Imagerie à deux photons en temps réel du métabolisme endothélial du NAD+ cérébral chez la souris

Résumé

Ce protocole permet la surveillance en temps réel du métabolisme des dinucléotidiques de nicotinamide adénine dans l’endothélial du cerveau chez des souris vivantes grâce à l’expression de biocapteurs ciblant l’endothélial, la préparation à la fenêtre crânienne et l’imagerie à deux photons.

Résumé

Nous présentons un flux de travail reproductible pour la visualisation en temps réel des réponses biosensoriles du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺) dans les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales chez des souris vivantes, à l’aide d’une microscopie à fenêtre crânienne à deux photons et d’un capteur fluorescent ^NAD+ ciblé par l’endothélial. Le protocole comprend (1) l’expression sélective du capteur NAD⁺ médiée par le virus adéno-associé (AAV) dans l’endothélium cérébrovasculaire utilisant AAV-X1.1 sous le promoteur Cdh5 (cadherine endothéliale vasculaire), (2) la préparation chirurgicale d’une fenêtre crânienne corticale stable de 3 mm × 3 mm, et (3) l’imagerie à deux photons à double longueur d’onde pour capturer simultanément le signal vert du canal capteur excité à 920 nm et le tétramétylrhodamine intravasculaire (TMR)–dextrane excité à 1040 nm canal de référence. Le canal TMR–dextran fournit une référence luminaire vasculaire et soutient la sélection des vaisseaux, l’évaluation du mouvement et l’évaluation de l’intégrité vasculaire. À titre d’exemple d’application, nous décrivons les modifications associées à la nicotinamide mononucléotide dans la fluorescence des canaux sensoriels endothéliaux après avoir bu de l’eau, une prise orale-gavage ou une administration intraveineuse. Ce protocole met l’accent sur les étapes critiques, les considérations recommandées sur le dosage viral et le titre, le dépannage et les stratégies d’analyse quantitative, permettant aux laboratoires de mettre en œuvre une surveillance in vivo de la dynamique des canaux biosenseurs de ^NAD+ cérébrovasculaire pour des études du neurométabolisme en santé et en maladie. 

Introduction

Le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺) est un cofacteur central pour l’équilibre redox, l’activité mitochondriale, la réparation de l’ADN et la signalisation sensible au stress. Dans la vasculature cérébrale, l’homéostasie endothéliale ^NAD+ est de plus en plus reconnue comme un régulateur actif de l’intégrité de la barrière, du tonus vasculaire et du couplage neurovasculaire, plutôt que comme un affichage métabolique^{passif 1}. La perturbation du métabolisme endothélial du ^NAD+ a été liée à une fuite de barrière hémato-encéphalique (BBB) associée au vieillissement et à une homéostasie neurovasculaire altérée, soulignant la nécessité de méthodes capables de résoudre directement la dynamique métabolique endothéliale dans le tissu cérébral^{vivant 2}.

La plupart des approches actuellement utilisées pour quantifier le ^NAD+ reposent sur des mesures biochimiques d’extrémité, la coloration des tissus fixes ou les lectures ex vivo des capteurs. Bien qu’informatives, ces approches ne préservent pas l’architecture microvasculaire intacte, ne peuvent pas facilement distinguer les changements rapides à l’intérieur de l’animal au fil du temps, et offrent une spécificité limitée des types cellulaires lorsqu’elles sont appliquées à des tissus cérébraux hétérogènes. En revanche, l’imagerie crânienne chronique à deux photons par fenêtre crânienne permet la visualisation répétée des microvaisseaux corticaux chez des souris vivantes à haute résolution spatiale et temporelle, ce qui la rend bien adaptée à la surveillance des signaux endothéliaux métaboliquement réactifs dans le cadre d’interventions physiologiques ou pharmacologiques^{définies 3,4,5}.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail de bout en bout pour la surveillance en temps réel de la dynamique endothéliale du ^NAD+ cérébral in vivo. La méthode combine la délivrance systémique d’un capteur ^NAD+ à base de protéines fluorescentes vertes améliorées (eGFP) ciblant endothélialement, emballé dans le virus adéno-associé (AAV)-X1.1 et piloté par le promoteur Cdh5, une fenêtre crânienne stable de 3 mm × 3 mm pour l’accès optique ^6,7,8, et l’imagerie à deux photons à double longueur d’onde avec un canal de référence intravasculaire tétraméthylrhodamine (TMR)–^{dextran 1}. Le mécanisme du capteur a été clarifié comme suit : Cambronne et al. Le biocapteur cytoplasmique ^NAD+ LigA-cpVenus est un capteur à réponse inverse basé sur cpVenus. La liaison ^NAD+ réduit la fluorescence de type cpVenus/eGFP dans la lecture d’excitation standard de 488 nm, tandis qu’un canal d’excitation de 405 nm sert de référence pour la normalisation ratiométrique. Par conséquent, la fluorescence verte brute ne doit pas être interprétée comme une mesure positive directe de la concentration de NAD⁺. Dans cette mise en œuvre à deux photons, l’excitation de 920 nm est utilisée pour acquérir le signal vert du canal capteur, tandis que l’excitation de 1040 nm est utilisée pour le canal de référence vasculaire TMR–dextran ; Ainsi, l’acquisition actuelle de 920/1040 nm n’est pas équivalente à une mesure ratiométrique calibrée de 488/405 nm. Le biocapteur Cambronne et al. a été sélectionné car il a été largement validé pour surveiller la dynamique intracellulaire du ^NAD+ et est compatible avec la configuration actuelle d’imagerie à double longueur d’onde. Bien que des indicateurs plus récents comme FiNad proposent des approches alternatives pour surveiller la dynamique de ^NAD+, leur mise en œuvre nécessiterait une modification du canal de fluorescence rouge actuellement utilisé pour le marquage de référence vasculaire TMR–dextrane. Le capteur de Cambronne rapporte des variations relatives de la disponibilité de ^NAD+ dans une plage dynamique finie et a été validé dans des applications cellulaires et subcellulaires ; cependant, l’interprétation du signal peut être influencée par le niveau d’expression, le pH, le photoblanchiment et la variabilité du chemin optique, et la quantification absolue du ^NAD+ nécessite un étalonnage ou une validation biochimique orthogonale. AAV-X1.1 a été sélectionné car des variants endothéliaux-tropiques d’AAV ont été rapportés comme transduisant efficacement la vascularisation du système nerveux^{central 6,7}. Dans notre comparaison préliminaire de plusieurs sérotypes AAV, dont AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT et AAV-X1.1, en utilisant une expression améliorée de protéines fluorescentes vertes alimentées par CAG ou Cdh5 comme rapporteur, AAV-X1.1 a produit le schéma d’expression associé aux vasculaires le plus favorable parmi les sérotypes testés. Le promoteur Cdh5 a ensuite été utilisé pour restreindre davantage l’expression des transgènes aux cellules endothéliales vasculaires, conformément aux rapports précédents montrant une expression sélective endothéliale in^{vivo 6}.

