Test unitaire formant une colonie adapté pour les cellules mononucléaires de moelle osseuse et du sang périphérique dérivées du patient

Résumé

Ce protocole décrit une procédure permettant d’induire la différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines dérivées de la moelle osseuse du patient et des cellules mononucléaires du sang périphérique. Le test utilise un milieu de culture semi-solide soutenant l’engagement des lignées érythroïdes et myéloïdes et intègre des métriques standardisées pour la classification des colonies reproductibles pour la caractérisation préclinique des médicaments.

Résumé

Le test de l’unité formatrice de colonies (UFC) est une technique fondamentale pour étudier les maladies hématologiques, notamment les syndromes myélodysplasiques (MDS) et la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Cet essai utilise des milieux semi-solides complétés par des combinaisons définies de cytokines pour soutenir la croissance tridimensionnelle et la différenciation spécifique à la lignée des cellules progénitrices érythroïdes et myéloïdes. Cependant, les échantillons de sang périphérique et de moelle osseuse provenant des patients présentent des défis techniques en raison de la viabilité réduite, de la sensibilité accrue à la manipulation et de la variabilité de la croissance des colonies. De plus, les directives existantes pour identifier et compter les colonies montrent une variabilité importante dans la définition de la taille des colonies et des types de lignées, limitant la reproductibilité entre les études. Le protocole décrit ici est optimisé pour la croissance et la différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d’échantillons de patients atteints de MDS et de LMA. Le protocole met l’accent sur une manipulation douce des cellules, le traitement stérile des échantillons de patients, des conditions de culture optimisées et des durées de croissance adaptées aux cellules dérivées du patient. Ce protocole fournit un cadre pratique pour les tests CFU utilisant des échantillons dérivés des patients et établit une métrique standard pour le comptage et l’analyse cohérents des colonies dans la recherche sur les cancers hématologiques.

Introduction

L’hématopoïèse est un processus strictement régulé dans lequel les cellules souches hématopoïétiques (CSH) résidant dans les niches de la moelle osseuse donnent naissance à toutes les lignées cellulaires sanguines matures. À travers une série hiérarchique d’événements de différenciation, les HSC génèrent des progéniteurs multipuissants qui s’engagent progressivement dans les lignées érythroïdes, myéloïdes et lymphoïdes avant de subir une maturation terminale en cellules sanguines circulantes fonctionnelles. Ce processus est régi par la signalisation coordonnée au sein du microenvironnement de la moelle osseuse ainsi que par des mécanismes intrinsèques de régulation transcriptionnelle et épigénétique. Les perturbations de ces voies régulatrices, notamment par l’accumulation de mutations génétiques ou somatiques dans les HSC, peuvent altéré la différenciation normale et entraîner une expansion clonale de progéniteurs anormaux. De telles altérations peuvent finalement entraîner des troubles hématologiques caractérisés par une hématopoïèse et des cytopénies inefficaces, notamment les syndromes myélodysplasiques (MDS) et la leucémie myéloïde aiguë (LMA⁾1,2,3,4,5.

Le test de l’unité formatrice de colonies (UFC) est une technique in vitro bien établie pour évaluer le potentiel de différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC). Initialement développé comme un test à court terme pour mesurer la capacité proliférative et différenciatrice des progéniteurs hématopoïétiques ^6,7,8, le test UFC est depuis devenu un outil largement utilisé en hématologie clinique^{et expérimentale 9}. En laboratoire préclinique, le test est fréquemment utilisé pour évaluer l’impact des perturbations génétiques ou des traitements candidats sur la différenciation hématopoïétique. Dans le cadre de la recherche sur la MDS et la LMA, les tests CFU fournissent un résultat fonctionnel pour comprendre comment les altérations moléculaires et génétiques influencent la capacité de différenciation de la moelle osseuse ou des cellules sanguines périphériques dérivées du patient.

