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Article de méthode

Génération de cellules souches pluripotentes induites humaines anéuploïdes à partir de cellules primaires de liquide amniotique via électroporation par plasmide épisomal

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DOI :

10.3791/71975

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3 septembre 2026

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1State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une méthode reproductible pour générer des iPSC humaines aneuploïdes sans intégration à partir de cellules primaires de liquide amniotique en utilisant l'électroporation par plasmide épisomal. Il optimise les conditions de livraison et de culture afin de stabiliser les anomalies chromosomiques, offrant ainsi une plateforme pratique pour créer des modèles spécifiques à des maladies destinés à des recherches ultérieures et à des applications cliniques.

Résumé

La génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques à chaque patient à partir de cellules du liquide amniotique (AFC) portant des aneuploïdies chromosomiques définies constitue une plateforme puissante pour modéliser les troubles génétiques. Toutefois, la mise en place d'un protocole de reprogrammation fiable et reproductible pour les AFC aneuploïdes reste techniquement difficile en raison de l'instabilité génomique intrinsèque et de la capacité proliférative variable de ces cellules. Nous présentons ici une méthode complète et non intégrative de génération de iPSC humaines aneuploïdes à partir de AFC primaires, utilisant l'électroporation de plasmides épisomaux. Ce protocole décrit l'ensemble du flux opératoire, incluant le décongélation et l'expansion cellulaire selon une stratégie d'adaptation progressive du milieu, ainsi que la livraison optimisée des plasmides via système d'électroporation, culture post-électroporation séquentielle avec des changements de milieu orientés vers une transition mésenchymateuse-épithéliale (MET), et sélection mécanique des colonies selon des critères morphologiques définis. Nous décrivons en outre des procédures de validation, incluant une coloration immunofluorescente pour les marqueurs fondamentaux de pluripotence, une analyse cytogénétique en bandes G afin de confirmer le maintien d'un caryotype aneuploïde, et une vérification par PCR de l'élimination des vecteurs épisomaux. Ce protocole sans cellules nourricières et sans intégration génique permet d'obtenir des lignées de cellules souches pluripotentes induites aneuploïdes, adaptées à la modélisation de maladies, au criblage de médicaments et aux études de biologie chromosomique.

Introduction

L'avènement de la technologie des cellules souches pluripotentes induites a transformé la médecine régénérative, la modélisation des maladies et la découverte de médicaments en permettant la génération de cellules pluripotentes spécifiques à chaque patient, sans les préoccupations éthiques associées aux cellules souches embryonnaires humaines (hESC). La base conceptuelle du reprogrammation cellulaire provient de la démonstration par Gurdon du transfert nucléaire de cellules somatiques1, suivie de l'établissement des cellules souches embryonnaires2,3,4 et, enfin, du développement de la pluripotence induite5  par expression ectopique de OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Depuis lors, la technologie des iPSC est devenue une plateforme indispensable pour l'étude du développement humain, des troubles génétiques et de la médecine de précision. Les premières méthodes de reprogrammation utilisaient des vecteurs rétroviraux ou lenti-viraux, mais les risques liés à leur intégration ont limité leur application clinique. Par conséquent, le développement de méthodes de reprogrammation sans intégration est devenu une priorité pour la traduction clinique. Ces méthodes incluent l'utilisation du virus de Sendai6, d'ARNm synthétique7, de vecteurs épisomaux basés sur le mécanisme oriP/EBNA1 (antigène nucléaire d'Epstein-Barr-1)8 et du reprogrammation chimique9,10,11,12 utilisant uniquement des composés de faible masse moléculaire.

L'aneuploïdie est la cause principale de fausses couches et de malformations congénitales chez l'humain. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine des anomalies du développement liées à l'aneuploïdie nécessite des modèles cellulaires appropriés capables de reproduire fidèlement le fonds génétique de ces affections. Les cellules du liquide amniotique (AFC) constituent un matériau de départ intéressant et efficace pour la génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques à chaque patient13,14,15, en particulier dans le contexte des troubles génétiques diagnostiqués prénatalement16,17. Le liquide amniotique résiduel obtenu lors d'une amniocentèse de routine permet d'accéder à des cellules d'origine fœtale sans nécessiter de biopsie tissulaire invasive supplémentaire après la naissance. Par rapport aux cellules somatiques adultes, les AFC présentent généralement une capacité proliférative plus élevée, des télomères plus longs, une charge mutagène environnementale cumulative plus faible et une plus grande plasticité développementale, caractéristiques qui facilitent toutes la reprogrammation cellulaire18,19. De manière importante, les AFC conservent fidèlement la constitution chromosomique du fœtus en développement, ce qui en fait une source idéale pour établir des modèles de cellules iPSC spécifiques aux maladies présentant des anomalies chromosomiques, notamment la trisomie 2120, la trisomie 1821, le syndrome de Turner et le syndrome de Klinefelter22.

