Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole fournit un flux de travail standardisé in vitro. pour une mesure cohérente de la cytotoxicité naturelle, médiée par les récepteurs antigéniques chimériques et dépendante des anticorps des cellules humaines naturelles tueuses grâce à l’imagerie des cellules vivantes et à la cytométrie en flux.

Résumé

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes innés qui jouent un rôle crucial dans l’immunité protectrice contre divers agents pathogènes intracellulaires et cancers. Leur fonction principale est de tuer les cellules cibles infectées, transformées malignement ou recouvertes d’anticorps via la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Les cellules NK peuvent également être génétiquement modifiées pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) qui permettent la reconnaissance ciblée d’antigènes spécifiques. La mesure quantitative de la cytotoxicité des cellules NK est essentielle pour évaluer la fonctionnalité de base et pour l’évaluation préclinique des anticorps monoclonaux et des stratégies d’ingénierie CAR. Cependant, les tests fonctionnels in vitro restent très variables selon les laboratoires en raison des différences dans la préparation cellulaire, les cellules cibles, les rapports effecteur/cible, les temps de co-incubation et les méthodes de lecture, limitant la reproductibilité et les comparaisons croisées. Cet article présente un protocole standardisé pour l’évaluation quantitative de la cytotoxicité des cellules NK à l’aide de la cytométrie en flux et de l’imagerie en temps réel de cellules vivantes. Les cellules NK humaines primaires et les cellules NK-92 exprimant CAR ont été évaluées pour leur capacité à tuer les cellules cancéreuses et les cellules cibles recouvertes d’anticorps dans un format de plaques à 96 puits pour mesurer la cytotoxicité naturelle, la destruction médiée par CAR et les ADCC. La survie des cellules cibles a été mesurée soit en continu par imagerie de cellules vivantes, soit à un moment défini par cytométrie en flux, qui a également permis la caractérisation phénotypique des cellules NK et des cellules cibles. Ces protocoles fournissent un cadre robuste utilisant des méthodes de culture tissulaire de routine, d’imagerie et de cytométrie en flux pour permettre la quantification reproductible des fonctions effectrices des cellules NK pour des études sur l’immunité innée et les immunothérapies basées sur les cellules NK.

Introduction

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes innés qui jouent un rôle central dans la surveillance immunitaire contre les cellules infectées par le virus et les cellules malignes, présentant une cytotoxicité rapide et^{puissante 1}. Contrairement aux cellules B et T, les cellules NK n’expriment pas de récepteurs spécifiques à l’antigène et s’appuient plutôt sur un ensemble de récepteurs activants et inhibiteurs pour détecter la perte de l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I ou le stress cellulaire. Cela leur permet de médier la cytotoxicité directe en libérant des granules cytotoxiques contenant de la perforine et des granzymes ou, dans certains cas, en activant les récepteurs de mort 1,2,3,4. En plus de la cytotoxicité naturelle, les cellules NK expriment FcγRIII (CD16), un récepteur qui reconnaît la portion Fc de l’immunoglobuline G (IgG) et médiatise la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) contre les cellules cibles enrobées^{d’IgG 5,6}.

En raison de leurs mécanismes cytotoxiques intrinsèques et de leur profil de sécurité favorable, les cellules NK se sont révélées être des candidates prometteuses pour l’immunothérapie cellulaire. Avec le potentiel d’utilisation allogénique, les cellules NK peuvent fonctionner comme une thérapie « prête à l’emploi » avec un risque minimal de maladie greffe contre hôte, permettant une applicabilité clinique plus large et des coûts^{réduits 7}. Les avancées récentes ont encore élargi le potentiel thérapeutique des cellules NK grâce à des stratégies de génie génétique, notamment l’introduction de récepteurs antigéniques chimériques (CAR) qui redirigent les cellules NK pour reconnaître des antigènes tumoraux spécifiques. Les cellules CAR-NK ont démontré une efficacité antitumorale dans des modèles de xénogreffes in vivo et des essais cliniques, avec une toxicité réduite par rapport aux cellules^{CAR-T 8,9,10}. Par conséquent, l’intérêt grandit pour le développement de plateformes NK modifiées et de stratégies thérapeutiques basées sur des anticorps. Dans ce contexte, une mesure précise et quantitative de la capacité de destruction des cellules NK est essentielle pour comprendre la biologie des cellules NK, évaluer l’efficacité des thérapies CAR ou autres thérapies modifiées pour cellules NK, et évaluer les anticorps monoclonaux dépendant de l’ADCC.

Divers tests in vitro ont été largement utilisés dans les laboratoires pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK. Les méthodes courantes incluent les tests de libération de chrome-51 radioactif, les tests de libération de lactate déshydrogénase, et les tests de libération de calcine-acétoxyméthelle^11,12. Bien que ces méthodes traditionnelles aient été largement utilisées pour mesurer la cytotoxicité, elles reposent sur des relevés indirects de la mort cellulaire, fournissent des mesures finales plutôt que des données cinétiques, et offrent une sensibilité et une plage dynamique limitées. Ils ne fournissent pas non plus d’informations sur le phénotype ou l’état d’activation des cellules effectrices. Plus récemment, les plateformes d’imagerie des cellules vivantes et la cytométrie en flux ont été de plus en plus adoptées car elles permettent la quantification directe de la survie des cellules cibles, le suivi de la destruction au fil du temps, et l’analyse phénotypique simultanée des cellules effecteurs et^{cibles 13,14}. Cependant, même parmi ces approches plus récentes, une variabilité importante existe entre les laboratoires et les études publiées, notamment des différences dans la préparation cellule cible, les rapports effecteur-cible (E :T) et les temps de co-incubation, limitant la reproductibilité et les comparaisons croisées, en particulier dans les évaluations précliniques d’immunothérapies à base de cellules NK.

Cet article présente un flux de travail standardisé pour l’évaluation quantitative de la cytotoxicité des cellules NK à l’aide de deux plateformes indépendantes et complémentaires : l’imagerie en temps réel, en cellules vivantes (IncuCyte SX5) et les tests d’extrémité basés sur la cytométrie en écoulement. L’imagerie des cellules vivantes permet un suivi continu de la survie des cellules cibles lors de la co-culture avec les cellules effectrices, permettant une évaluation cinétique de la cytotoxicité à travers plusieurs rapports E :T et conditions expérimentales avec une manipulation minimale^{des essais 15}. En revanche, la cytométrie en flux fournit une mesure finale très sensible de la mort des cellules cibles, ainsi qu’une caractérisation phénotypique simultanée des cellules NK et des cellules cibles à l’aide d’un panneau de coloration multimarqueur.

De plus, ce protocole intègre des paramètres expérimentaux standardisés, incluant les rapports E :T, les conditions d’incubation, le format des plaques et les flux de travail analytiques, afin d’améliorer la reproductibilité et de faciliter la comparaison des mesures de cytotoxicité entre laboratoires et études. Ce flux de travail permet une évaluation quantitative de multiples fonctions effectrices NK, y compris la cytotoxicité naturelle, la destruction médiée par CAR et l’ADCC, et est compatible avec les cellules NK humaines primaires et les lignées cellulaires NK. Ce protocole fournit un cadre pratique pour les études de biologie des cellules NK et l’évaluation préclinique du développement de l’immunothérapie basée sur les cellules NK.

