Cette étude n’a utilisé que des ensembles de données publiques et désidentifiés et n’a pas impliqué d’expérimentation directe sur l’humain ou l’animal ; par conséquent, une approbation supplémentaire du comité d’éthique ni un consentement éclairé n’étaient pas nécessaires.
Téléchargement et traitement des données
Les données de séquençage de l’ARN et les informations cliniques correspondantes pour le carcinome squameux pulmonaire (LUSC) ont été obtenues à partir de la base de données The Cancer Genome Atlas (TCGA) via le portail de données Genomic Data Commons dans le cadre du projet TCGA-LUSC. La matrice d’expression TCGA-LUSC utilisée dans cette étude était basée sur les valeurs FPKM. Les valeurs d’expression génique ont été transformées et normalisées avant les analyses en aval. Les variables cliniques comprenaient l’âge, le sexe, le stade tumoral, le stade pathologique de la TNM, le grade, le temps de survie et le statut de survie lorsque disponible. Un total de 489 cas de TCGA-LUSC ont été initialement prélevés, et 381 patients présentant des profils d’expression complets et des informations de survie globale ont été inclus dans la construction du modèle pronostique et l’évaluation interne.
Des ensembles de données de validation indépendants ont été téléchargés depuis la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) le 3 janvier 2026. GSE30219 était basé sur la plateforme GPL570 et comprenait 307 patients atteints de LUSC disposant d’informations disponibles sur l’expression et la survie globale. GSE37745 était également basé sur la plateforme GPL570 et comprenait 196 patients atteints de LUSC disposant d’informations disponibles sur l’expression et la survie globale. GSE57148 était basée sur la plateforme GPL11154 et comprenait 91 tissus pulmonaires normaux et 98 tissus pulmonaires de patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), soit un total de 189 échantillons. GSE57148 a été utilisé pour identifier les gènes différenciellement exprimés associés à la BPCO, tandis que GSE30219 et GSE37745 étaient utilisés comme cohortes externes indépendantes de validation.
Pour les ensembles de données GEO, l’annotation par sonde était effectuée à l’aide du package d’annotation R correspondant et des fichiers d’annotation de plateforme. Les identifiants de sonde ont été convertis en symboles génétiques officiels. Lorsque plusieurs sondes correspondaient au même gène, la sonde avec la valeur moyenne d’expression la plus élevée était conservée pour représenter ce gène. Aucun gène manquant du modèle n’a été détecté dans les jeux de données de validation après la correspondance gène-symbole. TCGA-LUSC, GSE30219 et GSE37745 ont été analysés comme cohortes générales de LUSC car le statut de comorbidité BPCO au niveau du patient n’a pas été confirmé dans les annotations utilisées pour cette analyse.
Comme les ensembles de données TCGA et GEO étaient générés à partir de différentes plateformes d’expression, la normalisation multiplateforme et la correction d’effets batch ont été réalisées en utilisant des méthodes de prétraitement standard basées sur R avant l’application du modèle. Le modèle de risque a été entraîné dans la cohorte TCGA-LUSC puis évalué indépendamment dans chaque cohorte externe GEO, plutôt que par fusion directe de toutes les cohortes. L’analyse d’expression différentielle a été réalisée à l’aide du package limma R. Les gènes associés à la BPCO exprimés différenciellement dans GSE57148 ont été dépistés à l’aide de |log2FC| > 0,263 et P < 0,05. Ce seuil log2FC correspond à un changement d’environ 1,2 fois et a été utilisé comme critère de dépistage exploratoire pour conserver les gènes potentiellement pertinents associés à la PANoptose. Un total de 277 gènes associés à la PANoptose ont été sélectionnés à partir d’études précédemment publiées sur l’apoptose, la pyroptose, la nécroptose et la PANoptose, et sont présentés dans le Tableau Supplémentaire 1.
Analyse d’enrichissement fonctionnel des gènes
Pour clarifier les implications fonctionnelles des gènes PANoptose associés à la MPOC sélectionnés, des analyses d’enrichissement de Gene Ontology (GO) et de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées à l’aide du package clusterProfiler R et de l’organisation. Hs.eg.db dossier d’annotation. Les catégories de processus biologique GO, composante cellulaire et fonctions moléculaires ont été évaluées. L’analyse d’enrichissement des voies KEGG a été réalisée pour identifier les voies de signalisation associées aux gènes sélectionnés. Les valeurs P ont été ajustées pour plusieurs tests en utilisant la méthode du taux de fausse découverte de Benjamini-Hochberg, lorsque cela est applicable. Les termes d’enrichissement avec P < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs dans cette analyse exploratoire. Les graphiques d’enrichissement ont été générés en utilisant ggplot2.