Ce protocole fournit un guide complet pour la génération de CIP sans intégration à partir de cellules de liquide amniotique aneuploïdes en utilisant des vecteurs épisomaux. La méthode comprend des procédures détaillées pour l'isolement des cellules, la reprogrammation, la sélection des clones et la caractérisation. Par rapport à d'autres méthodes de reprogrammation sans intégration, le système de plasmides épisomaux offre un équilibre pratique entre sécurité génomique, simplicité technique et rentabilité, ce qui le rend particulièrement adapté à une utilisation courante en laboratoire et à des applications de biobanque à grande échelle. Le protocole s'applique aussi bien aux CFA cryopréservées provenant de biobanques établies qu'aux échantillons frais de liquide amniotique résiduel obtenus lors d'un diagnostic prénatal de routine. Bien que les rendements de reprogrammation épisomale rapportés pour les CFA soient relativement faibles, et qu'une correction spontanée des chromosomes puisse survenir durant la reprogrammation ou une culture prolongée, notamment dans certains cas d'aneuploïdie, le flux de travail est facilement applicable à la création de biobanques de CIP spécifiques à une maladie, à l'étude de la biologie chromosomique et du développement humain précoce, ainsi qu'à la différenciation ultérieure en types cellulaires spécifiques à une lignée. Cette approche est particulièrement bien adaptée à la génération de lignées de CIP sans intégration et pertinentes sur le plan clinique à partir d'échantillons prénatals, pour la modélisation des maladies et les études mécanistiques des anomalies chromosomiques.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons de liquide amniotique humain ont été réalisées conformément à la Déclaration d'Helsinki et ont été approuvées par le comité d'éthique institutionnel (Comité d'éthique pour la recherche sur l'être humain) de l'Hôpital universitaire Peking University Third (protocole n° M2023406). Les échantillons aneuploïdes proviennent de la biobanque du Centre de médecine reproductive de l'Hôpital universitaire Peking University Third, un dépôt clinique certifié par l'État spécialisé dans les ressources humaines en développement et en reproduction. Ces spécimens consistent en du liquide amniotique résiduel initialement collecté lors d'une amniocentèse de routine à des fins de diagnostic prénatal clinique, qui aurait autrement été éliminé. Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de tous les donneurs avant le prélèvement, autorisant explicitement le stockage des échantillons résiduels dans la biobanque ainsi que leur utilisation ultérieure à des fins de recherche. Tous les échantillons ont été strictement anonymisés afin de protéger la confidentialité des patients. Des échantillons présentant des caryotypes aneuploïdes confirmés par analyse clinique de bandes G, incluant la trisomie 21 (syndrome de Down, N = 2), la trisomie 18 (syndrome d'Edwards, N = 1), la monosomie X (syndrome de Turner, N = 1) et le syndrome de Klinefelter (N = 2), ont été sélectionnés pour l'induction de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les informations détaillées concernant les lignées cellulaires aneuploïdes utilisées pour la reprogrammation sont résumées dans Tableau 1.

1. Décongélation et culture primaire de cellules de liquide amniotique issues d'une biobanque

REMARQUE : Cette section décrit la procédure normalisée pour la récupération et la mise en culture de CFA anéuploïdes à partir de la biobanque. Les cellules cultivées sont amplifiées afin d'obtenir des populations suffisantes pour la reprogrammation épisomale ultérieure.

  1. Procédure normalisée de décongélation
    1. Équilibrage du milieu : Réchauffer le milieu complet AmnioType-1 à 37 °C avant utilisation.
    2. Récupération de l'échantillon : Prélever un cryotube contenant environ 300 000 CAF cryoconservées dans un milieu de congélation cellulaire depuis le stockage en azote liquide. Transférer immédiatement le tube au laboratoire sur de la glace sèche afin d'éviter une décongélation prématurée.
    3. Décongélation rapide : Plonger la moitié inférieure du cryotube dans un bain-marie à 37 °C et agiter doucement. Interrompre la décongélation lorsque seul un petit cristal de glace visible subsiste.
      ​REMARQUE : Éviter une décongélation complète. Cela empêche les cellules d'être exposées aux effets toxiques du DMSO chaud.
    4. Dilution : Dans une hotte à flux laminaire, transférer la suspension cellulaire goutte à goutte dans un tube conique de 15 mL contenant 4 mL de milieu AmnioType-1 préchauffé.
    5. Centrifugation : Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 5 min à température ambiante.
    6. Ensemencement : Aspirer le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire dans 2 mL de milieu frais AmnioType-1. Transférer les cellules dans une plaque 6 puits ou un flacon T25 pré-enrobé de gélatine à 0,1 %, à une densité de 30 000 à 50 000 cellules/cm².
    7. Incubation initiale : Placer les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % CO2. Examiner les flacons au microscope inversé à contraste de phase au jour 3 après l'ensemencement afin de confirmer l'attachement initial des cellules.
  2. Expansion et transition du milieu des CAF primaires
    1. Préparation du milieu de culture de fibroblastes (FC) : Pour préparer 100 mL de milieu de culture de fibroblastes maison, mélanger 82 mL de DMEM à haute teneur en glucose avec 15 mL de sérum bovin fœtal (FBS). Ajouter 1 mL de GlutaMAX 100×, 1 mL d'acides aminés non essentiels (NEAA) 100× et 1 mL de pénicilline-streptomycine (P/S). Filtrer le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 µm dans un environnement stérile.
    2. Pendant l'expansion, changer progressivement le milieu des CAF tous les 3 jours, en passant du milieu clinique spécialisé (AmnioType-1) à un système de culture de fibroblastes standardisé (milieu FC, maison), afin d’assurer une stabilité métabolique avant l’électroporation.
      1. Effectuer une transition progressive du milieu :
        1. Jour 3 (75 % AmnioType-1 : 25 % FC) : Aspirer le milieu AmnioType-1 existant. Ajouter un milieu mixte composé de 75 % de milieu AmnioType-1 et de 25 % de milieu FC.
        2. Jour 6 (50 % AmnioType-1 : 50 % FC) : Aspirer et remplacer par un mélange à ratio 1:1 de milieu AmnioType-1 et de milieu FC.
        3. Jour 9 (25 % AmnioType-1 : 75 % FC) : Aspirer et remplacer par un mélange composé de 25 % de milieu AmnioType-1 et de 75 % de milieu FC.
        4. Jour 12 (100 % FC) : Aspirer et passer au milieu FC à 100 %.
          REMARQUE : Cette adaptation progressive réduit le choc cellulaire et empêche le détachement de clones aneuploïdes sensibles.
    3. Observer quotidiennement la morphologie des colonies. Le liquide amniotique contient une population hétérogène de cellules. En microscopie à contraste de phase, identifier les deux types principaux : type F (aspect fibroblastique, forme fusiforme) et type E (aspect épithélial, forme arrondie). La sous-population mésenchymateuse de type fibroblastique est optimale pour la reprogrammation.
      ​REMARQUE : Surveiller attentivement les signes de sénescence cellulaire.
  3. Passage des CAF primaires
    1. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (généralement jour 10 à 14), aspirer le milieu du flacon et rincer une fois délicatement avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans Ca²⁺/Mg²⁺.
    2. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA 0,25 % pour une seule cavité d'une plaque 6 puits afin de recouvrir la monocouche cellulaire.
    3. Incuber à 37 °C pendant 4 à 5 min jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement.
    4. Neutraliser le réactif de dissociation en ajoutant 3 mL de milieu FC. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 mL.
    5. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante.
    6. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu FC frais. Compter les cellules viables à l’aide d’un hématimètre ou d’un compteur cellulaire automatisé avec exclusion au bleu de trypan.
    7. Ensemencer les cellules dans un nouveau flacon T25 à une densité de 30 000 à 50 000 cellules/cm² dans du milieu complet (généralement selon un ratio de 1:2 ou 1:3).
    8. Étendre les cellules jusqu’au passage 3 à 5 avant de les utiliser pour la reprogrammation. Ne pas utiliser les cellules au-delà du passage 6.
      NOTE : La qualité cellulaire au moment de l’électroporation est le facteur le plus important pour le succès de la reprogrammation. Utiliser uniquement des CAF de type F en phase logarithmique de croissance, en bonne santé, sans signe de sénescence ni de morphologie anormale.