Protocole

L’utilisation des échantillons de donneurs humains pour la recherche a été approuvée par le Comité d’Examen Institutionnel et réalisée conformément aux directives institutionnelles (Approval #2022P000699).

1. Essai d’imagerie cellulaire vivante en temps réel

1. Plaques de manteau
   1. Ajoutez 50 μL/poly-D-lysine (0,1 mg/mL dans une solution physiologique tamponnée phosphate [PBS]) à une grille de 6 × 10 dans une plaque à fond plat de 96 puits. Secouez doucement la plaque pour vous assurer que le fond de chaque puits est bien couvert.
   2. Incubez la plaque pendant 2 heures à température ambiante (RT ; 18°C–26°C) avec le couvercle posé.
   3. Laver les puits 3× avec 200 μL/puits PBS et éliminer le surnageant.
      REMARQUE : Les plaques revêtues peuvent être scellées avec du parafilm et stockées à 4°C pendant jusqu’à 1 semaine, avec 200 μL de PBS ajoutés à chaque puits. Assurez-vous que les plaques restent stériles, jetez les PBS et laissez-les s’équilibrer en RT avant utilisation.
2. Préparer les cellules cibles
   1. Préparez 10 mL de 2× SYTOX Orange (200 nM) en diluant la solution de SYTOX Orange (250 μM en DMSO) dans un milieu de culture NK-92 (ajouter 8 μL de stock à 10 mL de volume total) dans un tube centrifugeuse à fond conique de 15 mL.
      REMARQUE : Les milieux de culture pour cellules NK-92 se composent de medium avancé RPMI-1640, de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de 2 mM de L-alanyl-L-glutamine, de 100 μg/mL de primocine et de 500 U/mL d’IL-2 humaine.
      ATTENTION : SYTOX Orange est une teinture fluorescente et peut présenter des risques pour l’exposition de la peau ou des yeux. Manipulez avec un équipement de protection individuelle approprié et conformément aux consignes de sécurité institutionnelles.
   2. Compter les cellules cibles en utilisant une méthode de comptage de cellules basée sur l’exclusion de colorants (par exemple, bleu de trypan) ou une méthode validée équivalente (par exemple, compteur automatique de cellules).
      REMARQUE : Dans cet essai, les cellules cibles étaient des cellules de Ramos, une lignée cellulaire de lymphome à cellules B exprimant des antigènes de maturation des cellules B (BCMA⁺), que nous avons modifiée pour exprimer la protéine fluorescente proche infrarouge (NIR) emiRFP670.
   3. Transférez la quantité requise dans un tube centrifugeuse à fond conique de 15 mL.
   4. Centrifugeuse (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   5. Jetez le surnageant.
   6. Resuspendez les cellules cibles à une concentration finale de 2,5 × 10⁵ cellules/mL (2,5 × 10⁴ cellules/100 μL) dans 2× milieux SYTOX Orange.
      REMARQUE : Les cellules cibles en suspension peuvent être maintenues à 37°C avec 5 % de CO₂ dans le tube pendant jusqu’à 30 minutes lors de la préparation des dilutions des cellules effectrices.
      REMARQUE : Pour une plaque complète, 60 puits × 2,5 × 10⁴ cellules/puits = 1,5 × 10⁶ cellules cibles au total. Préparez 2.0 × 10⁶ cellules pour compenser les pertes. Ajustez le nombre de cellules en fonction de la taille du test et de la densité de semis souhaitée.
3. Préparer les cellules effectrices
   1. Évaluer la concentration et la viabilité des cellules NK-92 à l’aide d’une méthode de comptage cellulaire basée sur l’exclusion de colorants (par exemple, bleu de trypan) ou une méthode validée équivalente. Ne procéder que si la viabilité est de ≥80 %, car une viabilité plus faible peut impacter la performance du test.
      REMARQUE : Les cellules NK-92 conçues pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente ZsGreen, seule (contrôle) ou avec des constructions CAR ciblées sur BCMA, ont été utilisées comme cellules effectrices.
   2. Compter et transférer le nombre requis de cellules dans des tubes centrifugeuses individuels à fond conique de 15 mL.
      REMARQUE : Calculez le nombre total de cellules effectrices nécessaires en additionnant le nombre de cellules nécessaires sur tous les rapports E :T pour une réplication, en multipliant par le nombre de réplications, et en ajoutant 50 % d’excédent pour compenser la perte cellulaire. Des numéros arrondis au besoin pour faciliter la préparation. Par exemple, pour des rapports E :T allant de 2:1 à 0,25:1, utilisez 1,5 × 10 cellules⁵ NK par réplication. Pour les triplicats, préparez 4,5 × 10⁵ cellules par condition selon la disposition des plaques décrite dans la Figure Supplémentaire 1A.
   3. Cellules centrifugeuses (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   4. Jetez le surnageant.
   5. Resuspendre les cellules à une concentration finale de 5,0 × 10⁵ cellules/mL (5,0 × 10⁴ cellules/100 μL).
4. Préparer les dilutions des cellules effecteurs
   1. Préparer des dilutions de cellules effecteurs, y compris un contrôle uniquement cible, dans une plaque à fond rond de 96 puits (voir Figure 1A supplémentaire pour une disposition représentative des plaques avec quatre conditions en triplicat). Chaque condition est préparée en triplicat.
   2. Ajouter 240 μL/puits de cellules effectrices (5,0 × 10⁵ cellules/mL) dans des puits correspondant à un rapport E :T de 2:1.
   3. Ajoutez 120 μL/puits de milieu à tous les puits restants.
   4. Effectuer des dilutions en série à deux fois des puits E :T = 2:1 jusqu’aux puits E :T = 0,25:1. Mélangez soigneusement en pipettant ≥5 fois et changez les pointes entre les transferts.
      REMARQUE : Si les séances d’imagerie n’ont pas été programmées sur le système, planifiez-les avant de mettre en place la co-culture. Les dilutions préparées des cellules effectrices peuvent être maintenues à 37°C avec 5 % de CO₂ dans une plaque à fond arrondi de 96 puits pendant jusqu’à 30 minutes lors de la mise en place du système d’imagerie à cellules vivantes.
5. Instaurer une co-culture
   1. Obtenir la plaque à fond plat revêtue de poly-D-lysine, à 96 puits.
   2. Ajoutez 100 μL/puits de suspension à cellules cibles à tous les puits. Resuspendez soigneusement les cellules cibles immédiatement avant la distribution en pipettant vers le haut et vers le bas ≥5 fois à l’aide d’une pipette appropriée (par exemple, 200 μL) et évitez la formation de bulles lors du transfert.
   3. Ajoutez 100 μL/puits de suspension à cellules effecteurs aux puits correspondants. Resuspendez soigneusement les cellules effectrices immédiatement avant la distribution en pipettant ≥ et 5 fois à l’aide d’une pipette appropriée (par exemple, 200 μL) et évitez la formation de bulles lors du transfert.
   4. Ajouter 200 μL/puits PBS aux puits inutilisés environnants.
   5. Centrifugez la plaque (2 min, 100 × g, RT, accélération = faible [ex. 2] ; décélération [freinage] = faible [ex. 2]).
      REMARQUE : Cette rotation douce est essentielle pour déposer rapidement et uniformément les cellules au fond du puits afin d’obtenir une imagerie précise sur l’IncuCyte SX5. Nous utilisons une centrifugeuse Eppendorf 5810R compatible avec un rotor à seau oscillant compatible avec un plateau de travail avec les réglages d’accélération et de décélération réglés à 2 (sur 9).
   6. Placez la plaque dans le système d’imagerie à cellules vivantes et prenez des images toutes les 1 h pendant 24 heures (extensibles jusqu’à 72 h si nécessaire). Assurez-vous que l’imagerie est réalisée dans des conditions d’incubation standard (37°C/5 % CO₂).
      REMARQUE : Pour garantir que l’imagerie à t = 0 h reflète avec précision le nombre de cellules cibles de base, commencez l’acquisition de l’image dans les 10 à 15 minutes suivant la mise en place de la co-culture et la centrifugation. Pour une plaque complète avec trois canaux d’imagerie (c’est-à-dire vert, orange et NIR), le temps de balayage est d’environ 10 minutes par heure pour 3 images/puits à un grossissement de 20×.
   7. Vérifiez la qualité de l’image après le premier scan et ajustez les réglages si nécessaire.
6. Réglages des instruments
   1. Réglez le démélange spectral pour corriger le débordement de fluorescence de SYTOX Orange dans le canal vert. Ajustez la valeur de démélange dans le logiciel en comparant les canaux vert et orange et en confirmant que les cellules mortes Orange⁺ ne sont pas détectées à tort comme Vert⁺. Pour l’expérience représentative (Figure 1), la contribution du canal orange au canal vert a été fixée à 8,5 %. Ces valeurs sont spécifiques à chaque ensemble de données et doivent être optimisées pour chaque expérience.
   2. Configurez une analyse non adhérente cellule par cellule pour garantir une segmentation et un masquage précis de toutes les cellules dans chaque champ de vision (voir la Figure 1B supplémentaire pour une configuration représentative). Les paramètres suivants sont recommandés pour le système d’imagerie à cellules vivantes utilisant des modèles effecteurs en suspension et lignées cellulaires cibles :
      1. Réglez le diamètre attendu de l’objet à 15 μm (diamètre approximatif de la cellule).
      2. Réglez la sensibilité au seuil et la sensibilité à la texture à 5.
      3. Réglez la sensibilité des bords à 10 pour faciliter la séparation des groupes cellulaires.
      4. Réglez la plage de filtre de surface acceptée à 50–2000^μm2 pour exclure les débris et les gros objets.
      5. Fixer le maximum d’excentricité à 0,95 pour exclure les objets non cellulaires.
   3. Configurez les seuils de classification (voir la Figure 1C supplémentaire pour le gating représentatif). Utilisez des puits de contrôle cibles uniquement pour définir la population de référence NIR⁺/Orange⁻ vivante de cellules cibles. Ensuite, on utilise des puits de co-culture à des moments ultérieurs (par exemple, t = 4 h) pour confirmer une séparation claire avec un chevauchement minimal entre les populations ^NIR+/− et Orange⁺/⁻. Des exemples de seuils de classification et de paramètres d’analyse sont présentés dans la Figure supplémentaire 1C.
      1. Fixez le seuil d’intensité orange à environ 15.
      2. Fixez le seuil d’intensité NIR à environ 0,1.
         REMARQUE : Les paramètres et seuils peuvent varier selon l’instrument, le logiciel, le modèle de lignées cellulaires et l’intensité du signal de fluorescence.
         REMARQUE : Ce protocole peut être adapté pour des tests primaires de cytotoxicité des cellules NK humaines ou ADCC si les cellules cibles expriment de manière stable la fluorescence NIR (par exemple, emiRFP670). Elle peut également être adaptée pour des tests de destruction basés sur la cytométrie en écoulement en omettant le revêtement de poly-D-lysine et en utilisant des plaques à fond plat ou arrondi à 96 puits.

