Ce protocole fournit un flux de travail normalisé et reproductible pour évaluer la capacité proliférative ainsi que la différenciation ostéogénique et odontogénique de cellules souches dentaires humaines cultivées sur des échafaudages en nanomatériaux, à l’aide de tests normalisés (activité de la phosphatase alcaline, immunofluorescence de RANKL [ostéogénique] et immunofluorescence de DMP-1 [odontogénique]) et de stratégies de normalisation afin d’assurer la comparabilité entre études.
Article de méthode
Un protocole in vitro normalisé pour évaluer la différenciation et la prolifération de cellules souches de la pulpe dentaire humaine sur des échafaudages à base de nanomatériaux
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'évaluation fiable de la différenciation ostéogénique et odontogénique, ainsi que de la prolifération des cellules souches, est fondamentale pour apprécier la performance biologique des stratégies régénératives basées sur des échafaudages. Toutefois, la variabilité des protocoles expérimentaux, du choix des tests et de l'interprétation des données limite souvent la reproductibilité et la comparaison entre études. Le protocole décrit dans cet article présente un flux de travail normalisé et reproductible pour l'évaluation in vitro de la différenciation ostéogénique et odontogénique, ainsi que de la capacité proliférative, des cellules souches cultivées sur des échafaudages biomatériaux. L'engagement ostéogénique est évalué par l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline (ALP) et par l'immunofluorescence du ligand du récepteur activateur du facteur nucléaire κB (RANKL), tandis que l'engagement odontogénique est évalué par l'immunofluorescence de la protéine 1 de la matrice dentinaire (DMP-1) ; les deux paramètres protéiques sont quantifiés à l'aide de la méthodologie normalisée du score H. Les paramètres expérimentaux critiques, notamment la densité d'ensemencement cellulaire, les délais d'induction, les conditions des tests, les stratégies de normalisation (y compris l'activité ALP normalisée par la protéine, la viabilité au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) normalisée par cellule et le score H d'immunofluorescence) et les approches d'analyse des données, sont détaillés, accompagnés de recommandations de dépannage afin de réduire au minimum la variabilité technique. Cette méthodologie a été appliquée comme cadre normalisé dans plusieurs études expérimentales basées sur des échafaudages, démontrant sa robustesse et sa reproductibilité. En fournissant un cadre complet et validé, cet article vise à faciliter l'évaluation normalisée des interactions entre cellules souches et échafaudages et à améliorer la comparabilité entre les études précliniques en régénération tissulaire.
Introduction
L'endodontie régénérative représente un changement de paradigme en dentisterie, centré sur la restauration de la vitalité de la pulpe dentaire à l'aide de cellules souches, de facteurs de croissance et de supports1,2. Le maintien de la vitalité pulpaire est essentiel pour la fonction sensorielle et la réponse immunitaire, et revêt une importance particulière dans la prise en charge des dents immatures présentant une pulpe nécrosée, afin de permettre un développement racinaire continu2.
Les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (DPSC) et les cellules souches de la papille apicale (SCAP) sont des candidats privilégiés pour ces procédures en raison de leur potentiel prolifératif élevé, de leur capacité d'auto-renouvellement, de leurs propriétés immunosuppressives et de leur aptitude à se différencier en cellules de type odontoblaste dans des conditions microenvironnementales appropriées, ce qui en fait des candidats particulièrement viables pour des applications futures en médecine régénérative et en interventions thérapeutiques cellulaires3,4,5.
Bien que des matériaux formulés de manière conventionnelle, comme les ciments à base de silicate de calcium, aient été étudiés, des données récentes suggèrent que la modification par des nanoparticules peut influencer considérablement les interactions entre le biomatériau et les cellules6. Les biomatériaux nanostructurés pourraient offrir un microenvironnement plus biomimétique, favorisant potentiellement l’adhésion des cellules souches et leur différenciation selon des lignées spécifiques7. Toutefois, le comportement biologique de matériaux nouveaux, tels que le NeoMTA2 sous forme nanoparticulaire, reste insuffisamment compris par rapport à celui de matériaux bien établis, comme l’hydroxyapatite nanométrique8. Ce protocole répond au besoin d’un cadre méthodologique normalisé permettant d’évaluer de façon précise et reproductible ces interactions.
