirment la pertinence des stratégies combinées de flux MRD, mais le protocole actuel se concentre sur la standardisation du flux de travail technique et des rapports entre les centres.

En perspective, la technologie du flux spectral pourrait élargir le panel de marqueurs testés simultanément dans une approche de cytométrie en flux multidimensionnel, augmentant ainsi la spécificité des LAIP surveillés et réduisant le bruit de fond biologique lié à la régénération hématopoïétique. L’évaluation de la reproductibilité des flux spectraux entre plateformes, panneaux et centres, comme proposé ici, sera un défi pour la mise en œuvre clinique. De nouveaux algorithmes d’analyse non supervisée, incluant FlowSOM, t-SNE et UMAP, pourraient faciliter la distinction entre l’hématopoïèse normale et le compartiment leucémique, de la fraction enrichie en LSC CD34⁺CD38⁻ jusqu’à la masse blastocysteuse. Capturer plus en profondeur les fractions de LSC pourrait aider à améliorer la surveillance de l’engraftement dans les modèles de xénogreffes dérivés des^{patients 31,32}. Des groupes de travail ELN ont été créés pour valider et harmoniser ces nouvelles^{approches 33,34}.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500