2. Électroporation de plasmides épisomaux dans les CAF à l'aide d'un système d'électroporation cellulaire

  1. Recouvrir les récipients de culture avec une matrice de membrane basale
    1. Dégeler la matrice de membrane basale (Matrigel) toute la nuit à 4 °C sur de la glace.
    2. Refroidir le DPBS stérile ou le DMEM/F-12 sur de la glace. Prérefroidir les embouts de pipette et les tubes sur de la glace pendant 30 min.
    3. Diluer la matrice de la membrane basale au 1:200 dans du DMEM/F-12 glacé en utilisant des pointes et des tubes froids (par exemple, 30 µL matrice + 6 mL de DMEM/F-12 pour une plaque de 6 puits
    4. Mélanger soigneusement mais délicatement en aspirant et en expulsant la solution 5 à 6 fois à l’aide d’une pipette. Éviter d’introduire des bulles d’air.
    5. Ajouter la solution de revêtement diluée dans les récipients de culture à raison de 1 mL par puits pour une plaque de 6 puits.
    6. Incuber les récipients revêtus à 37 °C pendant au moins 1 h, ou à température ambiante pendant 2 h.
    7. Aspirez la solution d'ensemencement immédiatement avant la mise en place des cellules. Ajoutez 2 mL de milieu FC sans antibiotique plus 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK) et remettre la plaque dans un 37 °C incubateur. Ne laissez pas la surface revêtue sécher.
      ​REMARQUE : les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 °C scellé avec du parafilm pendant jusqu'à 7 jours. Équilibrer à température ambiante avant utilisation.
  2. Décongeler et préparer les plasmides d'épissage pour la reprogrammation
    1. Sélection des plasmides : Utilisez les plasmides épisomaux suivants pour la reprogrammation : pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL et pCXLE-EBNA1.
      REMARQUE : (Facultatif) Pour l'optimisation des conditions d'électroporation, pCE-GFP peut être électroporé en parallèle dans des conditions identiques. L'expression de la GFP au cours des premières 48 à 72 heures fournit un indicateur pratique de l'efficacité de la transfection, tandis que la perte progressive du signal GFP lors des passages suivants peut être utilisée pour surveiller la dilution transitoire du plasmide.
    2. Contrôle de qualité (QC) : Vérifier la concentration et la pureté de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre. S'assurer que le rapport A260/A280 est compris entre 1,8 et 1,9. S'assurer que la concentration de chaque plasmide est supérieure à 1 µg/µL et stérile.
      ​REMARQUE : Il est essentiel de s'assurer que tous les plasmides sont préparés selon des méthodes sans endotoxines. Les endotoxines résiduelles peuvent entraîner une cytotoxicité élevée et une efficacité de reprogrammation nettement réduite. Conserver les plasmides en petites aliquotes à -20 °C afin d'éviter des cycles répétés de congélation-décongélation.
    3. Pour un 100 µL réaction, préparer 5 µg du mélange de plasmides (rapport équimolaire de pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL et pCXLE-EBNA1.
  3. Configurer les paramètres d'électroporation.
    1. Initialiser l'appareil d'électroporation. Régler les paramètres d'impulsion selon la configuration optimisée pour les cellules adhérentes primaires : tension d'impulsion : 1 200 V ; durée de l'impulsion : 20 ms ; nombre d'impulsions : 2.
    2. Remplir la station de pipette avec 2 mL de tampon E, en veillant à ce que l'électrode soit entièrement immergée.
      ​REMARQUE : Si les expériences initiales donnent une viabilité cellulaire inférieure à 50 %, envisagez de tester d'autres paramètres : 950 V / 20 ms / 2 impulsions (plus doux). Ces alternatives sacrifient une partie de l'efficacité au profit d'une meilleure survie.
  4. Préparer les AFC pour l'électroporation
    1. Au jour 0, vérifier au microscope que les cellules présentent une morphologie saine en forme de fuseau, sans signe de surconfluence, de sénescence ou de contamination. S'assurer que les cellules ont atteint une confluence de 90 % et qu'elles se trouvent en phase exponentielle de croissance active.
    2. Juste avant la procédure d'électroporation, aspirez le revêtement de Matrigel et remplacez-le par 2 mL de milieu préchauffé sans antibiotique Milieu FC supplémenté 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK). Préchauffer ce milieu FC sans antibiotique à 37 °C dans un incubateur pendant au moins 20 min avant la récolte des cellules pour le système d'électroporation.
      REMARQUE : Ne pas ajouter de pénicilline-streptomycine (P/S) ni tout autre antibiotique à ce lot spécifique de milieu. Après l'électroporation, la membrane cellulaire reste temporairement perméable et vulnérable. La présence d'antibiotiques peut entraîner une augmentation de l'apoptose.