Comparée aux tests NAD+ ex vivo, cette approche préserve le réseau vasculaire intact, permet des mesures longitudinales sur le même animal et permet une évaluation simultanée des signaux métaboliques endothéliaux ainsi qu’une référence luminaire vasculaire. Ce flux de travail est particulièrement utile pour les études sur le vieillissement, le stress inflammatoire, le dysfonctionnement de la BBB et les réponses rapides à des interventions métaboliques telles que l’administration de mononucléotides de nicotinamide (NMN⁾ 9,10,11,12,13. Cette méthode est particulièrement appropriée lorsque la question expérimentale nécessite une visualisation répétée des microvaisseaux corticaux chez des souris vivantes et des modifications relatives d’un signal du canal capteur endothélial. Il est moins adapté à la quantification absolue du ^NAD+ sans étalonnage ratiométrique supplémentaire ni validation biochimique. Les limitations pratiques incluent l’accessibilité optique corticale, les contraintes de profondeur d’imagerie, la dépendance à une transduction endothéliale AAV réussie, une inflammation potentielle associée à la fenêtre crânienne, et la nécessité d’un microscope à deux photons à double longueur d’onde. L’implantation crânienne chronique de la fenêtre crânienne peut induire une inflammation locale, une réactivité vasculaire, une gliose, une opacité ou un remodelage tissulaire, qui peuvent tous influencer la physiologie endothéliale et les mesures des canaux ^{sensoriels 1,3,4}. Pour minimiser ces facteurs de confusion, le protocole exige une chirurgie aseptique, des forages intermittents avec refroidissement fréquent, une hémostasie soignée, l’évitement du contact adhésif avec la dure-mère, une analgésie postopératoire, un suivi quotidien et l’exclusion des animaux présentant une opacité persistante, des débris inflammatoires, des infections, une morphologie vasculaire instable ou une faible stabilité du signal de base.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université des sciences de la santé et de la rééducation dans le cadre du projet intitulé « Étude mécanistique de l’observation métabolique basée sur la sonde métabolique de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique » (numéro d’approbation KFDX : N° 2023-1023). Effectuer toutes les interventions chirurgicales dans des conditions aseptiques et fournir des analgésies périopératoires ainsi que des soins de soutien conformément au protocole animal approuvé. Dans le flux de travail représentatif, administrez de la buprénorphine chlorhydrate (0,05–0,1 mg/kg, par voie sous-cutanée) avant ou immédiatement après l’opération, puis toutes les 8 à 12 heures pendant 24 à 48 heures selon les besoins. Récupérez les souris dans une cage réchauffée et surveillez-les jusqu’à ce que la posture normale, les mouvements spontanés et la respiration stable soient rétablis.

1. Aperçu expérimental

1. Utilisez des souris adultes C57BL/6J âgées de 10 à 12 semaines et pesant entre 23 et 25 g afin des expériences représentatives.
2. Maintenir les souris dans des conditions sans agents pathogènes spécifiques avec un cycle clair/obscur de 12 heures, une température ambiante de 22°C à 24°C, une humidité relative de 40 % à 60 %, et un accès à la nourriture et à l’eau à la libitum.
3. Acclimatez les animaux pendant au moins 7 jours avant les procédures.
4. Utilisez l’un ou l’autre sexe selon le plan expérimental. Rapportez le sexe, le nombre d’animaux et l’allocation des groupes pour chaque expérience. Le jeu de données d’imagerie représentatif présenté ici utilisait N = 3 souris.
5. Administrez d’abord un VA systémique et prévoyez une période d’expression de 3 à 4 semaines avant l’imagerie.
6. Effectuer une chirurgie de la fenêtre crânienne 3 à 5 jours avant l’imagerie.
7. Anesthésiez les souris le jour de l’imagerie, injectez TMR–dextran par voie intraveineuse, et réalisez des images après une circulation tracante adéquate.
8. Administrez la NMN selon le calendrier d’intervention sélectionné. Administrez une supplémentation en eau potable pendant 5 jours avant l’imagerie, effectuez une injection orale à l’intervalle prédéfini avant l’imagerie, ou administrez une NMN intraveineuse pendant la séance d’imagerie après l’acquisition au départ.
   REMARQUE : Mettez en pause le protocole après l’administration de l’AAV pendant la période d’expression de 3 à 4 semaines et maintenez les animaux sous surveillance de santé régulière et conditions de logement standard. Mettez le protocole en pause après une chirurgie de la fenêtre crânienne pendant la période de récupération de 3 à 5 jours. Avant de procéder à l’imagerie, confirmez un poids corporel stable, une soignance et une activité normales, l’absence d’infection ou d’inflammation excessive, ainsi qu’une fenêtre crânienne claire.