Analyse non supervisée du regroupement des schémas d’expression génique associés à la PANoptose
Pour explorer l’hétérogénéité moléculaire associée à l’expression génique associée à PANoptose dans LUSC, un regroupement consensuel a été réalisé à l’aide du package Consensus ClusterPlus R. Les échantillons de LUSC ont été regroupés selon les profils d’expression des gènes de PANoptose associés à la survie. Le regroupement hiérarchique a été appliqué avec la distance de corrélation de Pearson. Le nombre maximal de clusters a été fixé à six, et 1 000 itérations de rééchantillonnage ont été effectuées pour évaluer la robustesse des clusters. Le nombre optimal de grappes a été déterminé en évaluant la matrice de consensus, la courbe de la fonction de distribution cumulative, le graphique de l’aire delta et l’interprétabilité biologique des groupes résultants. Sur la base de ces critères, k = 2 a été sélectionné pour une analyse en aval. Les différences de survie entre les deux groupes moléculaires ont été évaluées à l’aide de l’analyse de Kaplan-Meier et du test log-rank.
Analyse des différences de microenvironnement immunitaire entre sous-types
Pour comparer les caractéristiques du microenvironnement immunitaire entre sous-types moléculaires, l’infiltration des cellules immunitaires a été estimée à l’aide de l’algorithme de déconvolution CIBERSORT avec la matrice de signature leucocytaire LM22. L’analyse a été réalisée en R à l’aide des packages e1071 et preprocessCore. Les valeurs P de la permutation CIBERSORT ont été enregistrées pour évaluer la fiabilité des estimations de déconvolution. Parce que cette étude était exploratoire et basée sur des données transcriptomiques rétrospectives, les différences entre les cellules immunitaires ont été interprétées comme des schémas d’infiltration immunitaire inférés par ordinateur plutôt que comme des mesures cellulaires directes.
L’algorithme ESTIMATE a été utilisé pour calculer le score stromal, le score immunitaire, le score ESTIMATE et la pureté tumorale pour chaque échantillon tumoral. La GSVA a été appliquée pour estimer les scores d’enrichissement au niveau des voies à partir de jeux génétiques sélectionnés. Les différences par groupe dans les fractions des cellules immunitaires, des gènes de contrôle immunitaire, des gènes de la famille HLA et des scores dérivés de ESTIMATE ont été évaluées à l’aide de tests non paramétriques. Pour plusieurs comparaisons liées au système immunitaire, la correction de Benjamini-Hochberg a été appliquée lorsque cela était approprié ; les analyses rapportées utilisant des valeurs nominales de P ont été interprétées comme exploratoires. L’analyse de corrélation de rang de Spearman a été utilisée pour évaluer les associations entre l’expression génique et les marqueurs liés à l’immunité, avec à la fois les coefficients de corrélation et les valeurs P rapportés lorsque cela était applicable. Les différences de transcription HLA ont été interprétées comme des modifications transcriptionnelles liées à la présentation de l’antigène plutôt que comme des preuves fonctionnelles directes d’une capacité accrue à présenter l’antigène.
Établissement d’une signature pronostique liée aux gènes associés à la PANoptose
La cohorte TCGA-LUSC avec des profils d’expression complets et des informations de survie globale a été utilisée pour la construction pronostique du modèle. Parmi les 489 cas initialement récupérés de TCGA-LUSC, 381 patients présentant des données complètes de survie globale ont été inclus dans l’analyse pronostique. Ces patients ont été répartis aléatoirement en une cohorte de formation et une cohorte interne de tests avec un ratio de 7:3. La randomisation stratifiée a été réalisée selon le statut de survie afin de maintenir une répartition comparable des événements de survie entre les cohortes d’entraînement et de test.
Dans la cohorte d’entraînement, la régression des risques proportionnels univariés de Cox a d’abord été utilisée pour évaluer l’association entre chaque gène candidat associé à la PANoptose et la survie globale. Les gènes avec P < 0,05 étaient considérés comme des gènes pronostiques candidats et ont ensuite été intégrés dans la régression LASSO Cox à l’aide du package glmnet R. Une validation croisée multipliée par dix a été utilisée pour sélectionner le paramètre de pénalité optimal et réduire le surapprentissage. Sur la base des coefficients de régression de Cox du LASSO et des valeurs d’expression génique normalisées correspondantes, un score de risque individualisé a été calculé pour chaque patient à l’aide de la formule suivante :
Score de risque = Σ(coefi × Xi)
où coefi représente le coefficient de régression de chaque gène sélectionné et Xi représente la valeur d’expression normalisée du gène correspondant. Le modèle pronostique final contenait 12 gènes : GSDMD, IL18, NFKBIA, PIK3CA, IL1B, BIRC3, MCL1, PSMB10, LMNA, CFLAR, IL1R1 et AKT3. L’équation complète basée sur le score de risque basée sur les coefficients est fournie dans le Tableau Supplémentaire 2.