    3. Aspirez le milieu des AFC destinées à l'électroporation et lavez la monocouche une fois avec du DPBS sans Ca²⁺/Mg²⁺.
    4. Ajouter 2 mL (pour flacon T25) d'enzyme TrypLE Select et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 min.
    5. Neutraliser avec 6 mL de milieu complet FC et transférer dans un tube conique de 15 mL. Compter les cellules à l'aide d'un compteur automatique de cellules.
    6. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante.
    7. Retirer complètement le surnageant à l'aide d'un 200 μL embout de pipette, en prenant soin de ne pas perturber le petit culot cellulaire.
    8. Resuspendre le culot cellulaire dans le tampon R à une densité finale de 1,0 × 10⁷ à 1,4 × 10⁷ cellules/mL
      ​REMARQUE : Aspirez le surnageant aussi complètement que possible afin de garantir que le culot cellulaire soit sec. Le milieu de culture résiduel peut diluer le tampon de resuspension, ce qui pourrait réduire l'efficacité de l'électroporation. Utilisez le tampon R (pour les cellules adhérentes) pour les cellules adhérentes. Vérifiez le choix du tampon conformément aux recommandations du fabricant.
  5. Effectuer l'électroporation.
    1. Aliquoter 110 μL de la suspension cellulaire (contenant 1,0–1,4) × 106 cellules) dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
      REMARQUE : Ajouter un supplément 10 μL du tampon R au volume final afin de garantir une suspension cellulaire suffisante, ce qui permet d'éviter l'introduction de bulles d'air lors de l'aspiration.
    2. Ajouter 5 μg mélange de plasmides au 110 μL Aliquoter la cellule. Mélanger en pipetant doucement 3 fois.
    3. Attacher un stérile 100 μL bout d'électroporation à la pipette. Veillez à ce que le bout s'encliquète fermement.
    4. Charger 100 μL de la suspension cellulaire/ADN, en veillant à l'absence de bulles d'air visibles.
      REMARQUE : Les bulles d'air provoquent des arcs électriques pendant l'impulsion électrique, ce qui tue les cellules et endommage la pointe. Si des bulles sont visibles, expulsez une nouvelle fois le mélange dans le tube et répétez l'aspiration lentement.
    5. Insérez verticalement la pipette chargée dans le tube tampon situé sur la station jusqu'à ce qu'elle s'encliquète. Vérifiez que tous les paramètres sont corrects sur l'écran tactile, puis appuyez sur le bouton Démarrer pour délivrer la séquence d'impulsions.
    6. Attendre que l'écran affiche "Complet" (typiquement en 1 à 2 s). Retirer immédiatement la pipette de la station et dispenser directement la suspension de cellules électroporées dans 2 à 3 puits d'une plaque de 6 puits revêtue contenant du milieu FC sans antibiotique préchauffé + 10 μM Y-27632
    7. Jeter la pointe usagée en toute sécurité. Répéter les étapes pour les autres puits ou répliques selon les besoins. Placer la plaque 6-puits dans un 37 °C, 5 % CO₂₂ incubateur humidifié pendant la nuit.

3. Culture de reprogrammation post-électroporation

REMARQUE : Cette section décrit les changements séquentiels de milieu et la réalisation d'une reprogrammation complète des AFC en iPSC. La chronologie s'étend sur environ 25 jours, de l'électroporation au prélèvement des colonies.

  1. Environ 16 à 18 heures après l'électroporation, aspirez soigneusement le milieu sans déloger les cellules adhérentes survivantes. Ajoutez délicatement 2 mL de milieu FC préchauffé (contenant P/S) dans chaque puits afin de permettre aux cellules de se stabiliser durant les 24 premières heures. Replacez la plaque dans l'incubateur.
  2. Des jours 2 à 6, remplacez la moitié du milieu tous les deux jours : aspirez soigneusement 1 mL de milieu usagé et ajoutez 1 mL de milieu frais TeSR-E8 (E8).
    NOTE : Le changement partiel de milieu préserve les facteurs autocrines sécrétés qui soutiennent les premiers événements de reprogrammation. Aspirez lentement depuis le bord du puits afin de minimiser la perturbation des cellules en transition faiblement attachées.
  3. Aux jours 7, effectuez un remplacement complet du milieu avec 2 mL de milieu E8 tous les deux jours.
  4. Observez quotidiennement les changements morphologiques au microscope. Des agrégats partiellement reprogrammés, de type pavimenteux, devraient apparaître vers les jours 10 à 14.
    NOTE : (Facultatif) Supplémentez les cultures avec 25 à 100 μM de butyrate de sodium entre les jours 9 et 15 si la formation de colonies est insuffisante23.
  5. Remplacez le milieu E8 quotidiennement à partir du jour 15.
  6. À partir d’environ le jour 18, inspectez quotidiennement les puits à la recherche de l’apparition de colonies d’iPS authentiques. Une chronologie complète du protocole de reprogrammation, du jour 0 (électroporation) jusqu’à la sélection des colonies, est fournie dans Tableau 2.