Le test d’UFC consiste à cultiver des HSPC dans un milieu semi-solide à base de méthylcellulose, complété par des facteurs de croissance définis qui soutiennent l’expansion et la différenciation spécifiques à la lignée. Dans ces conditions, les cellules progénitrices prolifèrent et donnent naissance à des colonies distinctes, qui peuvent être classées morphologiquement selon l’identité de la lignée. Un milieu semi-solide à base de méthylcellulose, disponible commercialement, optimisé pour la différenciation érythroïde et myéloïde, est utilisé dans ce protocole. Le milieu contient une combinaison de cytokines, dont l’interleukine-3 (IL-3), l’interleukine-6 (IL-6), le facteur des cellules souches (SCF), l’érythropoïétine (EPO), le facteur stimulant la colonie granulocytaire (G-CSF) et le facteur stimulant la colonie granulocyte-macrophage (GM-CSF). Ensemble, ces facteurs soutiennent la croissance des progéniteurs érythroïdes tels que les progéniteurs unitaires érythroïdes formant des colonies (CFU-E) et les progéniteurs unitaires formant des ruptures (BFU-E), les progéniteurs granulocytes-macrophages myéloïdes (CFU-GM), et les progéniteurs multipuissants tels que les granulocytes, érythrocytes, monocytes et mégacaryocytes (CFU-GEMM^)10,11.

Malgré son utilité étendue, le milieu semi-solide mentionné ci-dessus est limité dans sa capacité de différenciation, car il ne supporte pas adéquatement la différenciation des mégacaryocytes et des plaquettes. Pour ces applications, des formulations plus spécialisées contenant des facteurs de croissance plaquettaire sont plus appropriées ; Cependant, ils ne sont pas dans le cadre du protocole défini. Dans l’ensemble, grâce à une sélection minutieuse de la formulation des milieux combinée à une évaluation morphologique et des analyses en aval telles que la cytométrie en flux, les chercheurs peuvent évaluer efficacement la sensibilité des médicaments grâce à l’analyse de l’engagement de lignée et du potentiel^{de différenciation 12}.

Dans cette étude, le test d’UFC est utilisé pour étudier le potentiel thérapeutique des thérapies combinées pour le traitement du MDS à haut risque récidivent/réfractaire. La pyriméthamine est un antifolate cliniquement approuvé utilisé pour traiter la toxoplasmose et le paludisme parasitaire, et a récemment été étudié comme agent^{anticancéreux} 13,14,15. Des études récentes ont démontré que le traitement à la pyrimétamine pourrait agir par l’inhibition des voies clés qui régulent la synthèse de novo de^{la pyrimidine 16}. Dans ce protocole, des tests d’UFC sont utilisés pour étudier l’efficacité clinique de la pyrimétamine en thérapie à agent unique et en combinaison avec le Venetoclax, qui est actuellement une thérapie de première ligne pour le traitement du MDS et^{de la LMA 17,18}.

Malgré son utilité généralisée, le test CFU présente plusieurs limitations techniques. L’identification et la classification des colonies reposent fortement sur des critères morphologiques, qui peuvent introduire une variabilité entre les observateurs et entre les centres^{de recherche} 6,19,20,21. De plus, les échantillons dérivés de patients provenant d’individus atteints de MDS ou de LMA présentent souvent une viabilité cellulaire réduite, une fragilité accrue et une hétérogénéité, ce qui peut compliquer la formation des colonies et les analyses en aval⁹. La préparation des colonies pour une caractérisation ultérieure, y compris la cytométrie en flux, peut donc nécessiter une manipulation soigneuse afin de préserver l’intégrité cellulaire. L’absence de procédures standardisées pour l’identification, le comptage et l’analyse en aval des colonies contribue encore à la variabilité entre les études. Ces considérations techniques soulignent la nécessité de procédures standardisées optimisées spécifiquement pour les échantillons hématopoïétiques dérivés des patients.

Ce protocole décrit un flux de travail optimisé pour réaliser des tests d’UCF utilisant des cellules mononucléaires dérivées de prélèvements primaires de moelle osseuse ou de sang périphérique de patients atteints de cancers hématologiques. Cette approche se concentre sur des stratégies pratiques pour manipuler des cellules sensibles dérivées des patients, établir des conditions de culture fiables et mettre en œuvre des critères cohérents pour l’identification et la quantification des colonies. En fournissant des conseils méthodologiques détaillés et en mettant l’accent sur les pratiques d’analyse reproductible, ce protocole vise à faciliter une évaluation plus fiable de la différenciation hématopoïétique et de la réponse thérapeutique dans les études précliniques de la MDS et de la LMA.