Figure 1. Quantification de la cinétique et de la puissance de la cytotoxicité cellulaire médiée par les cellules NK-92 par récepteur antigénique chimérique (CAR) à l’aide d’imagerie cellulaire vivante en temps réel. (A) Aperçu schématique de l’essai d’imagerie cellulaire vivante IncuCyte pour le suivi de la cytotoxicité médiée par les cellules NK. Les cellules ciblées ^BCMA+ Ramos exprimant emiRFP670 (canal proche infrarouge [NIR]) sont co-cultivées avec des cellules effectrices NK-92 exprimant ZsGreen (canal vert), et la mort cellulaire est détectée grâce à SYTOX Orange (canal orange). (B) Image de fluorescence représentative d’un puits de co-culture à un rapport effecteur/cible (E :T) de 1:1 à 12 heures. Les cellules cibles vivantes (emiRFP670⁺) sont affichées en bleu, les cellules effectores NK-92 (ZsGreen⁺) en vert, et les cellules mortes (SYTOX Orange⁺) en rouge. Les images ont été obtenues à l’aide du module d’analyse Cellule-pour-Cellule non adhérent à un grossissement de 20×. Barre-échelle = 100 μm. (C) Quantification de la croissance et de la survie des cellules cibles au fil du temps à différents rapports E :T pour les cellules témoins et exprimant CAR-92. (D) Quantification de la survie de la cellule cible en fonction du rapport E :T à plusieurs moments (4, 8, 16 et 24 heures). Le nombre de cellules cibles a été normalisé à des puits uniquement cibles (E :T = 0:1) à chaque moment précis. (E) Représentation schématique des métriques quantitatives utilisées pour évaluer la cytotoxicité : KR₅₀, ratio tueur/cible nécessaire pour atteindre 50 % de mort en 12 heures ; KT₅₀, temps nécessaire pour atteindre 50 % de destruction à un ratio E :T de 1:1 ; et IKI₅₀, indice intégré de tueur défini comme la zone de la carte thermique en dessous de l’isocline de survie à 50 %. (F) Cartes thermiques montrant la croissance et la survie de la cellule cible en fonction du rapport E :T et du temps pour chaque condition effecteur. Des valeurs quantitatives pour KR₅₀, KT₅₀ et IKI₅₀ sont indiquées pour chaque condition. Les décomptes bruts de cellules cibles vivantes ont été obtenus à partir ^{de la population} NIR⁺/SYTOX Orange– à portée de contrôle grâce à une analyse de classification cellule par cellule dans le logiciel IncuCyte 2021C. Toutes les conditions ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3). Les données sont présentées en moyenne ± écart-type. L’analyse de régression non linéaire a été utilisée pour modéliser les tendances de cytotoxicité dans les panneaux D et F. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Quantification de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps par cytométrie en flux