4. Prélèvement mécanique des colonies de CIP et expansion des lignées de CIP établies

REMARQUE : Distinguer les véritables colonies de CIP des cellules reprogrammées ou non reprogrammées selon les critères morphologiques suivants. Identifier les colonies « idéales » à partir des caractéristiques morphologiques ci-dessous : (1) Délimitation du bord : rechercher un contour net, lisse et circulaire qui sépare clairement la colonie des cellules du liquide amniotique environnantes ; (2) Densité cellulaire : les cellules au sein de la colonie doivent être petites, étroitement compactées et présenter un rapport nucléo-cytoplasmique élevé avec des nucléoles apparents ; (3) Réfringence : les colonies de haute qualité apparaissent brillantes et fortement réfringentes en contraste de phase ; (4) Platitude : la colonie doit se développer sous forme d'une couche plane et bidimensionnelle, plutôt que d'un « agrégat » tridimensionnel. Les colonies partiellement reprogrammées apparaissent souvent plus tôt que les véritables colonies de CIP et ont tendance à être plus grandes, plus épaisses et plus tridimensionnelles. Elles subiront une différenciation spontanée lors du prélèvement et du passage. Ne pas prélever les colonies présentant des « vacuoles », des bords irréguliers ou des signes de différenciation centrale.

  1. Prélèvement et transfert mécanique de colonies de CIP
    1. Préparer une plaque 24 puits revêtue de Matrigel avec 0,5 mL par puits de milieu E8 supplémenté en 10 μM de Y-27632. Conserver à 37 °C jusqu'à utilisation.
    2. Placer la plaque de culture sous un stéréomicroscope à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique de classe II. Stériliser l'objectif et le plateau du stéréomicroscope avec de l'éthanol à 70 % avant d'approcher la plaque du champ de vision.
    3. Identifier les colonies présentant une morphologie correcte (plates, compactes, aux bords nets).
    4. À l’aide d’une pipette stérile de 10 μL munie d’une pointe tenue selon un angle faible (environ 30° par rapport à l’horizontale), tracer délicatement autour du périmètre d’une colonie sélectionnée afin d’en délimiter les contours. Découper la colonie en environ 3 fragments en effectuant des incisions parallèles à travers son diamètre. Utiliser la même pointe de pipette pour gratter doucement et soulever les fragments de la colonie du substrat, puis transférer les fragments dans un puits de la plaque 24 puits préparée.
    5. Répéter ces étapes pour chaque colonie, en plaçant les fragments dans des puits distincts.
    6. Placer la plaque 24 puits dans l’incubateur. Ne pas la perturber pendant 24 h afin de permettre l’attachement des fragments.
    7. À partir du jour 2 après le prélèvement, renouveler le milieu quotidiennement avec du milieu E8 non supplémenté en Y-27632.
    8. Lorsque les colonies prélevées atteignent une confluence de 70 à 80 % (généralement en 3 à 6 jours), les repiquer à l’aide d’Accutase.
  2. Repiquage et expansion de lignées de CIP établies
    1. Aspirer le milieu du puits contenant les CIP. Ajouter de l’Accutase pour recouvrir la monocouche. Incuber à température ambiante pendant 2 à 6 min. Observer les bords des colonies au microscope ; les cellules doivent commencer à se séparer et des espaces doivent apparaître entre elles.
    2. Aspirer complètement la solution d’Accutase. Ajouter 1 mL de milieu E8 + 10 μM de Y-27632. Pipeter doucement le milieu sur la surface des colonies 5 à 8 fois à l’aide d’une pipette P1000 afin de dissocier les colonies en petits agrégats de 2 à 8 cellules.
      NOTE : Éviter une dissociation excessive des CIP, ce qui réduit fortement leur viabilité. L’objectif est d’obtenir des agrégats uniformes de petite taille, et non une suspension monocellulaire.
    3. Transférer les agrégats avec 1 mL de milieu E8 + 10 μM de Y-27632 de manière homogène dans une plaque 12 puits fraîchement revêtue de Matrigel. Placer la plaque dans l’incubateur.
    4. Renouveler le milieu quotidiennement avec du milieu E8 (sans Y-27632 à partir du jour 1).
    5. Poursuivre les repiquages tous les 3 à 4 jours selon un ratio de division de 1:2 à 1:5, en fonction de la confluence.
    6. Cultiver les lignées de CIP pendant au moins 10 passages avant toute application en aval afin de garantir une élimination stable des épisomes.

5. Caractérisation des lignées de CIP aneuploïdes

REMARQUE : Effectuer les essais de validation suivants sur des lignées de CIP établies (passage 10 ou ultérieur) afin de confirmer la pluripotence, l'intégrité du caryotype et l'élimination des vecteurs épisomaux.