Protocole

Cette étude utilise des biospécimens humains désidentifiés obtenus à partir d’une biobanque dans le cadre d’un protocole approuvé par l’Institutional Review Board, « Biologie moléculaire des troubles hématologiques bénins et malins » (Protocole IRB #200536), au Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives éthiques institutionnelles. Tous les réactifs et équipements sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de cellules mononucléaires de moelle osseuse ou de sang périphérique dérivées du patient

REMARQUE : Selon les recommandations courantes de manipulation des échantillons de patients, il est recommandé de porter une blouse longue longue et des gants jetables résistants aux déchirures de laboratoire et de travailler sous une cagoule de culture cellulaire de laboratoire pour se protéger personnellement contre l’exposition aux agents pathogènes transmis par le sang. Toutes les pointes de pipette et les pipettes sérologiques qui entrent en contact avec les cellules du patient doivent être trempées dans une solution d’eau de Javel à 10 % pendant au moins 30 minutes avant leur élimination dans les déchets biologiques.

1. Préparation expérimentale
   1. Des milieux IMDM chauds, du sérum bovin fœtal (FBS) et des antibiotiques pénicilline-streptomycine (Pen-streptococcique) à 37 °C pendant au moins 30 minutes.
   2. Dégel un milieu semi-solide à 4 °C pendant la nuit. Le jour de l’assiette, chauffez la bouteille à température ambiante (RT) pendant au moins 30 minutes.
   3. Stérilisez la hotte de culture cellulaire avec une stérilisation UV pendant 15 minutes, puis pulvérisez les surfaces de la hotte, les pipettes et les supports à tubes avec de l’éthanol à 70 % (EtOH).
   4. Préparez un bécher de déchets contenant une solution d’eau de Javel à 10 %, suffisamment grande pour collecter les pointes de pipette contaminées et les pipettes sérologiques.
   5. Obtenir des cellules mononucléaires de la moelle osseuse ou du sang périphérique isolées par centrifugation à gradient de densité. Les cellules peuvent être utilisées le jour même de la collecte ou à partir d’échantillons congelés bio-bancaires.
2. Si les échantillons sont congelés, dégelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que la majeure partie de la glace ait fondu et ne reste qu’un petit cristal de glace. Placez immédiatement les échantillons sur la glace après décongélation.
   REMARQUE : Les échantillons des patients sont très sensibles au dégel. Il est important de décongeler les échantillons aussi rapidement que possible et par lots afin de minimiser la mort cellulaire.
3. Suspendre les cellules dans un milieu de croissance complet chauffé de 5 mL (milieu IMDM complété par 4 % de FBS et 1 % de Pen-Streptocoque).
4. Déterminez la concentration et la viabilité cellulaires à l’aide d’un colorant AO/PI et d’un compteur cellulaire automatisé.
5. Centrifugez les cellules à 350 x g pendant 5 minutes à température ambiante pour les pelleter. Jetez le surnageant.
6. Resuspendre les cellules dans une solution stérile de 5 mL de la solution de Dulbecco tamponnée phosphate (DPBS). Répétez la centrifugation pour les cellules à pellets et jetez le surnageant.
7. Suspendre les cellules dans un milieu de croissance complet jusqu’à une concentration de 2 millions de cellules vivantes/mL. Préparez suffisamment de cellules pour 100K cellules/puits d’une plaque à 6 puits.

2. Préparation et administration des traitements médicamenteux.

REMARQUE : La pyrimétamine est obtenue sous forme de poudre lyophilisée et est reconstituée en interne dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 100 mM ; les aliquotes sont stockées à −80 °C. Le Venetoclax est acheté prédissous dans du DMSO à une concentration de 10 mM et est stocké à -20 °C. Pour cette expérience, le vénétoclax et la pyrimétamine sont administrés en dose unique par absorption libre en parallèle d’une condition de traitement DMSO contrôlée par véhicule.
ATTENTION : La pyriméthamine, le vénétoclax et le DMSO sont des agents bio-dangereux. Manipulez uniquement sous la capuche, portez des équipements de protection individuelle (EPI), et utilisez avec une prudence supplémentaire.