2. Chirurgie crânienne par fenêtre pour imagerie corticale longitudinale

1. Préparation pré-chirurgicale
   1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux et établissez un champ stérile avant l’induction de l’anesthésie.
   2. Réglez le système de chauffage homéotherme pour maintenir la température corporelle entre 36,5°C et 37,5°C, de préférence à l’aide d’un contrôleur de rétroaction à sonde rectale.
   3. Préparez le matériel de surveillance respiratoire et confirmez la stabilité de l’opération avant l’opération.
   4. Préparez du sérum physiologique stérile, des écouvillons absorbants, des matériaux hémostatiques, une housse en verre stérile n°1,5, une plaque métallique et du ciment dentaire avant de commencer la procédure.
   5. Utilisez une housse en verre stérile n°1,5 de taille pour couvrir complètement la fenêtre crânienne de 3 mm × 3 mm et placez-la bien alignée sur le rebord du crâne.
   6. Préparez une microperceuse à grande vitesse équipée d’une meule de 0,5 à 1,0 mm.
   7. Faites fonctionner la foreuse à environ la moitié de la vitesse maximale et assurez-vous qu’une irrigation stérile au sérum physiologique peut être appliquée immédiatement lors de l’amincissement du crâne.
   8. Appliquez une solution saline stérile à température ambiante avec un coton tige-coton ou un compte-gouttes pendant le forage pour refroidir le crâne et éliminer la poussière osseuse.
2. Anesthésie, préparation du cuir chevelu et exposition du crâne
   1. Anesthésiez les souris avec une solution de travail d’Avertin fraîchement préparée (1,25 %, 12,5 mg/mL) par injection intrapéritonéale à 200–250 mg/kg.
      1. Préparez la solution de travail Avertin à partir de 2,2,2-tribromoéthanol et 2-méthyl-2-butanol selon les procédures opérationnelles standard institutionnelles, protégez la solution de la lumière et jetez les préparations présentant des précipitations ou des décolorations.
   2. Confirmez un plan chirurgical stable par la perte du réflexe de retrait des pédales et une respiration stable.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux immédiatement après l’induction de l’anesthésie.
   4. Si une anesthésie par inhalation est utilisée, induire une anesthésie contenant 3 % à 4 % d’isoflurane.
   5. Maintenir l’anesthésie avec 1 % à 2 % d’isoflurane en oxygène à 0,5 à 1,0 L/min et ajuster selon la respiration et les réflexes.
      ATTENTION : Manipulez les agents anesthésiques selon les procédures de sécurité institutionnelles et utilisez des systèmes de récupération appropriés lors de l’administration d’une anesthésie inhalatoire.
   6. Fixez la souris dans un cadre stéréotaxique ou un support de tête personnalisé qui offre un accès stable au crâne dorsal.
   7. Maintenez la température corporelle entre 36,5°C et 37,5°C à l’aide d’un coussin chauffant à rétroaction et d’une sonde rectale lorsque disponible.
   8. Raser le cuir chevelu et retirer les cheveux lâches du champ chirurgical.
   9. Désinfectez le cuir chevelu à l’aide d’une solution alternée de povidone-iode ou d’iodophore et d’éthanol à 70 % pendant trois cycles.
   10. Évitez de laisser entrer le désinfectant dans les yeux ou l’ouverture crânienne.
   11. Faites une incision au milieu du cuir chevelu et rétractez doucement la peau.
   12. Exposez suffisamment le crâne pour permettre à la fois la création de la fenêtre crânienne et la fixation de la plaque frontale.
   13. Retirez le périoste et le tissu conjonctif résiduel à l’aide de pinces fines ou d’une lame de scalpel.
   14. Séchez doucement le crâne avec des cotons-tiges stériles pendant environ 10 à 20 secondes jusqu’à ce que la surface paraisse mate plutôt que humide.
   15. Évitez une déshydratation excessive des tissus exposés.
3. Marquage d’une craniotomie de 3 mm × 3 mm
   1. Identifier le bregma et le lambda au microscope chirurgical.
   2. Utilisez ces repères anatomiques pour orienter la ligne médiane et cibler la région corticale.
   3. Marque un carré de 3 mm × 3 mm sur un hémisphère du cortex somatosensoriel dorsal.
   4. Positionner le bord antérieur à environ 0,5 mm postérieur à la bregme et le bord médial à environ 1,0 mm latéral à la ligne médiane.
   5. Évitez les points de suture crâniques majeurs et les gros vaisseaux de surface autant que possible.
4. Forage et retrait des lambes osseuses
   1. Affinez le crâne le long du périmètre marqué en utilisant un contact intermittent par forage plutôt qu’une pression continue.
   2. Appliquez du sérum stérile à plusieurs reprises lors du forage pour éviter les dommages thermiques.
   3. Administrez environ 20 à 50 μL de solution saline stérile par application, soit suffisamment pour garder la surface du crâne humide et fraîche.
   4. Répétez l’irrigation tous les 10 à 20 secondes ou chaque fois que de la poussière osseuse s’accumule ou que l’accumulation de chaleur est suspectée.
   5. Continuez à amincir jusqu’à ce que l’os devienne uniformément translucide et légèrement flexible.