1. Préparer les cellules NK humaines primaires
   REMARQUE : Des cellules NK humaines primaires ont été isolées à partir de sang périphérique enrichi en leucocytes obtenus auprès de donneurs adultes sains à l’aide d’une méthode d’enrichissement de cellules NK suivie d’une centrifugation par gradient de densité, comme décrit^{précédemment 3}. Les cellules NK purifiées ont été cryopréservées à 5 ×^{10 6} cellules/mL dans une solution congelante (90 % FBS et 10 % sulfoxyde de diméthyle [DMSO]) sous forme d’aliquotes de 0,5 mL dans les cryoviales et stockées à moins de −150 °C jusqu’à^{l’utilisation 3}.
   1. Décongelez un flacon contenant 5 ×^{10 6} cellules NK humaines primaires en agitant doucement le cryovial dans un bain-marie à 37°C pendant environ 1 minute, jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace.
      ATTENTION : Manipuler tous les échantillons d’origine humaine en utilisant les procédures de biosécurité appropriées et les équipements de protection individuelle conformément aux directives institutionnelles.
      ATTENTION : Le DMSO facilite l’absorption des produits chimiques cutanés. Portez un équipement de protection approprié et évitez le contact direct.
   2. Transférez les cellules décongelées dans un tube centrifugeuse à fond conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu de culture NK préchauffé (37 °C) et mélangez en tourbillonnant doucement.
      REMARQUE : Les milieux de culture de cellules NK se composent d’Advanced RPMI-1640 complétés avec 10 % de FBS, 10 % de sérum AB humain, 2 mM de L-alanyl-L-glutamine, 100 μg/mL de primocine et 50 U/mL d’IL-2 humain.
   3. Cellules centrifugeuses (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   4. Jetez le surnageant.
   5. Résuspendez le pellet dans 5 mL de milieu de culture NK-cell préchauffé (37°C).
   6. Cellules centrifugeuses (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   7. Jetez le surnageant.
   8. Resuspendez la pellete dans 1 mL de milieu de culture NK-cell préchauffé.
   9. Transférez la suspension dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
   10. Ajoutez 1 mL de PBS stérile aux puits environnants pour minimiser l’évaporation.
   11. Incubez la plaque à 24 puits à un angle de 45° (en utilisant un support ou un support pour maintenir l’angle) à 37°C avec 5 % de CO₂ pendant 16 à 24 heures pour permettre la récupération des cellules NK.
       REMARQUE : Les cellules NK humaines primaires nécessitent un contact étroit entre cellules pour une survie et une récupération maximales, ce qui peut être obtenu en inclinant la plaque à 24 puits et en permettant l’accumulation au bord des puits. Maintenir un temps d’incubation constant entre les expériences.
       REMARQUE : Après la période de récupération, procédez directement à la préparation des cellules cibles et à la mise en place de la coculture.
2. Colorez les cellules cibles avec l’ester de succinimidyle carboxyfluorescéine (CFSE).
   1. Obtenir 5 × 10^{cellules cibles de 5} et transférer dans un tube centrifugeuse à fond conique de 15 mL.
      REMARQUE : Une lignée cellulaire de lymphome dérivé du patient de CD38⁺ a été utilisée comme cellules^{cibles 16}.
   2. Lavez les cellules une fois avec 10 mL de PBS.
   3. Cellules centrifugeuses (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   4. Préparez une solution de travail de CFSE de 0,5 μM dans un PBS à l’aide d’une solution de 5 mM en diluant 1 μL de la crosse CFSE de 5 mM en 10 mL de PBS dans un tube centrifugeuse à fond conique de 15 mL.
      ATTENTION : Le CFSE est un colorant fluorescent réactif liant les amines et peut présenter des risques pour l’exposition cutanée ou oculaire. Manipulez avec un équipement de protection individuelle approprié et jetez les réactifs inutilisés conformément aux directives locales de biosécurité.
   5. Jetez le surnageant.
   6. Resuspendez le pellet à environ 1 × 10⁶ cellules/mL dans la solution CFSE.
   7. Incubez pendant 15 minutes à 37°C avec le tube enveloppé dans du papier aluminium ou placé dans un récipient opaque pour le protéger de la lumière.
   8. Éteignez la réaction en ajoutant 5 à 10 volumes de milieu de culture.
   9. Incubez pendant 5 minutes à 37°C.
   10. Cellules centrifugeuses (5 min, 300 × g, RT, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   11. Jetez le surnageant.
   12. Resuspendez les cellules à 2,5 × 10⁵ cellules/mL de sorte que 100 μL contiennent 2,5 × 10⁴ cellules.
       REMARQUE : Procéder directement au placage pour maintenir une intensité du signal CFSE et une viabilité de la cellule cible constantes.
3. Cellules cibles de plaques
   1. Obtenez une plaque à fond rond à 96 puits.
   2. Ajouter 100 μL/puits de cellules cibles (2,5 × 10⁵ cellules/mL) dans des puits désignés à l’aide d’une pipette multicanal (voir Figure supplémentaire 2). Chaque condition est placée en triple exemplaire.
      REMARQUE : Assurez-vous que la suspension cellulaire est homogène avant le plaquetage.
4. Préparez et ajoutez des anticorps
   1. Préparez 200 μL de solution d’anticorps 4× (100 μg/mL) dans un milieu de culture de cellules NK pour chaque anticorps test et contrôle isotype apparié.
      REMARQUE : Cette étape est modulaire et peut être adaptée à tout anticorps qui médiatise l’ADCC contre la lignée cellulaire cible choisie. Les concentrations et formulations des stocks d’anticorps peuvent varier ; Ajustez les dilutions en conséquence. Des conservateurs tels que l’azide peuvent affecter la survie des cellules cibles et la fonctionnalité des cellules NK. Bien qu’une gamme de concentrations d’anticorps puisse être testée, une concentration finale de 25 μg/mL est utilisée ici.
   2. Transférer les solutions d’anticorps à une plaque de puits profond.
   3. Ajoutez 50 μL/puits de solution d’anticorps aux cellules cibles et mélangez soigneusement en pipettant ≥5 fois.
   4. Ajouter 50 μL/puits de milieu de culture à cellules NK à des puits de contrôle sans anticorps et mélanger soigneusement en pipettant ≥5 fois.
   5. Incubez pendant 25 à 30 minutes à 37°C avec 5 % de CO₂.
5. Préparez et ajoutez les cellules NK
   1. Comptez et obtenez 2 × 10 cellules^{de 5} NK en utilisant une méthode de comptage des cellules basée sur l’exclusion de colorants (par exemple, bleu de trypan) ou une méthode validée équivalente. Ce nombre est suffisant pour trois conditions contenant des cellules NK plaquées en triple exemplaire, avec un excès pour compenser la perte par pipetage (voir Figure supplémentaire 2). Poursuivez si la viabilité est de ≥75 %, car une viabilité plus faible peut affecter la performance du test.
   2. Resuspendre les cellules à 2,5 × 10⁵ cellules/mL dans 800 μL de milieu primaire de culture NK humaine (concentration finale = 1,25 × 10⁴ cellules/50 μL).
   3. Ajoutez 50 μL/puits de cellules NK aux puits correspondants et mélangez soigneusement en pipettant ≥5 fois.
      REMARQUE : Assurez-vous que la suspension cellulaire est homogène avant le plaquetage.
   4. Ajoutez 50 μL/puits de milieu de culture pour contrôler les puits et mélangez soigneusement en pipettant ≥5 fois.
6. Mise en place de la co-culture finale
   1. Inspectez attentivement la plaque à fond rond de 96 puits pour confirmer que tous les puits contiennent 200 μL avec des niveaux de ménisque uniformes et sans bulles.
   2. Centrifugez la plaque (2 min, 100 × g, accélération = faible [ex. 2] ; décélération [frein] = faible [ex. 2]).
      REMARQUE : Cette rotation douce est importante pour se stabiliser rapidement des cellules et augmenter le contact cellule-cellule. Nous utilisons une centrifugeuse Eppendorf 5810R compatible avec un rotor à seau oscillant compatible avec un plateau de travail avec les réglages d’accélération et de décélération réglés à 2 (sur 9).
   3. Incuber pendant 16 à 18 heures (toute la nuit) à 37°C avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Cette durée d’incubation est optimisée pour la lecture de la cytotoxicité plutôt que pour la dégranulation, qui est mieux évaluée en mesurant l’expression de CD107a à des moments plus précoces (2–6 heures). Ainsi, les réponses de dégranulation maximale peuvent être sous-estimées.
      REMARQUE : Ne prolongez pas l’incubation au-delà de 18 heures, car une co-culture prolongée peut entraîner une mort excessive des cellules ciblées dans les puits témoins et une réduction de la plage dynamique entre les conditions expérimentales.
7. Effectuer la cytométrie en flux
   1. Centrifugeuse (5 min, 300 × g, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   2. Jetez le surnageant.
   3. Laver tous les puits avec 200 μL/puits de tampon FACS (2 % FBS, 2 mM d’EDTA en PBS).
   4. Préparez un mélange maître d’anticorps de surface dans un tampon FACS en ajoutant CD56-BV421 à 1:50 de dilution, CD16-BV785 à 1:50 de dilution, et CD107a-PE-Cy7 à 1:25 de dilution.
      REMARQUE : Calculez le volume total du mélange maître en fonction de la conception expérimentale de la plaque (nombre de puits × 50 μL/puits + excédent de 20 %). Les clones d’anticorps peuvent varier en intensité de coloration et en accessibilité des épitopes. Les clones utilisés dans les données représentatives sont listés dans le Table of Materials, et les clones alternatifs peuvent nécessiter une titration. Des anticorps supplémentaires peuvent être inclus pour le phénotypage des sous-ensembles des cellules NK (par exemple, KIRs, NKG2A/C/D et CD57) et les marqueurs d’activation (par exemple, CD69 et HLA-DR).
   5. Resuspendez les cellules dans 50 μL/puits de mélange maître anticorps et mélangez soigneusement en pipettant ≥5 fois.
   6. Incubez pendant 15 minutes à 4°C avec la plaque enveloppée dans du papier aluminium ou placée dans un récipient opaque pour le protéger de la lumière.
   7. Ajouter 150 μL/puits de tampon FACS.
   8. Centrifugeuse (5 min, 300 × g, accélération = maximum ; décélération [freinage] = maximum).
   9. Jetez le surnageant.
   10. Resuspendez les cellules dans 100 μL/puits de 5 μM 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans le tampon FACS et procédez immédiatement à l’acquisition par cytométrie en flux. Aucune incubation préalable à l’acquisition n’est requise.
   11. Acquérir des données par cytométrie en flux et enregistrer les canaux de fluorescence pour CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI et tout fluorophore supplémentaire.
       REMARQUE : Les réglages d’acquisition (par exemple, tensions du détecteur, compensation et gating) peuvent nécessiter une optimisation. Utilisez des contrôles non colorés et à une seule teinture pour la compensation et la configuration des grilles, avec des billes de compensation ou des cellules représentatives selon le cas. Les témoins fluorescence moins un doivent être envisagés pour les marqueurs à expression continue ou faible (par exemple, CD107a). Maintenir des paramètres et une stratégie de contrôle cohérents, incluant le verrouillage vivant/mort et l’identification des populations cibles et effecteurs, entre les expériences.
       REMARQUE : Les étapes 1 et 2 peuvent toutes deux être adaptées pour des cellules cibles adhérentes. Les cellules cibles de semences (avec leur milieu de culture respectif) dans une plaque à fond plat de 96 puits un jour avant la co-culture, à une densité atteignant environ 70 % de confluence le jour de l’analyse. Après confirmation de l’adhésion, il faut éliminer le milieu cellulaire cible et le remplacer par 100 μL de nouveau milieu NK, puis ajouter les cellules effectrices pour initier la coculture. En raison des différences de taille et de morphologie cellulaire, les paramètres d’analyse IncuCyte cellule par cellule doivent être optimisés pour chaque lignée cellulaire adhérente.
       REMARQUE : Pour les tests basés sur cytométrie en flux avec cellules adhérentes, après co-culture, centrifugez la plaque (300 × g, 5 min) et jetez le surnageant. Ajoutez 100 μL/puits de TrypLE et incubez à 37°C avec 5 % de_CO-2 pendant environ 5 à 15 minutes (selon la lignée cellulaire) pour détacher les cellules. Ajouter 100 μL/puits de tampon FACS, mélanger en pipettant de haut en bas en mouvement circulaire, puis transférer toutes les cellules sur une plaque à fond rond de 96 puits. Inspectez les puits de façon microscopique pour confirmer le décollement complet avant de procéder à la coloration (Étape 2, Sous-étape 7). Optimiser le temps d’incubation du TrypLE selon les besoins pour obtenir une suspension à cellule unique.