1. Le jour du dressage, décongelez le médicament Aliquot sur de la glace, un vortex, puis tournez à vitesse maximale sur une mini-centrifugeuse de table pendant 30 secondes.
2. Vortex et mélangez vigoureusement une bouteille de média semi-solide jusqu’à homogénéiser tous les composants. Laissez la capot à température ambiante pendant 30 minutes pour laisser les bulles remonter à la surface.
3. Préparez 3 mL d’aliquotes de milieux semi-solides dans des tubes coniques stériles de 15 mL. Laissez les tubes rester intacts pendant 30 minutes afin que les bulles montent à la surface. Les aliquotes de milieux semi-solides supplémentaires peuvent être recongelées et stockées à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
4. Ajoutez au maximum 10 μL de volume de médicament au milieu semi-solide. Pour cette expérience, les concentrations de vénétoclax et de pyrimétamine sont ajustées selon des conditions synergiques déterminées empiriquement. À un groupe de contrôle de véhicule, ajoutez des volumes équivalents de DMSO. Préparez des aliquotes de 3 mL en double pour chaque condition.
   REMARQUE : Il est important de garder le volume de médicament ajouté négligeable afin qu’il n’affecte pas la concentration finale du médicament dans le milieu semi-solide.
5. Des médias vortex en 4 à 5 courtes rafales pour intégrer pleinement le médicament dans le support.
   REMARQUE : Ne gardez pas le mélange cellulaire sur le vortex pendant de longues périodes, car cela pourrait entraîner la mort cellulaire.
6. Ajoutez 100 μL de cellules ou un volume équivalent de 200 000 cellules aux 3 mL aliquotes de milieux semi-solides. Mélange vortex par courtes périodes jusqu’à ce qu’il soit complètement incorporé/homogénéisé.
7. Fixez une aiguille émoussée de 16 G sur une seringue de 3 mL et laissez tomber l’aiguille et la seringue dans le mélange cellulaire. Laissez les bules indisturbées pendant 30 minutes pour permettre aux bulles de remonter à la surface.

3. Placage de la suspension cellulaire traitée par médicament.

1. À l’aide d’une aiguille et d’une seringue immergées, prenez le mélange de cellules et de médicaments, en veillant à ne pas aspirer de bulles d’air. Attendez 3 à 5 minutes, puis prenez le mélange restant qui s’est accumulé sur les côtés du tube conique de 15 mL.
2. Dans une plaque stérile à 6 puits, ajoutez le mélange de cellules goutte dans la chute, en alternant de grandes gouttes entre deux puits d’une colonne extérieure de la plaque. Étalez le mélange en inclinant doucement la plaque en cercles pour couvrir uniformément tout le fond des puits. Ces deux puits constituent des répliques techniques.
   REMARQUE : Si des bulles se forment ou sont accidentellement ajoutées dans les puits, utilisez une embout filtre à pipette pour déceler doucement ou déplacer les bulles vers le bord de la plaque. Toute grosse bulle restante dans la plaque peut affecter la croissance des colonies.
3. Ajoutez le mélange de test de colonie uniquement aux colonnes extérieures de la plaque à 6 puits. Sur la colonne centrale, ajoutez 5 mL d’eau stérile à chaque puits. Ajouter de l’eau aux puits garantit qu’il y a suffisamment d’humidité pour empêcher le milieu semi-solide de sécher.
4. Incubez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂. Surveillez la croissance cellulaire et le niveau d’eau deux fois par semaine. Les cellules devraient former des colonies visibles à l’œil simple environ 7 jours après le plaquetage, et les plaques devraient atteindre une confluence de 75 % à 80 % entre 14 et 21 jours après le plaquetage.

4. Imagerie et comptage des colonies

REMARQUE : Ce protocole décrit des paramètres validés pour une utilisation sur le système d’imagerie EVOS M7000. Ces réglages peuvent devoir être optimisés ou adaptés pour être compatibles avec d’autres systèmes d’imagerie de plaques.