Ce cadre standardisé convient particulièrement aux études évaluant de nouveaux biomatériaux ou des échafaudages de nanomatériaux dans des conditions biologiques identiques, où la comparabilité entre les études est primordiale. Il présente des avantages par rapport aux approches basées sur un seul test en intégrant le criblage de viabilité (MTT), l'engagement ostéogénique précoce (activité de la phosphatase alcaline) et la différenciation au niveau protéique (score H d'immunofluorescence) au sein d'un même flux opérationnel. Les chercheurs utilisant habituellement la coloration à la rouge d'alizarine ou des tests à un seul point temporel pourraient tirer profit de l'adoption de ce cadre multiparamétrique afin de réduire les biais d'observateur et d'améliorer la résolution quantitative. Toutefois, ce protocole n'est pas conçu pour des cultures d'organoïdes tridimensionnelles, des systèmes de co-culture ou des modèles de cellules souches d'origine animale sans adaptation appropriée. Les investigateurs ayant besoin d'une analyse de l'expression génique (par exemple, RT-qPCR pour RUNX2, OCN ou DSPP) doivent compléter ce flux opérationnel par des tests moléculaires, car le présent protocole se concentre exclusivement sur les paramètres protéiques et enzymatiques.
Afin de capturer de manière exhaustive la capacité de différenciation bifonctionnelle des cellules souches dentaires, ce protocole utilise deux marqueurs d'immunofluorescence complémentaires reflétant des extrémités biologiques distinctes. Le RANKL (ligand activateur du facteur nucléaire kappa B) est utilisé comme marqueur de l'engagement dans la lignée ostéogénique : son expression sur les cellules de type ostéoblaste reflète la signalisation de minéralisation dépendante des ions calcium et l'activation des cellules formant l'os, ce qui est conforme à son utilisation dans plusieurs études évaluant les SCAP4,8,9. Le DMP-1 (protéine matricielle de la dentine-1) est utilisé en parallèle comme marqueur spécifique de la différenciation odontogénique/dentino-génique : sa surexpression dans les cellules de type odontoblaste reflète l'induction de la formation de la matrice dentinaire et la réparation tissulaire minérale spécifique de la pulpe, et est particulièrement pertinente lorsque la population cellulaire cible est constituée de DPSC10. En quantifiant à la fois le RANKL et le DMP-1 dans le même cadre expérimental à l'aide de la méthode du score H, ce protocole permet aux chercheurs de distinguer l'engagement ostéogénique de l'engagement odontogénique, deux issues superposées mais mécaniquement distinctes des interactions cellules souches–échafaudage, sans nécessiter de dispositifs expérimentaux séparés.
Protocole
Ce protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de la Faculté de médecine dentaire de l'Université d'Ain Shams, sous le numéro d'approbation FDASU-Rec IM112105. Toutes les procédures impliquant des tissus humains ont été réalisées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Des consentements éclairés écrits ont été obtenus de la part de tous les participants avant l'extraction dentaire et la collecte de cellules souches.
1. Préparation et caractérisation des nanomatériaux
- Synthétiser les nanomatériaux selon des exigences spécifiques10,11. Pour le Nano-NeoMTA2, broyer la poudre à l’aide d’un broyeur planétaire (voir Tableau des matériaux) pendant 10 h à 350 tr/min avec des intervalles de 3 min marche/arrêt. Utiliser un rapport massique billes/poudre de 10:1 avec des billes de broyage en zircone (diamètre de 5 mm) dans un récipient de broyage en zircone. Vérifier la taille finale des particules par microscopie électronique en transmission (MET) (cible : <200 nm) avant de poursuivre.
ATTENTION : la poudre NeoMTA2 peut provoquer une irritation respiratoire en cas d'inhalation. Effectuer toutes les étapes de broyage à sec dans une hotte chimique certifiée, en portant un masque respiratoire N95, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile. - Préparer l’hydroxyapatite nanostructurée par une méthode de précipitation chimique humide8,11,12 : 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Préparer 1 L de solution de nitrate de calcium à 0,5 M et 0,6 L de solution de phosphate d’ammonium à 0,3 M, les deux dans de l’eau déionisée. Ajouter goutte à goutte la solution de nitrate de calcium dans la solution de phosphate d’ammonium à environ 2–3 mL/min sous agitation continue à 400 tr/min, chauffer à 70 °C, et maintenir un pH de 10–12 par addition goutte à goutte d’hydroxyde d’ammonium8.