Résultats

Pour quantifier la cytotoxicité des cellules NK en temps réel, les cellules effectrices NK-92 conçues pour exprimer des CARs anti-BCMA ont été co-cultivées avec les cellules cibles Ramos ^BCMA+ dans une plaque noire à fond plat à fond plat de 96 puits et surveillées à l’aide d’imagerie à cellules vivantes (Figure 1A et Figure 1A supplémentaire). Des cellules effectrices ont été ajoutées à des rapports E :T de 0:1 (cible uniquement), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 et 2:1, chaque condition étant exécutée en triple exemplaire. Trois constructions CAR NK-92 différentes ont été évaluées : CAR1 sans domaine co-stimulateur, CAR2 avec un domaine costimulateur 4-1BB (CD137), et CAR3 avec un domaine costimulateur DAP10, ainsi que des cellules témoins NK-92 exprimant un vecteur uniquement ZsGreen. Toutes les cellules effectrices ont été générées par transduction lentivirale, comme décrit précédemment⁴ à l’aide de cassettes transgènes ZsGreen-P2A-CAR. Les cellules cibles de Ramos ont également été transduites avec un vecteur lentiviral codant emiRFP670. La croissance et la survie des cellules cibles ont été suivies toutes les heures sur une période de 24 heures à l’aide de l’instrument d’imagerie des cellules vivantes, mesurant la fluorescence verte pour les cellules ZsGreen⁺ NK-92, la fluorescence orange pour les cellules mortes SYTOX Orange⁺ , et la fluorescence NIR pour les cellules cibles emiRFP670⁺ (Figure 1A et Figure supplémentaires 1B et 1C).

