Techniques d’identification efficaces pour 61 cultivars de thé à huile (Camellia oleifera abel) utilisant la stratégie MCID et les marqueurs ADN

Résumé

Cette étude a utilisé un diagramme d’identification manuelle de cultivar (MCID) dérivé des motifs de banguer d’ADN polymorphe amplifié aléatoire (RAPD) pour identifier efficacement et de manière reproductible 61 cultivars de Camellia oleifera Abel pour l’utilisation des ressources en germoplasme et l’identification de cultivars de thé à huile.

Résumé

Il est crucial d’identifier les matériaux et cultivars de germoplasme Camellia oleifera Abel [thé d’huile (Ot)] afin d’évaluer les ressources de germoplasme et d’évaluer les mécanismes de protection des variétés Ot. Cette étude a utilisé une technique RAPD optimisée en augmentant la longueur de l’amorce RAPD et en criblant la température de recuit PCR, ce qui a permis d’identifier 61 cultivars Ot provenant de différentes régions. De plus, un MCID a été développé pour concevoir des marqueurs RAPD efficaces pour l’identification du cultivar. Parmi 80 amorces arbitraires RAPD 11-nt, 10 amorces produisant des bandes polymorphes claires (PB) ont été sélectionnées pour une analyse PCR des 61 cultivars. De plus, la stratégie MCID a été employée pour distinguer manuellement 61 cultivars à partir des PB observés dans les empreintes ADN des 10 amorces, ce qui a généré le diagramme d’identification du cultivar Ot (Ot-CID). Cet Ot-CID indiquait chaque cultivar individuellement, utilisant des PB pour l’identification du cultivar, avec les amorces appropriées positionnées avec précision sur l’Ot-CID. La stratégie MCID offre une approche simple et pratique pour l’identification des plantes à l’aide de marqueurs ADN. De plus, cette approche offre une méthode pratique et efficace pour l’identification des cultivars. L’Ot-CID résultant, composé de 61 cultivars Ot, a efficacement distingué les variantes Ot à l’aide de marqueurs RAPD, facilitant ainsi la différenciation des cultivars pour la protection des droits cultivars et l’identification précoce des semis dans l’industrie des pépinières.

Introduction

Camellia oleifera Abel [thé à l’huile (Ot)] est l’une des espèces d’arbres légieux comestibles les plus importantes au^{monde 1}. La Chine est considérée comme le centre d’origine et de diversité de l’OT, avec d’abondantes ressources en^{germoplasme 2}. L’ancienne tradition de l’Ot, la propagation végétative et la diversité des programmes mondiaux de sélection ont conduit à l’émergence de nombreux^cultivars. La culture mondiale généralisée de la culture Ot a donné naissance à des cultivars homonymes (cultivars distincts portant le même nom) et des synonymes (cultivars ayant plus d’un nom)⁴. Il est donc crucial de développer des techniques pour gérer une vaste gamme de germoplasme Ot et distinguer précisément les différents^{cultivars 3,5}.

Malgré l’application de marqueurs moléculaires basés sur l’ADN dans la caractérisation des cultivars, la recherche génétique et l’identification des Ot, qui peuvent élucider la diversité génétique et différencier les individus des plantes, aucune étude n’a permis d’identifier avec succès un nombre substantiel de cultivars Ot ni de fournir une base fiable pour la différenciation ^{des cultivars} 6,7,8,9 . Le manque de méthodes fiables est la principale limite à l’application des marqueurs ADN dans l’identification des cultures végétales. Cela pourrait s’expliquer par le fait que les techniques analytiques utilisées pour les empreintes digitales ADN ne peuvent pas fournir d’informations pertinentes qui spécifient distinctement les amorces et les marqueurs polymorphes pour différencier les cultivars nécessitant une identification. Les techniques analytiques pour les motifs de banaison de l’ADN (appelées analyses en grappes) ne conviennent pas à distinguer efficacement les cultivars ou les espèces.

Bien que des cartes d’identification moléculaire (ID) d’ADN aient été développées pour plus de 200 cultivars Ot utilisant les marqueurs^SNP 2,3,10,11, il existe encore plusieurs défis : (1) Le génome Ot est complexe, la majorité des camélias cultivés étant hexaploïdes, tandis que le génome de référence utilisé pour construire les IDs moléculaires d’ADN est triploïde, ce qui peut entraîner certaines inexactitudes³. (2) Le séquençage du génome entier est coûteux, notamment pour les laboratoires disposant d’installations limitées, ce qui empêche son application généralisée pour l’analyse de variétés à grande échelle. De plus, les produits d’amplification par PCR nécessitent un séquençage ou une détection de fluorescence, compliquant encore le processus¹². (3) En l’absence de marqueurs distinctifs pour les nouvelles variétés, il est nécessaire de développer de nouveaux amorces de marqueurs, ce qui nécessitera également le recodage des codes de carte d’identité pour les types existants. Cela entraîne une quantité écrasante de positions de code, diminuant l’efficacité de la différenciation des variétés. Il est donc essentiel d’employer une technique qui offre une vérification facile, fiable, fiable et pratique des cultivars Ot pour le secteur des pépinières Ot, l’exploitation agricole, la protection par brevet des plantes, ainsi que la conservation et l’évaluation des ressources^{génétiques 5}.