  1. Confirmer l'expression des marqueurs de pluripotence.
    1. Valider l'expression des marqueurs fondamentaux de pluripotence par coloration immunofluorescente, cytométrie en flux, ou les deux méthodes. Les profils de marqueurs attendus sont résumés dans Tableau 3.
      NOTE : Bien que la coloration immunofluorescente permette une confirmation initiale de la pluripotence, la RT-qPCR et le RNA-séquençage sont recommandées pour une évaluation plus large de l'expression des gènes associés à la pluripotence, notamment LIN28A, DPPA4 et KLF4.
  2. Analyse du caryotype par banding G
    ​ÉTAPES CRITIQUES : La reprogrammation peut induire une correction de trisomie dans un sous-ensemble de clones. Analyser plusieurs clones (5 à 10 par lignée parentale) afin d'identifier à la fois les dérivés conservant une aneuploïdie et ceux ayant retrouvé une euploïdie.
    1. Récolter les iPSCs au passage 10 à 15, à une confluence de 70 % à 80 %.
    2. Ajouter 0,1 μg/mL de colcémide au milieu de culture. Incuber à 37 °C pendant 2 à 4 h pour arrêter les cellules en métaphase.
      NOTE : Le colcémide est un poison mitotique. Manipuler avec des gants dans une hotte de sécurité biologique. Éliminer les déchets contenant du colcémide comme matières dangereuses.
    3. Dissocier les cellules en suspension monocellulaire à l’aide d’Accutase ou d’un agent équivalent. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min.
    4. Resuspendre le culot dans 5 mL de solution hypotonique préchauffée (0,075 M de chlorure de potassium). Incuber à 37 °C pendant 15 à 20 min.
    5. Ajouter 1 mL de fixateur fraîchement préparé (méthanol : acide acétique, rapport volumétrique 3:1) au tube tout en mélangeant doucement. Centrifuger à 300 × g pendant 10 min.
    6. Aspirer le surnageant. Ajouter 5 mL de fixateur frais. Mélanger délicatement et incuber pendant 10 min. Centrifuger à nouveau.
    7. Répéter l’étape de fixation (étape 6) une fois supplémentaire, pour un total de 3 fixations.
    8. Après la dernière centrifugation, resuspendre le culot dans 0,5 à 1 mL de fixateur frais afin d’obtenir une densité cellulaire appropriée.
    9. Déposer 2 à 3 gouttes de la suspension cellulaire sur des lames en verre propres et humides, depuis une hauteur d’environ 30 cm. Laisser sécher à l’air.
    10. Faire cuire les lames à 80 °C pendant 2 h ou à 65 °C toute la nuit pour vieillir les chromosomes.
    11. Réaliser le banding G : traiter les lames avec une solution de trypsine à 0,025 % pendant 30 à 60 s, rincer, puis colorer avec une solution de Giemsa à 5 % pendant 1 à 5 min.
    12. Analyser au moins 20 métaphases bien étalées par clone au microscope à immersion en lumière ordinaire (objectif 100×).
    13. Documenter le caryotype en utilisant la nomenclature ISCN (par exemple, 47,XX,+21 pour une trisomie 21 féminine ; 45,X pour le syndrome de Turner).
      ​NOTE : Le caryotypage par banding G détecte les anomalies chromosomiques majeures mais présente une résolution limitée. Des tests complémentaires, tels que l’analyse des variations du nombre de copies (CNV), le séquençage de l’exome entier (WES) ou le séquençage du génome entier (WGS), sont recommandés pour identifier les modifications génétiques submicroscopiques et confirmer l’intégrité génomique des iPSCs.
  3. Vérifier l’élimination du vecteur épisomal par PCR.
    ​NOTE : Cette étape confirme que tous les plasmides épisomaux ont été perdus dans la lignée d’iPSCs par amplification PCR de séquences spécifiques au vecteur.
    1. Extraire l’ADN génomique des iPSCs (passage ≥ 10) et des AFCs non transfectés utilisés comme témoins à l’aide d’un kit d’extraction standard sur colonne.
    2. Préparer une réaction PCR de 25 μL. Réaliser la PCR à l’aide des couples d’amorces Orip/GAPDH selon les conditions de cyclage suivantes (94 °C pendant 2 min ; puis 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; extension finale à 72 °C pendant 5 min). Inclure un témoin positif (matrice plasmidique) et un témoin négatif (ADN génomique de cellules non transfectées) dans chaque réaction PCR.
    3. Séparer les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % en utilisant une échelle d’ADN appropriée.
    4. Interpréter les résultats : les lignées d’iPSCs ayant perdu les épisomes ne doivent présenter aucune bande d’amplification à 544 pb. Le témoin positif doit montrer des bandes de taille attendue. Le témoin négatif ne doit présenter aucune bande.
  4. Détection de mycoplasmes par PCR
    1. Prélever 0,5 à 1 mL de surnageant de culture après au moins 24 h d’incubation des cultures d’iPSCs, avant le changement de milieu, et centrifuger à 12 000 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires.
    2. Utiliser le surnageant clarifié comme matrice pour la PCR avec le Kit de détection de mycoplasmes par PCR, en suivant les instructions du fabricant.
    3. Séparer les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %. Ne poursuivre les expériences en aval que si les cultures d’iPSCs sont confirmées exemptes de mycoplasmes.
      ​NOTE : Si les AFCs parentaux ne proviennent pas d’une biobanque certifiée avec stérilité et tests anti-mycoplasmes documentés, un dépistage systématique de mycoplasmes avant la reprogrammation est fortement recommandé comme étape initiale de contrôle qualité.
  5. Essai du potentiel de différenciation trilignée (facultatif)
    1. Confirmer la capacité de différenciation in vitro par différenciation dirigée trilignée ou par formation de corps embryonnaires (EB), suivie d’une analyse de marqueurs spécifiques aux feuillets germinatifs. En alternative, réaliser la formation de tératomes in vivo chez des souris immunodéficientes pour une validation de référence de la pluripotence.
      NOTE : Pour des protocoles détaillés d’essai de tératome ou de différenciation dirigée, se référer aux procédures opérationnelles standard publiées24. Ces essais sont recommandés, mais peuvent être omis si des analyses complètes des marqueurs in vitro et des données fonctionnelles de différenciation sont fournies.