Des images microscopiques ont été acquises à intervalles de temps définis pour visualiser les cellules effectrices, les cellules cibles vivantes et les cellules mortes lors de la co-culture (Figure 1B). La quantification de la croissance et de la survie des cellules cibles a démontré que les cellules CAR2 et CAR3 NK-92 présentaient une cinétique de mort plus rapide que les cellules CAR1 NK-92, en particulier à des moments plus précoces avec un rapport E :T de 1:1. La destruction des cellules cibles a augmenté avec des rapports E :T plus élevés, y compris chez les cellules NK-92 témoins, qui ont démontré une cytotoxicité naturelle (Figure 1C). Ces mesures mettent en lumière la capacité de l’imagerie à cellules vivantes à capturer les changements dynamiques de l’activité cytotoxique. La survie des cellules cibles a également été analysée en fonction du rapport E :T à des moments définis pour comparer la puissance de CAR NK-92. Les cellules CAR2 et CAR3 NK-92 ont montré une plus grande puissance à des rapports E :T plus bas à des moments ultérieurs (par exemple, E :T = 0,25:1 à 24 heures) et à des rapports E :T intermédiaires à des moments antérieurs (par exemple, E :T = 1:1 à 4 heures) (Figure 1D). Aucune différence significative dans la destruction n’a été observée entre les cellules effectrices NK-92 CAR2 et CAR3 à travers les analyses.

Une carte thermique intégrant le rapport E :T, le temps de co-incubation et la survie des cellules cibles offre une visualisation complète de la cytotoxicité naturelle et médiée par la CAR à travers toutes les populations d’effecteurs et permet une évaluation quantitative. Trois paramètres ont été définis pour quantifier la puissance et la cinétique : KR₅₀, le ratio tueur/cible qui atteint 50 % de tuerie (à 12 h) ; KT₅₀, le temps de co-incubation requis pour atteindre 50 % de mise à mort (avec un ratio E :T de 1:1) ; et IKI₅₀, l’indice intégré du tueur représentant la surface de la carte thermique inférieure à 50 % de survie, définie par l’isocline de survie à 50 % (Figure 1E). Ces indicateurs permettent de comparer la puissance des cellules CAR NK-92 (KR₅₀), la cinétique de tuée (KT₅₀) et la performance cytotoxique intégrée (IKI₅₀) (Figure 1F). Cette analyse démontre comment l’essai peut comparer quantitativement des plateformes NK-cell conçues sur plusieurs paramètres au sein d’une même expérience.

La cytométrie en flux avec comptage cellulaire a été utilisée pour mesurer l’ADCC en co-cultivant des cellules cibles marquées fluorescentement avec des cellules NK humaines primaires en présence ou absence d’anticorps thérapeutiques et en quantifiant la population résiduelle vivante de cellules cibles après 16 à 18 heures d’incubation (Figure 2A). Des cytomètres à flux tels que Cytek Aurora, BD Symphony ou BD Fortessa avec un échantillonneur à haut débit peuvent être utilisés. Dans la configuration représentative (Figure supplémentaire 2), les cellules cibles du lymphome dérivé du patient CD38⁺ ont été placées dans une plaque à fond rond à 96 puits, et le daratumumab (ou anticorps isotype) a été ajouté aux puits appropriés. Les cellules NK ont ensuite été co-cultivées à un ratio E :T de 0,5:1, un ratio optimisé pour ces cellules cibles afin de minimiser la destruction naturelle tout en permettant la détection de l’ADCC. Après l’incubation, une cytométrie en flux a été réalisée pour résoudre les populations cellulaires par diffusion avant et latérale, exclure les événements non viables à l’aide de DAPI, et séparer les cellules cibles ^CFSE+ des cellules CD56⁺CD16⁺ NK pour une analyse parallèle (Figure 2B). Cette conception permet une mesure simultanée de la cytotoxicité et une caractérisation phénotypique.

Figure 2. Le test de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) basé sur la cytométrie en flux permet de quantifier simultanément la survie des cellules cibles et l’activation des cellules NK. (A) Aperçu schématique de l’essai ADCC. Les cellules cibles ^{du lymphome} CD38+ marquées par CFSE ont été placées à 2,5 × 10^{4 cellules} par puits et cultivées sous cinq conditions : cellules cibles seules ; cibler les cellules avec daratumumab (25 μg/mL) ; cibler les cellules avec des cellules NK (E :T = 0,5:1) ; cibler les cellules contenant des cellules NK et du daratumumab ; et des cellules cibles avec des cellules NK et un anticorps isotype de contrôle (25 μg/mL). (B) Stratégie représentative de contrôle de cytométrie en flux. Les événements ont d’abord été déclenchés par la diffusion directe et la diffusion latérale, suivis par l’exclusion des cellules non viables à l’aide de DAPI. Les cellules cibles ont été identifiées comme des événements ^CFSE+, et les cellules NK comme des événements CD56⁺ et CD16⁺. La dégranulation des cellules NK a été évaluée par l’expression de CD107a. (C) Quantification de la survie de la cellule cible, exprimée en pourcentage par rapport à la condition de contrôle cible seule (fixée à 100 %). (D) Quantification de la dégranulation des cellules NK, indiquée par le pourcentage de cellules CD107a⁺ dans la population de cellules NK. Les barres représentent la moyenne ± l’écart-type, et les points superposés représentent des puits réplicés individuels (n = 3). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test de comparaison multiple post-hoc de Tukey. La signification statistique est indiquée comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Le critère principal est la survie de la cellule cible, calculée à l’intérieur de la porte ^CFSE+ en temps réel et normalisée à la condition cible uniquement, qui est réglée à 100 % de survie. Cette normalisation contrôle la perte spontanée de la cellule cible et permet une comparaison directe entre les conditions. Dans les données représentatives (Figure 2C), l’ajout seul de daratumumab n’a pas réduit la survie des cellules cibles, confirmant que l’anticorps n’a pas d’effet direct sur la viabilité des cellules cibles en l’absence de cellules effectrices. La co-culture avec les cellules NK seule a réduit la survie des cellules cibles à environ 70 %, indiquant une cytotoxicité naturelle de base. L’ajout de daratumumab a encore réduit la survie à environ 37 %, conformément à une augmentation de la mort médiée par les anticorps, tandis que la condition témoin de l’isotype a montré une survie d’environ 62 %, comparable à la condition uniquement NK. Les expériences réussies montrent une séparation claire entre les conditions traitées par anticorps et celles témoins présentant une forte reproductibilité entre les réplications.

Le phénotypage secondaire des cellules NK fournit une confirmation complémentaire du lien entre la destruction des cellules cibles et l’activation des effecteurs. La dégranulation des cellules NK, mesurée en pourcentage de cellules NK CD107a⁺ , était la plus faible dans la co-culture cellule-cible NK sans anticorps et la plus élevée dans la condition traitée par daratumumab (environ 31 %), le groupe isotype témoin montrant une dégranulation intermédiaire (environ 19 %), soutenant une activation médiée par les anticorps (Figure 2D). Ces résultats démontrent que le test peut distinguer la destruction des cellules cibles de l’activation des effecteurs. Bien que les tendances de dégranulation et de survie soient généralement alignées, elles ne se chevauchent pas totalement, ce qui indique qu’elles représentent des processus biologiques apparentés mais distincts.