Les stratégies traditionnelles d’identification des cultivars reposaient sur des caractéristiques morphologiques, physiologiques et agronomiques, mais ces caractéristiques ont des limites car elles sont sensibles aux influences environnementales et nécessitent une évaluation complète des plantes pleinement^{développées 13,14}. De plus, les marqueurs moléculaires ont l’avantage distinct d’être indifférents aux variables environnementales, servant ainsi d’outil efficace pour la caractérisation précise des^{cultivars 14,15}. Récemment, divers indices basés sur l’ADN ont été établis pour évaluer l’empreinte digitale, la diversité génétique, le cultivar et la pureté 16,17,18,19,20,21,22. Le marqueur RAPD est avantageux pour l’analyse de cultivar en raison de sa simplicité, de son efficacité et de l’absence de besoins dans les données de séquence^{précédentes 23,24}. L’approche RAPD peut être améliorée en sélectionnant des amorces à 11 nucléotides (nt) ainsi que leur température de recuit PCR spécifiée pour son application dans l’empreintement des plantes, établissant ainsi le RAPD comme une méthode préférable pour l’identification des variétés végétales et l’évaluation de la diversité^{génétique 25,26}. Ces marqueurs ont été largement utilisés dans les études de différenciation des cultures et de corrélation génétique de diverses espèces végétales, notamment l’abricot²⁷, la pêche ornementale²⁸, la^{grenade 29}, les landraces²⁰ et le noyer³⁰ (Çilesiz et al., 2025). Malgré leur utilisation généralisée, de nombreuses approches basées sur des marqueurs d’ADN restent insuffisamment pratiques ou simplifiées pour l’identification courante des variétés végétales.

Par conséquent, cette étude a utilisé une technique analytique novatrice pour l’identification reproductible de divers cultivars Ot. Le MCID, dérivé des motifs de banaise RAPD, a différencié 61 cultivars Ot pour l’utilisation des ressources de germoplasme et l’identification des cultivars.

La stratégie RAPD-MCID décrite ici (Figure 1) est la plus adaptée à la caractérisation du germoplasme à petite et moyenne échelle dans des laboratoires disposant d’une infrastructure standard de PCR et d’électrophorèse sur gel mais d’un accès limité aux installations de séquençage. Il est également bien adapté à un dépistage préliminaire rapide et économique avant une analyse génétique plus détaillée. Les principales limites opérationnelles de la méthode incluent sa dépendance aux marqueurs dominants et la nécessité d’une standardisation rigoureuse des conditions PCR pour garantir la reproductibilité inter-laboratoire. Pour les grandes banques de germoplasme ou l’enregistrement légal des variétés, l’utilisation complémentaire de marqueurs co-dominants tels que les SSR ou SNP est recommandée.

Protocole

1. Matière végétale

1. Collectez de jeunes feuilles sur des pousses saines et en croissance active de chaque cultivar de thé olégieux du Dépôt national de germoplasme de camélias, comté de Shucheng, province de l’Anhui.
2. Consultez le tableau 1 pour les noms et origines de ces cultivars.

2. Extraction d’ADN génomique

1. Extraire l’ADN génomique total à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN végétal selon les instructions du fabricant.
2. L’ADN a été élué avec un tampon de 1× TE. Après élution, vérifiez que la solution d’ADN extraite est claire et incolore. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume.
3. Ajustez la concentration d’ADN à 30 ng·^μL-1 avec 1× tampon TE et stockez la solution d’ADN ajustée à -20 °C.

3. Sélection des amorces RAPD

1. Développer 80 amorces aléatoires pour l’analyse du RAPD et les analyser en utilisant quelques génotypes. Sélectionnez des amorces RAPD 11-nt qui produisent des motifs de bandes clairs et sans équivoque sur tous les génotypes testés.
2. Utilisez les amorces sélectionnées pour le génotypage afin d’augmenter la crédibilité des fragments amplifiés. Sélectionnez 10 amorces bien résolues avec des bandes reproductibles pour une analyse plus approfondie, comme indiqué dans le tableau 2.

4. PCR ADN polymorphe amplifié aléatoirement (RAPD)

1. Préparez les réactions d’amplification en modifiant légèrement la méthode²³ décrite précédemment. Préparez les solutions de réaction selon la composition listée dans le tableau S1.
2. Effectuer la PCR à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions suivantes : pré-dénaturation à 94 °C pendant 5 minutes ; 42 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, recuit pendant 1 minute à la température optimisée indiquée dans le Tableau 2, et extension à 72 °C pendant 2 minutes ; et une extension finale à 72 °C pendant 10 minutes.