ATTENTION : l’hydroxyde d’ammonium est corrosif et dégage des vapeurs toxiques d’ammoniac. Manipuler uniquement dans une hotte chimique. Porter des gants résistants aux acides, des lunettes de protection contre les projections et une blouse de laboratoire. En cas de contact cutané, rincer immédiatement à l’eau pendant ≥15 min. - Traiter le précipité d’apatite obtenu par voie hydrothermale dans un autoclave à 140 °C et 0,3 MPa pendant 2–3 h10. Lyophiliser le précipité purifié à -50 °C sous une pression de vide ≤0,05 mbar pendant 48 h8.
- Préparer des nanoparticules de verre bioactif 45S5 par la méthode sol-gel comme suit.
- Préparer la solution précurseur en mélangeant 40 mL d’orthosilicate de tétraéthyle (TEOS) avec 10 mL d’acide nitrique 2 M (HNO₃) comme catalyseur acide dans un bécher en polypropylène sous agitation continue à 300 tr/min à température ambiante.
- Après 30 min, ajouter du nitrate de calcium tétrahydraté (Ca(NO₃)₂·4H₂O) et du nitrate de sodium (NaNO₃) afin d’obtenir la composition molaire cible : 45 % mol SiO₂, 24,5 % mol CaO, 24,5 % mol Na₂O et 6 % mol P₂O₅. Ajouter du phosphate de triéthyle (TEP) comme précurseur du phosphore.
- Agiter à température ambiante pendant 24 h. Vieillir le gel à 60 °C pendant 24 h dans un récipient hermétique. Sécher à 120 °C pendant 24 h. Calciner dans un four à moufle à 650 °C pendant 3 h (vitesse de montée : 2 °C/min). Broyer et confirmer la composition de phase par MET et diffraction des rayons X (DRX)4,9.
ATTENTION : le TEOS et l’éthanol sont inflammables. L’HNO₃ est corrosif. Réaliser toutes les opérations dans une hotte chimique, à l’écart de toute source d’inflammation.
- Caractériser toutes les nanoparticules préparées par MET haute résolution et DRX afin de confirmer la taille des particules et la cristallinité8. Enregistrer la taille moyenne des particules, l’indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta par diffusion de la lumière dynamique (DLS) afin de confirmer la stabilité colloïdale. Accepter les lots dont la taille moyenne des particules est <200 nm et le potentiel zêta <−15 mV ou >+15 mV.
2. Récolte et culture des cellules souches
- Recueillir des DPSC ou des SCAP à partir de troisièmes molaires inférieures incluses fraîchement extraites, après obtention d'un consentement éclairé écrit10. Traiter les dents extraites dans les 2 heures suivant l'extraction et les transporter dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à 4 °C.
NOTE : Les critères d'éligibilité des donneurs incluent des adultes en bonne santé systémique âgés de 18 à 35 ans, non-fumeurs, sans antécédent d'utilisation d'antibiotiques au cours des 3 mois précédents, sans maladie parodontale et sans signe radiographique de pathologie périapicale. - Isoler les cellules par la méthode de digestion enzymatique9. Hacher finement le tissu dentaire en morceaux de 1 à 2 mm et digérer avec une solution de collagénase de type I à une concentration de 3 mg/mL dans un milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans sérum, pendant 1 h à 37 °C, sous agitation continue à 60 tr/min sur une plateforme oscillante8. Neutraliser avec le milieu de culture complet et filtrer à travers un tamis cellulaire de 70 µm.
ATTENTION : La collagénase de type I peut contenir des endotoxines. Utiliser exclusivement une collagénase de qualité pour culture tissulaire et testée pour les endotoxines. Porter des gants et éviter toute inhalation. - Ensemencer la suspension monocellulaire dans des flacons de 75 cm2 à une densité initiale de 1 × 104 cellules/cm2, avec un milieu de culture complet composé de DMEM, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (Tableau des matériaux)8.
- Incuber les flacons à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂8. Surveiller quotidiennement la croissance et la contamination à l’aide d’un microscope inversé à contraste de phase10. Renouveler le milieu de culture toutes les 48 à 72 heures. Jeter tout flacon présentant des signes de contamination (turbidité, changement de couleur, morphologie cellulaire irrégulière).