6. Dérivation et vérification clonales au niveau de la cellule unique

REMARQUE : Afin de garantir que chaque lignée de CIP provienne d'une seule cellule, un processus de vérification clonale en deux étapes est recommandé. Après le prélèvement mécanique et l'expansion, il est conseillé d'effectuer un second ensemencement de clones unicellulaires après confirmation du caryotype. La vérification que chaque lignée de CIP dérive d'une cellule unique constitue une exigence essentielle pour la génération de CIP. Elle permet d'éliminer la mosaïque somatique parentale et confirme que la signature d'aneuploïdie diagnostique est uniforme au sein de l'ensemble de la population.

  1. Ensemencement à partir d'une cellule unique
    1. Dissocier et resuspendre les colonies de CIPs dont le caryotype a été confirmé en une suspension de cellules individuelles à l'aide d'Accutase pendant 2 à 6 minutes à 37 °C.
    2. Utiliser le milieu E8 supplémenté avec 10 µM de Y-27632 afin d'optimiser la survie des cellules isolées individuelles. Réaliser le dépôt de cellules uniques selon l'une des méthodes suivantes :
      1. Dilution limitante : Diluer la suspension à une concentration de 0,5 à 1 cellule par 100 µL. Ensemencer 100 µL dans chaque puits d'une plaque 96 puits revêtue de Matrigel.
      2. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : Trier directement les cellules uniques viables dans les puits d'une plaque 96 puits revêtue de Matrigel.
  2. Vérification et expansion de la monoclonalité
    1. Inspection initiale : 24 à 48 heures après l'ensemencement, utiliser un microscope à contraste de phase haute résolution pour inspecter chaque puits. Marquer uniquement les puits contenant un événement d'attachement unique et bien défini. Exclure les puits présentant plusieurs agrégats ou aucune cellule.
    2. Croissance des colonies : Maintenir les cellules uniques identifiées en milieu E8 sans inhibiteur de ROCK après les premières 24 heures.
    3. Expansion séquentielle : Une fois que la colonie dérivée d'une cellule unique atteint une confluence de 70 %, procéder à l'expansion séquentielle des cellules depuis la plaque 96 puits vers des formats 24 puits, 12 puits, puis finalement 6 puits.
      REMARQUE : Pour la recherche en thérapie cellulaire, une preuve photographique du stade de cellule unique (jour 0 ou jour 1) est souvent requise dans le cadre du certificat d'analyse afin de démontrer l'origine pure de lignée des lignées de CIPs.
      Les causes potentielles d'un reprogrammation infructueuse, d'une formation suboptimale des colonies et des difficultés rencontrées lors de l'établissement des clones de CIPs sont résumées, conjointement avec des solutions pratiques, dans Tableau 4.