5. Détection et analyse des produits PCR

1. Séparer les fragments d’ADN amplifiés par électrophorèse en gel à 100 V dans 1,3 % d’agarose (p/v) préparé dans un tampon 1× TAE contenant 0,001 M EDTA et 0,04 M Tris-acétate au pH 8,0. Colorez les gels avec du bromure d’ethidium à 0,5 μg·^μL-1.
   ATTENTION : Le bromure d’ethidium est un mutagène puissant. Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de solutions de bromure d’ethidium ou de gels tachés.
2. Faites fonctionner le gel à une tension constante de 100 V pendant 45 à 60 minutes, ou jusqu’à ce que le front de colorant bleu de bromophénol ait migré d’environ les deux tiers de la longueur du gel. Après la coloration et le décoloration, observez le gel sous transillumination UV.
   REMARQUE : Confirmez que des bandes d’ADN distinctes sont clairement visibles sous transéclairage UV. Assurez-vous que l’échelle d’ADN présente des bandes nettes et bien séparées, allant de 100 à 2 000 pb.
3. Notez les bandes polymorphes (PB) des cultivars en fonction de leur présence ou absence sous lumière ultraviolette.
4. Effectuer chaque amplification PCR en triple exemplaire pour garantir la reproductibilité. Bandes de score uniquement, présentes ou absentes de manière constante sur les trois réplications indépendantes, pour l’analyse en aval. Confirmer que le taux de concordance de la notation des bandes entre les réplicés dépasse 95 %.

6. Analyse des données

1. Notez les bandes pour l’identification du cultivar en fonction de leur présence ou absence en attribuant « + o » aux bandes clairement visibles et « − » aux bandes absentes à la position moléculaire correspondante sur tous les cultivars. N’incluez que les bandes observées de manière cohérente sur trois réplications indépendantes.
2. Classifier les cultivars avec des bandes distinctes dans l’empreinte digitale produite indépendamment par un seul amorce. Catégorisez les cultivars aux motifs de bandes identiques dans le même sous-groupe. Différenciez progressivement et entièrement tous les cultivars de thé à huile en fonction de ces paramètres.

7. Application et efficacité du diagramme dans l’identification des cultivars

1. Sélectionnez au hasard deux groupes de cultivars de thé à huile parmi les groupes intra et intergroupes afin de vérifier l’applicabilité et la fonctionnalité du schéma illustrant 61 cultivars de thé à huile. Effectuez la sélection manuellement en se référant aux différentes branches du diagramme Ot-CID, sans utiliser de logiciel.
   REMARQUE : 2 groupes de cultivars Ot ont été sélectionnés au hasard pour vérifier l’applicabilité et la fonctionnalité du schéma illustrant 61 cultivars Ot.
2. Désignez les deux groupes sélectionnés comme « A » et « B ». Sélectionnez les introductions pertinentes pour chaque groupe à partir de l’Ot-CID.

8. Conseils pour l’élimination des déchets dangereux

1. Préparez et manipulez toutes les solutions de bromure d’ethidium dans une zone désignée. Collectez séparément tous les déchets solides contaminés au bromure d’ethidium et les déchets liquides pour leur élimination conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets dangereux.
2. Éliminez tous les matériaux contaminés au bromure d’ethidium dans des contenants désignés pour déchets dangereux. Contactez le bureau de la santé et de la sécurité environnementale de l’institution pour obtenir des procédures d’élimination approuvées en cas de doute.

Résultats

Les résultats représentatifs présentés ici illustrent le flux de travail complet de la stratégie RAPD-MCID, depuis le criblage initial des amorces en passant par la discrimination hiérarchique des cultivars jusqu’à la validation finale. Le processus de discrimination étape par étapes est documenté dans les figures 2, 3, 4,

Discussion

Les marqueurs d’ADN sont des outils puissants utilisés pour identifier les cultivars et l’espèce²⁴. Ces marqueurs ont été développés et utilisés dans des milliers d’études sur l’analyse génétique, l’identification de cultivars, etc. ; cependant, ils ne sont ni faciles ni largement utilisés dans le^{génotypage 24,31}. Cela s’explique par l’absence de méthodes efficaces et simples utilisant des marqueu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifuge	Eppendorf,Germany	5427R	Utilisé pour l'extraction de l'ADN génomique des feuilles de thé à huile
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, Chine	DP350	Utilisé pour l'extraction d'ADN génomique des feuilles de thé à huile
Instrument d'amplification génique PCR	Monad, Chine	MP60901	Utilisé pour l'amplification PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, Chine	A8202	Utilisé pour l'électrophorèse des fragments PCR
TAE	Tsingke, Chine	TSG001	Utilisé pour l'électrophorèse des fragments PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japon	RR001A	Utilisé pour l'amplification PCR
Spectrophotomètre Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI, USA		Utilisé pour déterminer la concentration d'ARN