   6. Confirmez un amincissement adéquat en observant les vaisseaux duraux visibles, la préservation des pulsations durales et l’absence de compression corticale ou de décoloration thermique.
   7. Arrêtez immédiatement de percer si une accumulation excessive de chaleur, des saignements ou une pulsation durale réduite survient.
   8. Irriguez la zone et réévaluez avant de continuer.
   9. Soulevez doucement le volet osseux d’un coin à l’aide de pinces fines ou d’une pointe d’aiguille.
   10. Réaffinez le périmètre si la résistance persiste.
   11. Préserver la dure-mère intacte lors du retrait du lambeau osseuse.
   12. Rincez la poussière osseuse avec du sérum physiologique stérile.
   13. Contrôlez les saignements mineurs grâce à une irrigation douce au sérum physiologique et des prélusoires absorbants.
   14. Considérez le saignement comme acceptable si cela disparaît dans les 1 à 2 minutes suivant l’irrigation et le contact absorbant avec un prélèvement.
   15. Excluez l’animal ou interrompez la procédure si le saignement persiste plus d’environ 5 minutes.
   16. Excluez l’animal ou interrompez la procédure si la dure-mère est déchirée, une compression corticale survient ou si le sang obstrue la zone d’imagerie.
       REMARQUE : La procédure peut être temporairement interrompue après une hémostasie complète et avant la pose du coverslip. Maintenez la dure-mère exposée dans un état humide à l’aide d’un sérum physiologique stérile et ne reprenez qu’après confirmation de l’absence de saignement actif.
5. Étanchéité des fenêtres et fixation de la plaque de tête
   1. Confirmez que la dure-mère exposée est propre, humide et exempte de saignements actifs.
   2. Placez une couverture stérile sur la craniotomie.
   3. Positionnez la couche de couverture sur le rebord du crâne entourant la craniotomie sans comprimer la dure-mère.
   4. Vérifiez le bon positionnement en confirmant une surface de couverture flush, l’absence de bulles d’air piégées, la préservation de la pulsation durale et un chemin optique dégagé.
   5. Préparez du ciment dentaire ou un adhésif Super-Bond de type C&B selon les instructions du fabricant.
      1. Pour la préparation représentative Super-Bond C&B, mélangez 1 cuillère de poudre avec 1 goutte de catalyseur et 4 gouttes de monomère dans un plat en céramique pré-refroidi maintenu à environ −20°C juste avant l’application.
   6. Appliquez de la colle uniquement autour du bord extérieur du crâne autour de la toile de revêtement.
   7. Évitez le contact adhésif avec la dure-mère et évitez le reculement capillaire sous le verre.
   8. Laissez durcir l’adhésif pendant environ 5 à 10 minutes à température ambiante.
      ATTENTION : Les composants du ciment dentaire et des adhésifs peuvent contenir des produits chimiques volatils ou irritants. Manipulez-les selon les procédures de sécurité institutionnelles et utilisez une ventilation appropriée.
   9. Placez une plaque de tête en titane personnalisée autour de la fenêtre crânienne.
   10. Utilisez une plaque frontale contenant une ouverture centrale d’environ 10 mm compatible avec le support de tête d’imagerie.
   11. Centrez la fenêtre crânienne dans l’ouverture de la plaque de tête.
   12. Appliquez du ciment dentaire uniquement sur les zones de contact du crâne en dehors de la fenêtre optique.
   13. Laissez le ciment durcir complètement pendant environ 5 à 10 minutes avant de déplacer l’animal.
6. Récupération post-opératoire et contrôle de la qualité des fenêtres
   1. Administrez des analgésiques postopératoires selon le protocole animal approuvé.
   2. Dans le flux de travail représentatif, administrez de la buprénorphine chlorhydrate à 0,05 à 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée toutes les 8 à 12 heures pendant 24 à 48 heures.
   3. Récupérer des souris dans une cage chauffée.
   4. Surveillez quotidiennement la respiration, la posture, les mouvements, le toilettage et le poids du corps.
   5. Acceptez les fenêtres crâniennes présentant une surface vitrée transparente, une vascularisation corticale visible, une dure-mère intacte, un minimum de sang résiduel, pas d’adhésif sous la toile de protection, aucune infection et une fixation stable sur la plaque de tête.
   6. Excluez les animaux présentant une opacité marquée, des saignements persistants, des débris inflammatoires, des infections, des déplacements de fenêtres, une perte de poids sévère (>15 %), ou un mauvais toilettage et activité.
   7. Procéder à l’imagerie après 3 à 5 jours de récupération.
   8. Confirmez une activité normale, un comportement de toilettage normal, un poids corporel stable, l’absence de douleur ou d’infection, ainsi qu’une fenêtre crânienne transparente avec des vaisseaux clairement visibles avant l’imagerie.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause pendant la période de récupération postopératoire. Maintenir les souris dans des conditions de logement standard, surveiller quotidiennement le poids corporel et la clarté des fenêtres, et ne reprendre l’imagerie qu’après que tous les critères de récupération ont été remplis.