- Recueillir les cellules après le troisième passage, lorsque la confluence atteint environ 70 à 80 %8. Pour le repiquage, aspirer le milieu, rincer avec du PBS, puis détacher les cellules à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 3 à 5 minutes à 37 °C. Neutraliser avec le milieu de culture complet, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes, puis réensemencer à une densité de 1 × 104 cellules/cm2. Utiliser uniquement des cellules comprises entre le passage 3 et le passage 6 afin de préserver la stabilité phénotypique.
3. Caractérisation des cellules souches
- Évaluer l'immunophénotype des cellules isolées par cytométrie en flux8,10. Caractériser les cellules au troisième passage. Inclure un témoin négatif non marqué et des témoins de compensation unicolores pour chaque fluorochrome utilisé.
- Ajuster la concentration cellulaire à 106/mL dans du PBS. Centrifuger à 800 x g pendant 10 min et laver le culot deux fois avec du PBS8,10.
- Marquer les cellules avec des anticorps anti-humains dirigés contre les marqueurs mésenchymateux (CD44, CD43) et les marqueurs hématopoïétiques (CD45) aux dilutions recommandées par le fabricant (généralement 1:100 dans du PBS contenant 1 % d'albumine sérique bovine (BSA)) (Tableau des matériaux)8,10. Incuber à 4 °C pendant 45 min à l'abri de la lumière. Laver deux fois avec du PBS et resuspendre dans 300 µL de PBS pour l'acquisition.
- Analyser les cellules à l'aide d'un logiciel d'analyse par cytométrie en flux (Tableau des matériaux) pour évaluer l'immunophénotype (expression de CD44 et CD73, CD45 servant de marqueur d'exclusion hématopoïétique). Appliquer un gating séquentiel : (a) sélection par dispersion (FSC-A vs. SSC-A) ; (b) exclusion des doublets (FSC-H vs. FSC-A) ; (c) positionnement des fenêtres spécifiques à chaque fluorochrome par rapport aux témoins non marqués. Indiquer le pourcentage de cellules positives pour chaque marqueur ainsi que la stratégie de gating utilisée.
4. Détermination de la concentration sûre d'un matériau (concentration efficace demi-maximale, EC₅₀)
- Déterminer la CE₅₀ à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique (GraphPad Prism 9). Ajuster les données de dose-réponse à une courbe sigmoïde de régression non linéaire (modèle logistique à quatre paramètres : Y = Bas + (Haut − Bas) / (1 + 10^((logCE₅₀ − X) × PenteHill))). Indiquer la valeur de CE₅₀ en µg/mL avec l’intervalle de confiance à 95 %8.
- Préparer des dilutions sériées des nanomatériaux (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 et 1,56 µg/mL) dans 1 mL de tampon PBS. Vortexer la suspension mère pendant 30 s, puis soumettre à une sonication (sonicateur à sonde, 40 W, 30 s activé/10 s inactif pendant 3 cycles à 4 °C) afin d’obtenir une suspension homogène. Stériliser sous UV dans une cabine de sécurité biologique pendant 30 min.
- Cultiver les cellules souches à une densité de 1 × 104 cellules/puits dans des plaques de 96 puits pendant 72 h avec les différentes concentrations, puis compter les cellules viables à l’aide du bleu de Trypan pour calculer la CE₅₀ selon le modèle logistique à quatre paramètres décrit à l’étape 4.1.
- Répéter les expériences en triple (n = 3 puits indépendants par concentration), avec au moins trois réplicats biologiques. Présenter les valeurs de CE₅₀ sous forme de moyenne ± écart-type (ET) et calculer le coefficient de variation (CV %) entre les réplicats (CV acceptable <15 %).
5. Évaluation de la différenciation ostéogénique et odontogénique
REMARQUE : Cette section évalue deux voies de différenciation complémentaires à l'aide de tests d'immunofluorescence parallèles réalisés à partir de la même préparation cellulaire. Le RANKL (étape 5.5) sert de marqueur ostéogénique ; la DMP-1 (étape 5.6) sert de marqueur odontogénique. Les deux sont quantifiés selon la même méthodologie de score H (étape 5.8). Réalisez les deux tests sur des lamelles distinctes préparées simultanément.
- Ensemencer les cellules souches dans des plaques de six puits à une densité de 4,5 × 105 cellules/puits. Laisser les cellules adhérer pendant 24 h dans un milieu de culture complet avant d'initier la différenciation.