Les expériences sous-optimales montrent généralement une séparation réduite entre les conditions, une variabilité du nombre de cellules entre les puits, une mort élevée des cellules cibles dans les puits témoins, une coloration faible du CFSE ou une dégranulation de fond élevée. Ces résultats peuvent résulter d’une faible viabilité des cellules cibles, d’une récupération incohérente des cellules NK, d’un mélange inadéquat ou d’une variabilité dans la coloration et l’acquisition. Parce que le test identifie indépendamment les compartiments cible et effecteur, il peut être étendu pour inclure un phénotypage supplémentaire des cellules cibles (par exemple, la densité d’antigènes ou l’expression des ligands) et une caractérisation plus large des cellules NK. L’inclusion d’une condition « NK uniquement » peut quantifier davantage la dégranulation de base et la viabilité des cellules NK. Cette conception multiparamètre constitue un avantage clé, permettant d’interpréter la cytotoxicité fonctionnelle parallèlement aux phénotypes immunitaires mécanistes.

Figure supplémentaire 1. Disposition représentative des plaques et flux de travail d’analyse pour le test d’imagerie cellulaire vivante sur la cytotoxicité. (A) Disposition représentative des plaques à 96 puits pour l’essai de destruction des cellules CAR NK. Quatre conditions de cellules effectrices sont disposées en quadrants, chacune testée selon des rapports E :T de 0:1 (contrôle uniquement sur cible), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 et 2:1, chaque condition étant réalisée en triple exemplaire (total de 60 puits d’essai). (B) Configuration représentative de l’analyse cellule par cellule non adhérente dans le logiciel IncuCyte 2021C, illustrant le démélange spectral, la segmentation et les paramètres de masquage utilisés pour identifier les cellules effectrices et cibles individuelles tout en excluant les débris et les agrégats. (C) Stratégie représentative de sélection cellule par cellule utilisant la fluorescence NIR versus SYTOX Orange pour définir la population cellulaire cible vivante. Les puits uniquement cibles et les puits de co-culture à un moment précis (t = 4 h) sont utilisés pour confirmer la séparation entre populations de cellules vivantes et mortes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 supplémentaire. Disposition représentative des plaques pour un test ADCC basé sur cytométrie de flux. Disposition représentative des plaques à 96 puits illustrant cinq conditions expérimentales placées en triple mesure sur les rangées B–D et colonnes 2–6 (puits d’essai totaux = 15) : (1) contrôle cible uniquement, (2) cellules cibles avec daratumumab, (3) cellules cibles avec cellules NK, (4) cellules cibles avec cellules NK et daratumumab, et (5) cellules cibles avec cellules NK et anticorps isotype témoin. Les cellules cibles ont été placées à 2,5 × 10^{4 cellules} par puits, et des cellules NK ajoutées à 1,25 × 10⁴ cellules par puits pour obtenir un rapport E :T de 0,5:1. Des anticorps ont été utilisés à une concentration finale de 25 μg/mL. Les puits environnants ont été remplis de PBS pour minimiser l’évaporation. La condition de cible seule a été utilisée pour normaliser la survie des cellules cibles, et le contrôle isotype a pris en compte les effets de formulation des anticorps indépendamment de la spécificité de l’antigène. Une optimisation du rapport E :T peut être nécessaire selon la susceptibilité de la lignée cellulaire cible. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ces protocoles proposent deux approches complémentaires pour quantifier la cytotoxicité des cellules NK dans un format standardisé de plaques à 96 puits. L’étape 1 utilise l’imagerie en temps réel de cellules vivantes pour surveiller en continu la perte de cellule cible et est bien adaptée à l’évaluation de la cinétique des tueries naturelles et médiées par la CAR sur plusieurs rapports E :T. L’étape 2 utilise la cytométrie en flux pour quantifier l’ADCC après une période de co-incubation définie tout en séparant simultanément les compartiments cible et effecteur pour l’analyse phénotypique¹⁷. Ces méthodes, présentées comme des plateformes complémentaires pouvant être utilisées pour modéliser des processus biologiques distincts, sont également facilement interchangeables. Les cellules NK humaines primaires peuvent être utilisées pour des tests ADCC basés sur l’imagerie cellulaire vivante et peuvent également être conçues pour la destruction médiée par CAR dans les tests de cytométrie en flux. De plus, bien que les cellules NK-92 de type sauvage ne disposent pas d’expression^{CD16 18}, l’introduction de CD16 (par exemple, par transduction lentivirale) permet facilement aux cellules NK-92 de médiatiser des ADCC puissants. Ainsi, les deux tests peuvent être adaptés aux besoins scientifiques et translationnels individuels.

Plusieurs étapes sont particulièrement importantes pour la reproductibilité dans les deux tests. De petits changements dans le nombre de cellules effecteurs et le phénotype peuvent modifier radicalement la survie des cellules cibles. Un comptage cellulaire précis et une resuspension complète lors du plaquage sont essentiels pour minimiser les écarts dans le nombre de cellules et le mélange incomplet. De même, la préparation cellulaire doit être maintenue cohérente entre les expériences, y compris la viabilité, le temps de récupération et l’exposition préalable aux cytokines, afin d’assurer une fonctionnalité uniforme des effecteurs. La géométrie des plaques est un autre facteur clé de la performance de l’essai. Dans le flux d’imagerie à cellules vivantes, les plaques à fond plat soutiennent une acquisition d’image stable et une analyse de champ cohérente, tandis que dans le flux de cytométrie en flux, les plaques à fond rond favorisent le contact cellule-cellule et facilitent la récupération des co-cultures non adhérentes à l’extrémité. De plus, la qualité du marquage fluorescent doit être confirmée avant le test, car une mauvaise discrimination des cellules cibles par imagerie ou une séparation faible de la CFSE par cytométrie en flux compromettent la quantification et l’interprétation.

Ces deux flux de travail présentent des considérations techniques distinctes. Dans l’analyse d’imagerie à cellules vivantes, les causes courantes de mauvaise qualité des données incluent un plaque cellulaire inégal, un regroupement ou un regroupement cellulaire dense, ainsi que des seuils sous-optimaux pour l’analyse d’image, tous facilement corrigables. Ces problèmes peuvent fausser le nombre de cellules et entraîner un suivi incohérent au fil du temps. Dans le test basé sur la cytométrie en flux, les résultats sous-optimaux sont plus souvent causés par une forte mort cellulaire cible de fond, une faible séparation des populations cible et effectrice, une mauvaise coloration des anticorps ou un pipetage incohérent entre puits de réplication. Parce que ces tests sont conçus pour une analyse comparative, l’inclusion de contrôles internes appropriés est essentielle pour l’interprétation, y compris les contrôles uniquement cibles pour la normalisation et les contrôles négatifs appariés pour les conditions spécifiques aux anticorps ou au CAR.

Plusieurs limitations partagées et spécifiques à chaque test doivent être prises en compte avec ces méthodes. L’analyse d’imagerie des cellules vivantes fournit une résolution temporelle mais dépend de paramètres précis de marquage fluorescent et d’analyse d’image, qui peuvent tous deux être influencés par le regroupement cellulaire, le chevauchement spectral ou les changements de morphologie lors de la co-culture¹⁵. Dans certains cas, notamment lorsque les tests impliquent des cellules effectrices primaires, obtenir un marquage fluorescent adéquat sans modifier la dynamique de la mort est difficile ou peu réalisable. Le test basé sur la cytométrie en flux offre une résolution phénotypique plus élevée à un point final défini, mais il ne distingue pas indépendamment la destruction précoce de la fin de la mort à moins que plusieurs points temporels appariés ne soient collectés, ce qui peut être coûteux et prendre du temps¹⁷. De plus, les mesures de point final peuvent refléter non seulement la mort des cellules cibles, mais aussi des différences dans la prolifération des cellules cibles, l’attrition des effecteurs ou la récupération lors de la manipulation des échantillons. Les lectures mécanistes telles que CD107a sont donc mieux interprétées comme des indicateurs complémentaires de l’activation des cellules effectrices, plutôt que comme des substituts directs à l’élimination par cellules^{cibles 19}. Plus largement, aucune des deux plateformes ne reproduit entièrement l’architecture spatiale, les interactions stromales, les gradients de cytokines ou les contraintes de trafic qui façonnent la fonction des cellules NK in vivo.