3. Expression du capteur endothélial ^NAD+ médiée par AAV

1. Construction virale et préparation
   1. Utilisez un biocapteur ^NAD+ génétiquement codé à base d’eGFP/cpVenus, piloté par le promoteur endothélial Cdh5.
   2. Utilisez Cambronne et al. Séquence biosensorique cytoplasmique ^NAD+ LigA-cpVenus (par exemple, plasmide Addgene #186787 ou un insert équivalent vérifié par séquence).
   3. Clonez le promoteur Cdh5 en amont de la séquence codante du biocapteur NAD⁺ en utilisant la dorsale vectorielle CV232.
   4. Emballez la cassette d’expression dans la capside AAV-X1.1 comme une préparation virale personnalisée.
      1. Notez le fournisseur de production virale, la méthode de purification, la méthode de quantification du génome viral, le numéro de lot de production et le certificat d’analyse pour chaque préparation AAV.
   5. Enregistrer la carte plasmidique, les résultats de vérification de séquence, les informations sur la production virale, les informations de purification, le titre du génome viral et le certificat d’analyse pour chaque préparation virale.
      1. Enregistrer la carte des constructs, le rapport de vérification de séquence, le numéro de lot de production virale, le rapport de titrage quantitatif de la réaction en chaîne de la polymérase (qPCR), la documentation de purification et le certificat d’analyse pour chaque préparation virale utilisée dans l’étude.
   6. Consultez le tableau des matériaux pour tous les détails sur les constructions.
   7. Utilisez des préparations AAV à haut titre avec des titres qPCR spécifiques à lot généralement supérieurs à 2 × 10^{à 13} vg/mL.
   8. Stockez les aliquotes à usage unique à −80°C.
   9. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
   10. Enregistrez le lot de production, le titre qPCR, la durée de stockage et la variation acceptable d’un lot à l’autre avant utilisation.
2. Administration systémique des AAV
   1. Dégelez une aliquote virale sur la glace.
   2. Diluez le virus dans une solution stérile tamponnée phosphate (PBS) jusqu’à un volume d’injection final de 100 à 200 μL par souris.
   3. Maintenir une dose finale de 2 × 10 ๲ vg par souris sur les animaux.
      1. Calculez le volume d’injection à partir du titre du génome viral spécifique au lot. Pour la préparation représentative avec un titre qPCR de 1,39 × 10¹³ vg/mL, injectez environ 144 μL pour administrer une dose de 2 × 10¹² vg par souris.
   4. Administrez le virus par injection veineuse rétro-orbitaire à l’aide d’une seringue d’insuline stérile de 29 G.
   5. Injectez la suspension virale lentement sur environ 10 à 20 s.
   6. Confirmez l’accouchement réussi en vérifiant l’absence de fuite, de saignements excessifs et de blessures oculaires.
   7. Validez et signalez séparément toute voie administrative alternative.
   8. Observez la souris jusqu’à ce que la posture normale et les mouvements spontanés soient rétablis.
   9. Confirmez la respiration stable et l’absence de saignement ou de détresse.
   10. Ne ramenez l’animal dans sa cage d’origine qu’après une récupération complète.
   11. Prévoyez 21 à 28 jours pour l’expression des capteurs avant l’imagerie.
   12. Maintenir un intervalle d’expression cohérent au sein de chaque ensemble de comparaison.
   13. Validez séparément les intervalles d’expression en dehors de la plage de 21 à 28 jours.
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause pendant la période d’expression AAV. Maintenir un entretien régulier et une surveillance de la santé, et procéder à la chirurgie de la fenêtre crânienne seulement après que l’intervalle d’expression prévu soit écoulé et que l’animal soit en bonne santé.
3. Validation de la restriction endothéliale
   1. Criblez les animaux avant la collecte formelle des données.
   2. Accepter les animaux lorsque le signal vert du canal capteur est détectable et suit le réseau vasculaire.
   3. Confirmez que le signal est enrichi le long des parois du vaisseau adjacentes au lumen TMR–dextran–positif.
   4. Confirmez l’absence de fluorescence parenchymatose diffuse dominante.
   5. Appliquer des critères d’acceptation identiques à tous les groupes expérimentaux.
   6. Percer les souris avec PBS suivies de 4 % de paraformodéhyde lorsque la validation post-hoc est requise.
   7. Prélever le cerveau et préparer des coupes coronales ou sagittales de 30 à 40 μm.
   8. Sections de coloration avec des marqueurs endothéliaux tels que la lectine tomate, CD31 ou la cadherine endothéliale vasculaire (VE-cadherine).
      1. Notez la source de l’anticorps, le numéro de catalogue, le numéro de lot, l’espèce hôte, la dilution, les conditions d’incubation et la méthode de détection pour chaque expérience de validation.
   9. Évaluer l’expression de nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) et de poly(ADP-ribose) polypolymérase 1 (PARP1) lorsque nécessaire.
   10. Utilisez des dilutions à anticorps primaires optimisées pour la préparation tissulaire.
   11. Acquérez des images fluorescentes ou confocales en utilisant des réglages d’acquisition identiques entre groupes.
   12. Quantifier la colocalisation comme la fraction de signal capteur positif qui chevauche ou est immédiatement adjacente aux régions positifs aux marqueurs vasculaires.
   13. Excluez les animaux lorsque le signal le plus détectable se trouve à l’extérieur des structures vasculaires.
   14. Excluez les animaux lorsque l’enrichissement de la paroi du récipient est absent.
   15. Excluez les animaux lorsque la fluorescence parenchymatose hors cible empêche une sélection fiable de la région d’intérêt.
   16. Excluez les animaux lorsque la fluorescence des canaux capteurs est saturée ou instable lors de l’acquisition de base.