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Résultats

Progression morphologique durant la reprogrammation

Les cellules primaires de liquide amniotique présentaient des morphologies hétérogènes, incluant des cellules de type E et de type F (Figure 1A). Les cellules de type F doivent être mises en culture et utilisées pour la reprogrammation. Après électroporation des cellules du liquide amniotique (AFC) avec des plasmides épisomaux Epi5, une séquence caractéristique de changements morphologiques est observée. Au jour ...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode non intégrative et sans cellules nourricières pour générer des iPSC humaines aneuploïdes à partir de cellules de liquide amniotique en utilisant des plasmides épisomaux délivrés via électroporation. Plusieurs étapes critiques déterminent le succès du reprogrammage. Premièrement, la qualité de la population initiale de cellules des villosités choriales (AFC) est primordiale. Dans les laboratoires cliniques de cytogénétique, les AFC sont généralement mises en culture dans des milieu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrent. L'illustration schématique de la Figure 7A a été générée à l'aide d'outils assistés par intelligence artificielle, puis examinée et modifiée par les auteurs.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme national clé de recherche et de développement de Chine (n° de subvention 2022YFA0913300) et par le projet clinique clé de l'hôpital universitaire de troisième ordre de l'Université de Pékin (n° de subvention BYSY2022054) attribués à Jianying Guo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trypsine-EDTA 0,25 %Thermo Fisher (Gibco)25200056Dissociation cellulaire pour le passage des AFC
Marqueur d'ADN 100 pb Plus IITransGen BiotechBM321-01Marqueur d'ADN
Congélateur à -80 °CThermo FisherFDE60086fvStockage à long terme de l'ADN plasmidique et des échantillons
Solution de détachement cellulaire AccutaseStemCell Technologies07920Dissociation douce des iPSC en petits agrégats
Acide acétique (glacial)Sigma-Aldrich338826Composant du fixateur pour le caryotypage (MeOH:AcOH 3:1)
AgaroseSigma-AldrichA9539Électrophorèse sur gel pour les produits de PCR (2 %)
Milieu AmnioType-1VivaCell BIOSCIENCESC3620-0100Milieu de culture primaire pour les AFC
Compteur cellulaire automatisé / HémocytomètreCountstarTC20Comptage des cellules viables par exclusion au bleu de trypan
Microscope à champ clair (100x à immersion)ZeissAxiovert5Analyse des métaphases pour le caryotypage
Centrifugeuse (rotor à godets oscillants)Eppendorf5810RFormation du culot cellulaire à 300 x g
Cabinet de sécurité de classe IIESCOAC2-4S8-CNEspace de travail stérile pour toutes les opérations de culture cellulaire
Incubateur CO2 (humidifié)Thermo scientific3131Maintien d'un environnement à 37 °C, 5 % CO2
Colcemid (10 µg/mL)Capricorn scientificCOL-HArrêt en métaphase pour le caryotypage (0,1 µg/mL, 2-4 h)
Milieu de congélation cellulaire CryoStor CS10STEMCELL Technologies07959Milieu de congélation cellulaire
DAPIMerck Millipore10236276001Marquage nucléaire
DMEM (glucose élevé)Thermo Fisher (Gibco)11965092Milieu de base pour le milieu de culture des fibroblastes (FC)
DMEM/F-12Thermo Fisher (Gibco)11330032Solution tampon pour la dilution de Matrigel (1:200)
DPBS sans Ca2+/Mg2+Thermo Fisher (Gibco)14190250Solution de lavage
Plasmide épisomal (pCE-GFP)Addgene#41858Vecteur de reprogrammation non intégratif (témoin GFP)
Plasmide épisomal (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F)Addgene#27077Vecteur de reprogrammation non intégratif (OCT4 + shp53)
Plasmide épisomal (pCXLE-hSK)Addgene#27078Vecteur de reprogrammation non intégratif (SOX2 + KLF4)
Plasmide épisomal (pCXLE-hUL)Addgene#27080Vecteur de reprogrammation non intégratif (L-MYC + LIN28)
Sérum de veau fœtalHyCloneSH30071.03Complément sérique pour l'expansion des AFC (milieu FC, 15 %)
Microscope à fluorescenceLeicaSp8Visualisation en immunofluorescence et marquage vivant TRA-1-60/81
Système d'électrophorèse sur gelBio-Rad164-5056Analyse par gel d'agarose des produits de PCR
Gélatine (0,1 %)Sigma-AldrichG1393Revêtement des récipients de culture pour l'attachement des AFC
Kit d'extraction d'ADN génomiqueTIANGEN4992199Isolation d'ADN de qualité PCR à partir d'iPSC
Solution de coloration de GiemsaSigma-AldrichGS500Coloration G-banding des chromosomes (5 %)
GlutaMAX (100x)Thermo Fisher (Gibco)35050061Complément pour le milieu FC
Microscope inversé à contraste de phaseZeissAxiovert5Surveillance quotidienne de la culture et de la morphologie des colonies
Réservoir d'azote liquideThermo ScientificCY50985Préservation cryogénique des cellules
Matrice de membrane basale MatrigelCorning354230Revêtement des récipients de culture pour l'attachement des iPSC
Méthanol (anhydre)Sigma-Aldrich34860Composant du fixateur pour le caryotypage (MeOH:AcOH 3:1)
Anticorps anti-NANOG (Lapin)Abcamab109250Immunofluorescence ; marqueur nucléaire de pluripotence
Kit d'électroporation Neon NxT (100 µL)Thermo Fisher (Invitrogen)N10025Électroporation ; contient les tampons R, T, E et des embouts de 100 µL
Système d'électroporation Neon NxTThermo Fisher (Invitrogen)NEON18SIntroduction des plasmides épisomaux par électroporation
Acides aminés non essentiels (NEAA, 100x)Thermo Fisher (Gibco)11140050Complément pour le milieu FC
Anticorps anti-OCT4 (Lapin)AbclonalA7920Immunofluorescence ; marqueur nucléaire de pluripotence
PCR Master Mix (haute fidélité)TIANGEN4992920Vérification de l'élimination des épisomes par PCR
pCXWB-EBNA1Addgene#37624Expression épisomale non réplicative de EBNA1
Anticorps PE anti-TRA-1-81 humainBioLegend330708Marquage de pluripotence
Pénicilline-Streptomycine (100x)Thermo Fisher (Gibco)15140122Complément antibiotique (non utilisé après électroporation)
Réactif Phalloïdine-iFluor 647Abcamab176759Marquage de l'actine F (filaments d'actine)
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP5405Solution hypotonique pour le caryotypage (0,075 M)
Système de PCR en temps réelThermo Fisher ScientificQuantStudio3qPCR pour la vérification des gènes marqueurs
Butyrate de sodium (NaB)Sigma-AldrichB5887Inhibiteur d'HDAC ; 25-100 µM pour améliorer la reprogrammation
Anticorps anti-SOX2 (Souris)R&D SystemsMAB2018Immunofluorescence ; marqueur nucléaire de pluripotence
Anticorps anti-SSEA-4BioLegend330408Immunofluorescence ; marqueur de surface cellulaire de pluripotence
StéréomicroscopeNikonSMZ745Prélèvement mécanique des colonies sous grossissement
TeSR-E8STEMCELL Technologies05990Milieu de maintien des iPSC sans cellules nourricières
Anticorps anti-TRA-1-60Merck MilliporeMAB4360Marquage de pluripotence
Marqueur d'ADN Trans IITransGen BiotechBM411-01Marqueur d'ADN
Kit de détection de mycoplasmes TransDetect PCRTransGen BiotechFM311-01Test de mycoplasmes 
Enzyme TrypLE Select (1x)Thermo Fisher (Gibco)12563011Dissociation douce des AFC adhérentes
Trypsine (0,025 %)Sigma-AldrichT4799Prétraitement pour banding G des lames (30-60 s)
Cycleur thermique VeritiPro 96 puitsThermo Fisher ScientificA48141PCR pour la vérification de l'élimination des épisomes
Bain-marie (37 °C)Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.ZX-S22Décongélation des milieux et réactifs
Y-27632 Dihydrochlorure (inhibiteur de ROCK)Tocris1254Amélioration de la survie des iPSC après dissociation (10 µM)

Références

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