Plusieurs facteurs biologiques doivent également être pris en compte lors de l’interprétation des tests de destruction des cellules NK. La variabilité donneur à donneur est intrinsèque aux expériences avec les cellules NK humaines primaires, qui diffèrent par leur potentiel cytotoxique et leur composition de sous-ensemble en raison de l’âge du donneur, du sexe, des antécédents de maladies infectieuses et des polymorphismes des^{récepteurs 20}. L’utilisation des cellules NK-92 réduit considérablement la variabilité, mais ces cellules peuvent tout de même présenter des modifications liées à la source et au passage¹⁸. Notre protocole atténue les différences techniques ou expérimentales grâce à des paramètres standardisés et à des comparaisons comparables pour évaluer plus précisément ces facteurs biologiques. Lorsque cela est possible, nous recommandons d’utiliser des plages de passage définies pour NK-92 avec des seuils de viabilité fixes. Pour les cellules NK primaires, les tests doivent utiliser des cellules NK provenant de plusieurs donneurs pour chaque condition, avec des analyses statistiques tenant compte de la variabilité entre donneurs (par exemple, modèles appariés ou à effets mixtes), étant donné que les différences relatives entre les affections sont généralement préservées entre les donneurs. De plus, des marqueurs supplémentaires des cellules NK (par exemple, KIR, NKG2A/C/D et CD57) peuvent être intégrés dans les panels d’anticorps utilisés pour la cytométrie de flux afin de comparer les fréquences des sous-ensembles entre les donneurs et d’évaluer l’activation spécifique des cellules NK (c’est-à-dire l’expression CD107a et CD69), facilitant ainsi l’interprétation des résultats. Enfin, pour tous les tests de destruction des cellules NK, certains scénarios supplémentaires doivent être pris en compte. L’expression d’antigènes ciblés sur les cellules NK, soit par expression endogène, soit par acquisition d’antigènes des cellules cibles via la trogocytose, peut entraîner un fratricide des cellules NK et des résultats déroutants. Par exemple, le daratumumab peut cibler CD38 exprimé sur les cellules NK et induire le fratricide²¹, limitant l’ampleur de l’ADCC par rapport aux cibles visées. Heureusement, l’imagerie des cellules vivantes et les tests de cytométrie en flux permettent de quantifier les cellules NK pour évaluer le fratricide.

Malgré ces limites, l’utilisation combinée de l’imagerie à cellules vivantes et de la cytométrie en flux offre un cadre pratique pour les tests fonctionnels reproductibles des cellules NK à travers une gamme d’applications fondamentales et précliniques. Le flux de travail d’imagerie est avantageux lorsque le comportement temporel est important, comme distinguer les réponses citotoxiques rapides de les réponses cytotoxiques retardées ou comparer la cinétique de destruction entre les conceptions^{CAR 22}. Le flux de travail basé sur la cytométrie en flux est avantageux lorsque les lectures fonctionnelles doivent être interprétées parallèlement aux phénotypes des cellules effecteurs et des cellules cibles au sein du même échantillon. Ensemble, ces approches permettent une évaluation quantitative de la tuerie naturelle, de la cytotoxicité médiée par la CAR et de l’ADCC à l’aide de plateformes expérimentales largement accessibles. En établissant un cadre standardisé et évolutif, ce système facilite un benchmarking rigoureux et une interrogation mécaniste à travers les modalités basées sur les cellules NK, accélérant le développement et la traduction clinique des immunothérapies de nouvelle génération.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Milieu de base pour les milieux de culture de cellules NK-92 et de cellules NK humaines primaires (voir le protocole pour la formulation complète)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marqueur de dégranulation pour la cytométrie en flux
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Cytométrie en flux
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Cytométrie en flux
Centrifugeuse de bureau avec rotor à godets compatible avec les tubes de 15 ml et les plaques à 96 puits (Centrifugeuse Eppendorf 5810R)	Eppendorf	5811000015	Utilisée pour le pelletage cellulaire et la centrifugation des plaques (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Colorant de prolifération cellulaire pour le marquage des cellules cibles
Cytomètre à flux spectral Cytek Aurora (ou équivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Utilisé pour l'acquisition et l'analyse en cytométrie en flux
DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole)	BioLegend	422801	Colorant nucléaire pour la discrimination vivant/mort
Plaques à 96 puits à fond plat	USA Scientific	1896-2110	Utilisées pour la préparation des anticorps
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Réactif de cryopréservation
Sérum bovin fœtal (FBS)	Avantor	76419-584	Supplément des milieux de base ; utilisé dans le tampon FACS (FBS 2 %)
Bain-marie polyvalent, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Pour la décongélation des cellules
GlutaMAX (complément de L-alanyl-L-glutamine)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Source stable de glutamine
Sérum AB humain	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Supplément pour les milieux de culture de cellules NK humaines primaires
Système d'imagerie en direct des cellules vivantes IncuCyte SX5	Sartorius	4816	Imagerie en direct des cellules vivantes en temps réel et analyse cellule par cellule
Compteur de cellules à double fluorescence LUNA-FL (ou équivalent)	Logos Biosystems	L20001	Dénombrage automatisé des cellules
Parafilm M (rouleau de 4 po × 250 pi)	Genesee	16-101	Scellage et stockage des plaques
Tampon phosphate-buffered saline (PBS), stérile (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Utilisé pour les lavages et la préparation du tampon FACS
Poly-D-lysine (0,1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Réactif de revêtement de plaques
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiotique
Interleukine-2 (IL-2) humaine recombinante	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
Kit d'enrichissement des cellules NK humaines RosetteSep	STEMCELL Technologies	15065	Cocktail d'enrichissement des cellules NK humaines
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Colorant de viabilité pour l'imagerie des cellules vivantes
Trypan Blue 0,4 %	Gibco	15250-061	Colorant de viabilité pour le dénombrement des cellules
TrypLE Express Enzyme (1X), sans phénol rouge	Thermo Fisher Scientific	12604039	Pour le détachement des cellules adhérentes
UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Utilisé pour la préparation du tampon FACS
Tubes de centrifugation à fond conique de 15 ml	Corning	352097	Stérile
Plaques de culture tissulaire à 24 puits (traitées pour la culture tissulaire)	Corning	3524	Utilisées pour la récupération des cellules NK
Plaques à 96 puits à fond rond transparent (traitées pour la culture tissulaire)	Corning	3799	Utilisées pour les essais de co-chercher et de cytométrie en flux
Plaques à 96 puits à fond plat transparent noir en polystyrène (traitées pour la culture tissulaire)	Corning	3603	Compatible avec les systèmes d'imagerie des cellules vivantes