4. Imagerie à deux photons et analyse quantitative

1. Préparation du jour d’imagerie et étiquetage de référence intravasculaire
   1. Anesthésiez les souris avec une solution de travail Avertin fraîchement préparée (1,25 %, 12,5 mg/mL) par injection intrapéritonéale à 200–250 mg/kg, ou utilisez le schéma anesthésique approuvé par le protocole animalier institutionnel.
   2. Confirmez un plan chirurgical stable par perte de retrait des pédales et une respiration stable.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique immédiatement après l’induction.
   4. Si une anesthésie par inhalation est utilisée, induire une anesthésie contenant 3 % à 4 % d’isoflurane.
   5. Maintenir l’anesthésie avec 1 % à 2 % d’isoflurane en oxygène à 0,5 à 1,0 L/min et ajuster selon la respiration et les réflexes.
   6. Préparez 70 kDa TMR–dextran dans un PBS stérile à 10–25 mg/mL.
   7. Protéger la solution TMR–dextran de la lumière et filtrer la solution si la pratique institutionnelle l’exige.
   8. Injectez TMR–dextran par voie intraveineuse à 20 mg/kg.
   9. Ajustez le volume d’injection selon la concentration d’origine. Pour une souris de 25 g, administrez environ 0,5 mg de colorant au total.
   10. Préparez le traceur propre ou stockez les aliquotes à l’abri de la lumière selon les recommandations du fabricant.
   11. Laissez TMR–dextran circuler pendant 5 à 10 minutes avant l’acquisition de l’image.
2. Configuration du microscope
   1. Utilisez un microscope à deux longueurs d’onde et deux photons configuré pour une excitation à 920 nm du canal capteur basé sur l’eGFP.
   2. Utilisez un chemin d’excitation de 1040 nm pour le canal de référence vasculaire TMR–dextran.
   3. L’imagerie représentative a été réalisée sur un microscope multiphotonique Nikon A1 MP/A1R MP+ contrôlé par le logiciel d’analyse AR/AR NIS Elements (version 5.42.06).
   4. Enregistrez les sources laser, les paramètres d’impulsion, la configuration des combinaisons de faisceaux, le type de détecteur et la version logicielle pour chaque système d’imagerie.
   5. Configurez les canaux de détection pour séparer le signal du canal capteur du signal TMR–dextrane.
   6. Utilisez des détecteurs à tube photomultiplicateur non déscanné (PMT) ou des détecteurs au phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP).
   7. Collecter l’émission verte du canal capteur entre environ 500 et 550 nm.
   8. Collecter l’émission TMR–dextran entre environ 570 et 650 nm.
      1. Dans l’ensemble de données représentative, collectez l’émission verte du canal capteur à l’aide d’un filtre d’émission 525/50 nm et collectez l’émission TMR–dextran à l’aide d’un filtre d’émission 575/25 nm ou 610/75 nm.
   9. Minimiser le passage spectrale entre les canaux.
   10. Maintenir les réglages de gain et de décalage du détecteur constants dans chaque ensemble de comparaison.
   11. Vérifiez la séparation des canaux en utilisant des contrôles monocanal lorsque disponibles.
   12. Utilisez un objectif d’immersion dans l’eau Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 ou équivalent (25×, ouverture numérique 1,10, distance de travail 2,0 mm).
   13. Confirmez la co-enregistrement du canal en utilisant des repères vasculaires fixes tels que les bifurcations et les bords de la lumière.
   14. Répétez la vérification de co-enregistrement après tout ajustement du chemin optique.
   15. Mesurez la puissance du laser au niveau du plan échantillon avant l’imagerie.
   16. Maintenir une constante de puissance laser de 920 nm dans chaque ensemble de comparaison.
   17. Maintenir une constante de puissance laser de 1040 nm dans chaque ensemble de comparaison.
   18. Utilisez environ 10 à 20 mW à 920 nm et 8 à 18 mW à 1040 nm comme plages de travail représentatives.
   19. Ajustez la puissance du laser selon la profondeur d’imagerie et la qualité de la fenêtre crânienne.
   20. Excluez les champs présentant une perte de signal supérieure à 20 % durant la période de référence de 120 s.
   21. Excluez les champs montrant des changements phototoxiques visibles.
3. Paramètres d’acquisition
   1. Sélectionnez des champs de vision avec une fenêtre optique claire, des micro-vaisseaux nettement focalisés et un mouvement minimal.
   2. Acceptez les fenêtres avec une housse transparente, un vasculaire cortical visible, une dure-mère intacte, un minimum de sang résiduel, pas d’adhésif sous la goulotte, aucune infection, et une fixation stable de la plaque frontale.
   3. Excluez les animaux présentant une opacité marquée, des saignements persistants, des débris inflammatoires, des infections, des déplacements de fenêtres, une perte de poids sévère (>15 %), ou un toilettage/activité insuffisante.
   4. Acquérir des images en accéléré à 512 × 512 pixels.
   5. Acquérir des images fixes représentatives à 1024 × 1024 pixels lorsque des détails spatiaux plus élevés sont nécessaires.
   6. Maintenez la taille des pixels, le zoom, la vitesse de balayage et le champ de vision constants dans chaque ensemble de comparaison.
   7. Acquérir des piles z en utilisant une taille de pas de 1 à 3 μm.
   8. Imagez les microvaisseaux corticaux à des profondeurs d’environ 200 à 250 μm sous la surface piale.
   9. Étendre la profondeur d’imagerie à environ 400 μm lorsque la qualité des fenêtres le permet.
   10. Maintenez la profondeur d’imagerie constante pour les comparaisons par paires.
   11. Obtenez une base de 120 s à intervalles de 1 s avant les interventions aiguës.
   12. Poursuivre l’acquisition pendant la période post-intervention prédéfinie.
   13. Enregistrer les réponses NMN par voie intraveineuse pendant environ 10 à 30 minutes après l’injection.
   14. Acquérir des ensembles de données d’eau potable et de bavardage oral à des points expérimentaux prédéfinis.
   15. Maintenez les mêmes paramètres d’acquisition pour tous les groupes de comparaison.
4. Intervention NMN (exemple d’application)
   1. Dissoudre le NMN dans de l’eau stérile.
   2. Ajustez la concentration de NMN pour délivrer environ 100 mg/kg/jour.