- Répartir les échantillons en quatre groupes : témoin négatif (DMEM seul), témoin positif (milieu de différenciation ostéogénique/odontogénique) et groupes expérimentaux (nanomatériaux à des concentrations sûres dérivées de la CE₅₀).
- Préparer le milieu de différenciation ostéogénique en complétant le DMEM avec 10 % de SBF, 1 % de pénicilline/streptomycine, 10 mM de β-glycérophosphate, 50 µg/mL d'acide ascorbique (L-ascorbate-2-phosphate) et 100 nM de dexaméthasone. Renouveler le milieu toutes les 48 h. Incuber pendant 72 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
- Mesure de l'activité de la PAL
- Ensemencer les cellules dans des plaques de culture de 24 puits à raison de 1 × 104 cellules/puits et incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ pendant 72 h.
- Aspirer le milieu de culture, rincer les puits avec du PBS, puis lyser les cellules en ajoutant 200 µL de tampon de lyse par puits (0,1 % de Triton X-100 dans du PBS) et incuber à 4 °C pendant 10 min avec agitation douce.
- Récupérer le lysat et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C ; utiliser le surnageant pour toutes les mesures ultérieures de PAL. Transférer 50 µL de chaque échantillon test et 100 µL d'étalons de p-nitrophénol dans une plaque microtitration de 96 puits. Ajouter le tampon substrat AMP (Tableau des matériaux) pour initier la réaction catalytique.
- Après une seconde incubation de 30 min à 37 °C, arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de NaOH 0,5 M par puits. Mesurer immédiatement l'absorbance à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque à absorbance (Tableau des matériaux).
- Élaborer une courbe d'étalonnage de l'absorbance en fonction de la concentration de p-nitrophénol et calculer l'activité de la PAL en U/L.
- Déterminer la teneur totale en protéines du même lysat cellulaire à l'aide d'un dosage protéique de Bradford ou de BCA. Normaliser l'activité de la PAL par rapport à la teneur totale en protéines et exprimer les résultats finaux en U/mg de protéine.
- Marqueur ostéogénique (RANKL)
- Évaluer l'expression protéique de RANKL par immunofluorescence. Préparer d'abord des contrôles d'isotype et de secondaire seul : (a) remplacer l'anticorps primaire par une IgG de lapin appariée à l'isotype à la même concentration, et (b) omettre entièrement l'anticorps primaire dans des puits distincts.
- Fixer les cellules avec une solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Rincer trois fois avec du PBS (5 min chacun).
- Perméabiliser avec du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 min, puis bloquer avec du sérum de chèvre normal à 5 % dans du PBS pendant 1 h à température ambiante afin de réduire la liaison non spécifique. Sans rinçage, ajouter directement l'anticorps primaire Rabbit Anti-RANKL à une dilution de 1:200 dans le tampon de blocage (Tableau des matériaux) et incuber toute la nuit à 4 °C.
- Rincer trois fois avec du PBS, puis incuber avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome, Goat Anti-Rabbit IgG, à une dilution de 1:500 dans le tampon de blocage (Tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière8. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire, rincer trois fois avec du PBS (5 min chacun) et passer directement à l'étape 5.7 pour le montage.
PRÉCAUTION : Le paraformaldéhyde (solution à 4 %) est un fixateur toxique et probablement cancérogène. Préparer et utiliser uniquement dans une hotte chimique certifiée. Porter des gants en nitrile, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles.
REMARQUE. L'identité des cellules est confirmée par microscopie en contraste de phase et critères morphologiques avant l'évaluation par immunofluorescence (voir étape 5.10).
- Marqueur odontogénique (DMP-1)
REMARQUE : Évaluer l'expression protéique de DMP-1 (protéine de la matrice dentinaire-1) par immunofluorescence en parallèle avec l'étape 5.5 afin d'analyser l'engagement odontogénique.- À l'aide d'un jeu distinct de lamelles provenant de la même préparation cellulaire, répéter toutes les étapes de fixation, de perméabilisation et de blocage décrites à l'étape 5.5, y compris les contrôles d'isotype et de secondaire seul.