Le score médian de risque dans la cohorte de formation a été utilisé comme seuil pour classer les patients en groupes à haut risque et à faible risque. La même formule de score de risque a été appliquée à la cohorte interne de test et aux cohortes externes de validation GSE30219 et GSE37745. L’analyse de survie de Kaplan-Meier, les tests de rang logarithmique et l’analyse de la courbe de caractéristique de fonctionnement du récepteur dépendante du temps ont été utilisées pour évaluer la performance du modèle. Comme les ensembles de données de validation ont été générés à l’aide de plateformes microarray et ne contenaient pas d’annotation confirmée de comorbidité de la BPCO, la validation externe a été interprétée comme une évaluation rétrospective dans des cohortes LUSC indépendantes plutôt que comme une validation chez des patients LUSC comorbides (BPCO) cliniquement confirmés.
Analyse de la prédiction de la sensibilité aux médicaments
La sensibilité au médicament a été estimée à l’aide du package pRRophetic R, qui prédit la réponse au médicament à partir des profils d’expression génique tumorale sur la base de données de référence pharmacogénomiques de la base de données Genomics of Drug Sensitivity in Cancer. Des valeurs prédites de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) ont été calculées pour chaque échantillon de patient. Les matrices d’expression étaient traitées selon les besoins d’entrée pRRophétique, et la correction par effet batch était réalisée en utilisant le flux de travail standard compatible pRRophétique. Les valeurs prédites d’IC50 ont été rapportées sur l’échelle de sortie pRRophétique.
Huit agents candidats, dont le sorafenib, le gefitinib, la bléomycine, le bosutinib, l’étoposide, la lénalidomide, le camptothécine et le méthotrexate, ont été évalués dans un panel exploratoire de sensibilité aux médicaments. Les différences dans les valeurs prédites d’IC50 entre les groupes à haut et faible risque ont été comparées à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Ces résultats ont été interprétés comme des estimations computationnelles de la sensibilité aux médicaments plutôt que comme une réponse à la chimiothérapie clinique ou une résistance aux médicaments confirmée expérimentalement.
Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel R. Les variables continues entre deux groupes ont été comparées à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon, tandis que des comparaisons entre plus de deux groupes ont été réalisées à l’aide du test de Kruskal-Wallis lorsque cela est approprié. La survie globale a été définie comme le principal objectif de survie. Des courbes de survie de Kaplan-Meier ont été générées pour comparer les différences de survie entre les groupes, et la signification statistique a été évaluée à l’aide du test log-rank. Univarié et multivarié
Des analyses de régression des risques proportionnels de Cox ont été utilisées pour évaluer les associations pronostiques entre variables cliniques, groupe à risque et survie globale. Des variables ayant une pertinence clinique ou une signification statistique dans l’analyse de Cox univariée ont été prises en compte pour la régression de Cox multivariée. L’hypothèse des risques proportionnels a été évaluée à l’aide des résidus de Schoenfeld. Les variables cliniques manquantes ont été traitées à l’aide d’une analyse complète de cas pour la régression de Cox et la construction de nomogrammes. La collinéarité entre variables cliniques a été évaluée avant la modélisation multivariée.
Des courbes ROC dépendantes du temps ont été utilisées pour évaluer la performance prédictive du modèle de risque pour la survie globale sur 1, 3 et 5 ans. Un nomogramme a été construit à partir de variables conservées dans le modèle multivarié ou de variables disposant d’une disponibilité clinique suffisante. Des graphiques d’étalonnage ont été utilisés pour comparer les probabilités de survie globale prédites et observées. L’analyse de la courbe de décision a été réalisée comme une évaluation exploratoire du bénéfice net potentiel à travers certaines probabilités seuils.
L’analyse de corrélation de rang de Spearman a été utilisée pour évaluer les associations entre l’expression génique et les caractéristiques liées au système immunitaire. Des coefficients de corrélation et des valeurs P ont été rapportés lorsque cela était applicable. Pour les comparaisons multiples, la correction du taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg a été appliquée lorsque cela était approprié. Les analyses rapportées utilisant des valeurs nominales de P ont été considérées comme exploratoires. Une valeur P bilatérale < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.