   3. Protège la bouteille de la lumière.
   4. Remplacez l’eau potable contenant des NMN toutes les 24 à 48 heures.
   5. Surveillez la consommation d’eau en utilisant des mesures de poids en bouteille.
   6. Calculez l’apport estimé en NMN en utilisant la consommation d’eau et le poids corporel.
   7. Poursuivez la supplémentation pendant 5 jours avant l’imagerie.
   8. Préparez la NMN à 1 mg/mL pour la prise orale.
   9. Administrez 200 μL par souris à l’aide d’une aiguille à pointe arrondie de 38 mm de 20G.
   10. Réalisez des images 30 à 60 minutes après la gage.
   11. Préparez un NMN à 1 mg/mL pour l’accouchement intraveineux.
   12. Injectez 100 μL par souris à travers le sinus veineux rétro-orbitaire ou la veine caudale.
   13. Administrez l’injection lentement pendant 10 à 20 secondes.
   14. Commencez l’imagerie immédiatement ou dans les 5 minutes suivant l’injection.
   15. Obtenez des jeux de données sur l’eau potable après 5 jours de supplémentation.
   16. Acquérir des ensembles de données orales de gavage à un moment fixe post-gavage.
   17. Prenez une base juste avant l’injection intraveineuse.
   18. Enregistrer les réponses aiguës pendant environ 10 à 30 minutes après l’injection intraveineuse.
5. Traitement d’image et extraction de signaux
   1. Effectuer la correction de mouvement lorsque des artefacts de mouvement sont présents.
   2. Utilisez Fiji/ImageJ (version 1.8.0 ou ultérieure) avec StackReg, TurboReg ou un algorithme d’enregistrement rigide équivalent.
   3. Utilisez les repères vasculaires du canal TMR–dextran pour guider l’enregistrement.
   4. N’accepter les jeux de données que lorsque le déplacement résiduel est inférieur à environ 1 à 2 pixels après correction.
   5. Confirmez que les limites de la région vasculaire d’intérêt (ROI) restent stables tout au long de l’acquisition.
   6. Utilisez le canal TMR–dextran pour segmenter les lumens du vaisseau.
   7. Définissez les ROI endothéliaux immédiatement adjacents à la lumière.
   8. Sélectionnez des microvaisseaux avec un marquage lumineux stable, un mouvement minimal et un signal visible sur le canal capteur.
   9. Analysez des diamètres de vaisseaux d’environ 5 à 80 μm.
   10. Définissez les ROI endothéliaux comme des régions associées à la paroi vaisseau d’environ 2 à 5 μm de large.
   11. Analysez 3 à 5 navires par champ de vision lorsque disponible.
   12. Analysez 1 à 3 champs de vision par souris lorsque disponibles.
   13. Définir les ROI de fond dans les régions tissulaires dépourvues de signal traceur et capteur.
   14. Placez les ROI de fond à au moins 20 μm des vaisseaux analysés et des artefacts d’images.
   15. Soustrayons l’intensité moyenne de fond de chaque canal avant la normalisation.
   16. Appliquez la même stratégie de soustraction de fond à tous les échantillons.
   17. Extraire les valeurs moyennes d’intensité des séries temporelles pour F_sensor(t).
   18. Extraire les valeurs moyennes d’intensité des séries temporelles pour F_ref(t).
   19. Effectuer des mesures en utilisant l’analyse AR/AR (NIS-elements) ou Fiji/ImageJ.
   20. Exportez les fichiers image bruts en fichiers ND2.
   21. Exportez des copies d’analyse sous forme de piles TIFF 16 bits lorsque cela est possible.
   22. Exportez les données de séries temporelles ROI sous forme de fichiers CSV.
   23. Calculer les valeurs de fluorescence soustraites en fond avant la normalisation.
   24. Calculer ΔF/_{F 0} en utilisant ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Définissons F₀ comme le signal moyen pendant la période de référence de 120 s.
   26. Calculez la normalisation de référence vasculaire en F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Signalez la variation de pic, le temps jusqu’au pic, la surface sous la courbe et la cinétique de récupération lorsque la durée d’acquisition le permet.
   28. N’interprétez pas le signal du canal capteur de 920 nm comme une concentration calibrée de NAD⁺ .
   29. Effectuer des calibrations ratiométriques supplémentaires ou une validation biochimique lorsque des mesures quantitatives de ^NAD+ sont requises.
6. Statistiques et rapports
   1. Définissons la souris comme l’unité expérimentale biologique.
   2. Mesurez en moyenne au niveau du vaisseau dans chaque souris avant une analyse au niveau du groupe ou appliquez un modèle statistique imbriqué.
   3. Utilisez des tests t à deux queues appariés pour des comparaisons normalement distribuées à l’intérieur de la souris.
   4. Utilisez les tests de rang signé par paires de Wilcoxon lorsque les hypothèses de normalité ne sont pas remplies.
   5. Utilisez des modèles ANOVA à mesures répétées ou des modèles à effets mixtes pour des analyses impliquant plus de deux affections apparentées.
   6. Appliquez les corrections appropriées par comparaison multiple.
   7. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de GraphPad Prism ou d’un logiciel équivalent.
   8. Définissez la signification statistique comme p < 0,05.
   9. Indiquez le test statistique exact dans chaque légende de figure.
   10. Codez les fichiers image avant la sélection et la quantification du ROI lorsque c’est possible.
   11. Maintenir l’aveuglement des analystes jusqu’à ce que les mesures de ROI et les décisions de contrôle qualité soient terminées.
   12. Utilisez N = 3 souris comme unité expérimentale biologique dans l’ensemble de données représentative.
       REMARQUE : Ne mettez pas en pause l’acquisition d’image lors de l’imagerie en accéléré actif. Le traitement d’image et l’analyse quantitative peuvent être mis en pause après l’exportation des données brutes. Stockez les fichiers ND2, les fichiers d’analyse TIFF, les fichiers ROI, les métadonnées et les tables de mesure CSV dans une archive sauvegardée. Notez la puissance du laser, les réglages du détecteur, la profondeur d’imagerie, l’identification de l’animal, l’attribution du traitement et les décisions d’exclusion pour chaque séance d’imagerie.