1. Retirez le couvercle du filtre de protection de la plateforme du microscope. Allumez le microscope et ouvrez le logiciel associé.
2. Insérez un diffuseur de lumière dans la lentille supérieure de l’appareil de microscope.
3. Insérez la position de la plaque sur la plateforme de sorte que le puits A1 soit dans le coin supérieur gauche.
4. Dans le logiciel d’imagerie, saisissez les réglages de mise au point suivants :
   1. Sélectionnez le vaisseau à imager. Dans ce protocole, une plaque à 6 puits est utilisée.
   2. Fixe l’objectif à 4X.
   3. Sélectionnez la source lumineuse en mode Trans ou passez le microscope en mode champ lumineux.
   4. Allumez la lumière du microscope et ajustez manuellement l’intensité de la lumière à l’aide du curseur grossier. Pour l’instrument utilisé dans ce protocole, la plage optimale pour imager les colonies est d’environ 0,03.
   5. S’il y a une fonction d’autofocus sur l’instrument, utilisez-la pour ajuster la mise au point. Si besoin, ajustez davantage la mise au point en utilisant les réglages manuels de mise au point fine.
5. Saisissez les paramètres automatisés de capture d’image suivants :
   1. Sélectionnez toute la zone du puits à imaginer dans chaque puits.
   2. Sélectionnez la capture automatisée de l’image pour commencer au centre du puits et spiraler vers les bords du puits.
   3. Sélectionnez les réglages d’autofocus pour que l’instrument se refocalisse dans chaque puits.
   4. Sélectionnez que les images brutes de chaque puits soient en tuiles ou fusionnées ensemble.
   5. Sélectionnez que les images soient inversées horizontalement et verticalement.
   6. Sélectionnez les paramètres d’enregistrement des données pour collecter « image en tuiles » et « image fusionnée »
   7. Lance le scan automatisé des plaques. L’instrument utilisé dans ce protocole fonctionnera à une vitesse de 1,5 min/puits.
   8. Retirez la plaque, placez le couvercle de protection du filtre sur la plateforme du microscope, éteignez le microscope et fermez le logiciel.
   9. Après l’imagerie, comptez manuellement les colonies individuelles totales ainsi que les sous-types myéloïdes et érythroïdes dans chaque puits à l’aide des images de puits fusionnés en pavillons.
6. Définissez les colonies selon la caractérisation morphologique suivante :
   1. Considérons une colonie individuelle ou un groupe de colonies distinct lorsqu’il est suffisamment éloigné d’une autre population cellulaire, à une distance égale à sa propre longueur. Les populations situées dans cette limite de distance sont regroupées en un seul décompte de colonie.
   2. Assurez-vous que les colonies érythroïdes sont profondément pigmentées et paraissent de couleur rouge foncé. Ces colonies apparaissent sous forme de populations ou de grappes uniques en croissance dense avec des bords clairement définis. Les colonies érythroïdes plus petites composées de populations cellulaires immatures à croissance lente sont classées comme CFU-E. Les colonies plus grandes avec des populations plus matures sont classées comme BFU-E.
   3. Vérifiez que les colonies myéloïdes contiennent des cellules plus translucides et de couleur plus claire. Les colonies myéloïdes sont plus dispersées et ne présentent pas de bords clairement définis. Les colonies myéloïdes ont tendance à croître plus fréquemment sous forme de populations individuelles que de grappes, bien que parfois des groupes puissent être observés. Dans les deux cas, les colonies myéloïdes sont classées comme CFU-GM.
   4. Classez les colonies mixtes contenant à la fois des sous-types érythroïdes et myéloïdes comme CFU-GEMM.

5. Récolte et congélation cellulaires pour analyse en aval via cytométrie en flux

1. Effectuez les étapes ci-dessous avant de commencer :
   1. a. Préparez et réchauffez un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (tampon FACS, composé de DPBS/4 % FBS) et un milieu de congélation (FBS/10 % DMSO) dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 30 minutes.
2. Ajoutez 5 mL de tampon FACS chauffé à la surface de chaque puits. Incubez les plaques pendant au moins 30 minutes dans un incubateur à 37 °C pour dissoudre le milieu semi-solide.
3. Resuspendez soigneusement les cellules à l’aide d’une pipette de 5 mL et transférez dans un tube conique stérile de 50 mL.
4. En utilisant 5 mL de tampon FACS chauffé, lavez chaque puits 3 fois et transférez tout le volume dans le tube conique de 50 mL.
5. Resuspendez bien les cellules en vortexant par 4 à 5 courtes impulsions, puis centrifugez à 400 x g pendant 10 minutes en RT vers les cellules de pellets. Si la pellete n’est pas visible après centrifugation, les cellules restent en suspension dans un milieu semi-solide. Sans aspirer, ajoutez 10 à 15 mL DPBS supplémentaires au tube pour diluer davantage le milieu semi-solide et bien le resuspendre. Si nécessaire, incubez à 37 °C pendant 10 à 15 minutes pour dissoudre complètement le milieu, puis réutilisez les cellules en granule.
6. Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans un tampon FACS de 10 mL. Centrifugez à 400 x g pendant 10 minutes en RT vers les cellules à pellets.
7. Resuspendre les cellules dans un milieu de congélation et aliquoter 3 millions de cellules/cryovial. Congelez les fioles dans un récipient à taux contrôlé à -80 °C pendant 24 heures pour atteindre un taux de refroidissement de 1 °C / min.
8. Transférez les cryovials dans le stockage d’azote liquide dès que possible.
   REMARQUE : Les échantillons conservés à -20 °C pendant de longues périodes auront une viabilité réduite. Il est important de transférer les cellules vers de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Résultats

La figure 1 illustre le pipeline de test de colonie, depuis l’isolement des échantillons patients jusqu’à l’analyse du nombre et de la morphologie des colonies. La figure 2 montre les réglages clés pour imager les colonies sur un microscope en champ clair. Les figures 3 et 4 montrent des images représentatives de la formation de colonies à parti...

Discussion

Le protocole décrit ici décrit un flux de travail optimisé pour réaliser des tests d’UFC utilisant des échantillons primaires de moelle osseuse et de sang périphérique des patients, avec une attention particulière au maintien de la viabilité cellulaire et à la croissance reproductible des colonies. Plusieurs étapes du protocole sont cruciales pour obtenir une formation fiable de colonies lors du travail avec des échantillons dérivés des patients. Le dégel rapide des cellules mononucléair...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	pour le distribution et l'ensemencement des milieux MethoCult
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	compteur de cellules
Chambres de comptage CHT4 (lamelles de compteur de cellules)	Revvity	CHT4-SD100-002	lamelles pour compteur de cellules
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	utilisé pour la reconstitution des médicaments et le milieu de congélation cellulaire
Tampon phosphate de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	pour la culture cellulaire
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	pour la stérilisation des surfaces de culture cellulaire
Système d'imagerie EVOS M7000	ThermoFisher Scientific	AMF7000	pour l'imagerie des colonies et des plaques
Sérum bovin fœtal	BenchMark	100-106	complément de milieu pour la culture cellulaire et la congélation
Milieu de culture IMDM modifié	Cytiva	SH30228.01	milieu de culture enrichi, adapté pour le traitement des échantillons de patients
Seringues à embout LuerLok de 3 mL	BD	309657	pour le distribution et l'ensemencement des milieux MethoCult
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	milieu semi-solide à base de méthylcellulose pour l'analyse des colonies
Plaques multipuits à 6 puits	FALCON	353046	pour l'ensemencement des analyses des colonies
Microscope à contraste de phase à fluorescence trinoculaire inversé Nikon Eclipse TS2FL	Coastal Microscopes	51623	Pour l'imagerie et la caractérisation de la morphologie des colonies
Pen Strep	Gibco	15140-122	complément antibiotique pour la culture cellulaire
pyriméthamine	Sigma-Aldrich	46706	antifol approuvé par la FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	pour l'ensemencement des analyses des colonies
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	chimiothérapie approuvée par la FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	coloration de viabilité pour le comptage des cellules vivantes