Résultats

Une préparation réussie permet d’obtenir une fenêtre crânienne transparente et mécaniquement stable, adaptée à l’imagerie longitudinale. La figure 1A résume le flux de travail procédural allant de l’anesthésie et l’exposition du crâne à la craniotomie, la pose du coverslip, la fixation de la plaque frontale et la récupération post-opératoire. La figure 1B présente des photographies en série représentatives des principales étapes...

Discussion

Ce protocole offre un flux de travail de bout en bout pour surveiller in vivo le métabolisme endothélial du ^NAD+ cérébral. Les principaux déterminants du succès incluent : (i) la clarté et la stabilité des fenêtres, y compris la minimisation des dommages thermiques et le contrôle des purges lors du forage ; (ii) spécificité endothéliale et expression adéquate du capteur obtenues par une sélection appropriée de la capside, du promoteur, de la dose et de l’intervalle d’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,2,2-Tribromoéthanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	ATTENTION: Chimie toxique/nocive. Utilisé pour préparer la solution d'anesthésie Avertin pour la chirurgie de la fenêtre crânienne. Solution de travail typique : 1,25% (12,5 mg/mL), administrée par voie intrapéritonéale à 200–250 mg/kg.
2-Méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	ATTENTION: Chimie toxique/nocive. Solvant utilisé pour la préparation de la solution de stock concentrée d'Avertin. Protéger de la lumière et éliminer les préparations présentant une précipitation ou une décoloration.
Tampons absorbants	Winner Medical	Tampons médicaux en coton stériles	Utilisés pour l'hémostase, le séchage du crâne, l'irrigation et l'entretien du champ opératoire.
AAV-X1.1-Cdh5-biocapteur NAD+ cytoplasmique-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene sources pour les plasmides	Construct GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Biocapteur NAD+ ciblé sur l'endothélium, emballé dans AAV-X1.1. Cassette d'expression : promoteur Cdh5–biocapteur NAD+ cytoplasmique–poly(A) SV40. Dose d'injection représentative : 2 × 10¹² vg/souris. Conserver les aliquotes à −80 °C et éviter les cycles de congélation–décongélation répétés. Enregistrer le titre qPCR spécifique au lot, le numéro de lot, la carte du plasmide, la vérification de la séquence et le certificat d'analyse.
Agent analgésique (chlorhydrate de buprénorphine)	MCE	HY-B0071	Analgésie périopératoire et postopératoire. Dose représentative : 0,05–0,1 mg/kg par voie sous-cutanée toutes les 8–12 h pendant 24–48 h.
Système d'administration d'anesthésie	RWD Life Science	R500 avec vaporisateur R580	Utilisé pour l'administration d'isoflurane pendant l'imagerie. Débit d'oxygène typique : 0,5–1,0 L/min.
Agent anesthésique (isoflurane)	RWD Life Science	Série R510-22	Utilisé pour l'anesthésie en imagerie. Paramètres typiques : induction de 3–4% et maintenance de 1–2%.
Lamelle de couverture	Sur mesure	Aucun numéro de catalogue	Lamelle de couverture en verre N° 1,5 stérile, dimensionnée pour couvrir complètement une fenêtre crânienne de 3 × 3 mm et s'adapter parfaitement au bord du crâne.
Ciment/adhésif dentaire	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Utilisé pour le scellement de la fenêtre crânienne et la fixation de la plaquette frontale en titane. Préparation représentative : 1 cuillère poudre, 1 goutte catalyseur et 4 gouttes monomère. Durcir environ 5–10 min à température ambiante.
Brevet de forage dentaire	RWD Life Science	Microforeur 78001	Foret à grande vitesse utilisé pour l'amincissement du crâne et la craniotomie. Utiliser environ la moitié de la vitesse maximale avec une refroidissement fréquent par sérum physiologique.
Solution désinfectante	Winner Medical	Povidone-iode/iodophor et éthanol à 70%	Utilisé pour la préparation du cuir chevelu avant la chirurgie. Appliquer des désinfectants alternés pendant trois cycles.
Pinces fines	Marque JZ	JD1050/JD1070	Utilisés pour l'élimination du périoste, la manipulation des tissus et le soulèvement du lambeau osseux.
Seringue d'injection	RWD Life Science	20G, 38 mm, embout sphérique	Utilisé pour l'administration orale de NMN.
Plaque frontale	Sur mesure	Aucun numéro de catalogue	Plaque frontale en titane avec une ouverture centrale d'environ 10 mm, compatible avec le support d'imagerie.
Coussin chauffant/contrôleur homéothermique	RWD Life Science	69020 avec coussin 69023	Utilisé pour maintenir la température corporelle à environ 36,5–37,5 °C pendant la chirurgie et l'imagerie.
Logiciel d'acquisition d'images	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Utilisé pour le contrôle du microscope et l'acquisition d'images. Les paramètres représentatifs comprennent 512 × 512 ou 1024 × 1024 pixels, une étape z de 1–3 µm et un intervalle de laps de temps de 1 s.
Logiciel d'analyse d'images	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 ou ultérieur	Utilisé pour la correction du mouvement, la sélection des ROI, la soustraction du fond, l'extraction de l'intensité et l'exportation CSV.
Fournitures pour injection intraveineuse	BD	329461	Seringue insuline stérile de 1 mL avec aiguille 29G pour les injections d'AAV, TMR–dextran et NMN.
NMN (nicotinamide mononucléotide)	Selleck Chemicals	S5259	Précurseur de NAD+ utilisé pour les expériences d'administration par l'eau potable, par gavage oral et intraveineuse.
Pommade ophtalmique	Pharmacie certifiée locale	Non applicable	Utilisé pour prévenir le séchage de la cornée pendant l'anesthésie.
Tampon phosphate-buffer (PBS)	Servicebio	G4202-100ML ou G4202-500ML	PBS 1× stérile utilisé pour la dilution virale, la préparation des traceurs, le rinçage des tissus et la préparation des réactifs.
Système de surveillance respiratoire	RWD Life Science	Module de surveillance intégré	Utilisé pour surveiller la respiration et la profondeur de l'anesthésie pendant la chirurgie et l'imagerie.
Sérum physiologique (NaCl 0,9%, stérile)	Servicebio	G4702-500ML	Utilisé pour le refroidissement du crâne, l'irrigation, l'humidification des tissus et la préparation de solutions.
Support stéréotaxique/support de tête	Sur mesure	Aucun numéro de catalogue	Utilisé pour un positionnement stable pendant la chirurgie de la fenêtre crânienne et l'imagerie.
Microscope chirurgical	Olympus	SZ61	Util