- Sans rinçage après le blocage, ajouter directement l'anticorps primaire anti-DMP-1 (voir Tableau des matériaux) à une dilution de 1:200 dans le tampon de blocage et incuber toute la nuit à 4 °C. Rincer trois fois avec du PBS, puis incuber avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié (utiliser un fluorochrome spectralement distinct de celui utilisé pour RANKL ; voir Tableau des matériaux) à une dilution de 1:500 dans le tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière.
- Acquérir des images de fluorescence avec un objectif 10x pour évaluer l'expression de DMP-1 comme indicateur de différenciation en odontoblaste-like10. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire, rincer trois fois avec du PBS (5 min chacun) et passer directement à l'étape 5.7 pour le montage.
- Monter les lames avec un milieu de montage antifade (voir Tableau des matériaux) et laisser durcir toute la nuit à température ambiante. Monter séparément les lames marquées pour RANKL et DMP-1 et les étiqueter clairement (par exemple, « Groupe RANKL 1 » et « Groupe DMP-1 1 ») avant l'acquisition d'images.
- Examiner immédiatement les lames en microscopie à fluorescence ou les conserver à 4 °C à l'abri de la lumière. Quantifier l'expression protéique en évaluant l'intensité de coloration à l'aide d'un système de notation standardisé à quatre niveaux : 0 (aucune coloration), 1+ (faible), 2+ (modérée) et 3+ (forte).
- Acquérir les images en utilisant des paramètres identiques du microscope (temps d'exposition, puissance du laser et gain) pour tous les groupes expérimentaux. Appliquer des paramètres identiques indépendamment pour chaque marqueur (RANKL et DMP-1) afin d'assurer une cohérence intra-marqueur entre les groupes.
- Noter un minimum de cinq champs aléatoires à fort grossissement (objectif x20) par puits. Faire réaliser la notation par deux observateurs indépendants et aveugles, et rapporter le coefficient kappa de Cohen (kappa acceptable ≥ 0,7).
- Calculer le score H à l'aide de la formule : score H = Σ(i × Pi), où i = intensité de coloration (1, 2 ou 3) et Pi = pourcentage de cellules (0–100 %) à chaque niveau d'intensité.
REMARQUE : Le score H varie de 0 à 30010. - Normaliser les données du score H par rapport au nombre total de cellules par champ, déterminé par comptage manuel de toutes les cellules visibles dans chaque champ en microscopie en contraste de phase avant l'acquisition d'images d'immunofluorescence, afin de tenir compte des différences de densité cellulaire entre les puits.
- Calculer et rapporter séparément les scores H pour RANKL (critère ostéogénique) et DMP-1 (critère odontogénique) afin de permettre une comparaison directe entre les deux voies de différenciation.
6. Évaluation de la prolifération et de la viabilité
- Effectuer le dénombrement cellulaire à l’aide d’un hémositomètre et de la coloration au bleu de trypan pour distinguer les cellules viables des cellules non viables. Calculer le nombre total de cellules viables par mL de culture. Dénombrer au moins 100 cellules par échantillon afin d’assurer une fiabilité statistique.
- Effectuer le test MTT pour mesurer l'activité métabolique mitochondriale8,10.
- Ajouter la solution de MTT à une concentration finale de 0,5 mg/mL (Table des matériels) aux cellules et incuber pendant 4 h à 37 °C. Éliminer la solution, ajouter un agent solubilisant (par exemple, SDS-HCl ; voir Table des matériels) et mesurez la densité optique à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (longueur d'onde de référence : 630–650 nm).
- Calculer la viabilité cellulaire selon la formule : Viabilité (%) = (Absorbance des cellules traitées / Absorbance des cellules de contrôle non traitées) × 100. Valeurs >100 % indiquent une stimulation proliférative par rapport au témoin négatif. Inclure un puits vide pour la correction du fond.
- Normaliser les résultats au nombre de cellules à l'aide d'un décompte parallèle au bleu de trypan. Réaliser tous les dosages en triplicat (n = 3 puits/groupe, ≥3 réplicats biologiques).
ATTENTION : Le tampon de solubilisation SDS-HCl est corrosif. Manipulez-le en portant les équipements de protection individuelle appropriés. Éliminez les déchets contenant du formazan conformément à la réglementation institutionnelle.
Résultats
Tous les résultats présentés ici sont adaptés d'études complémentaires4,8,9,10 menées par le même groupe de recherche dans le cadre d'une approbation éthique institutionnelle unique (FDASU-Rec IM112105).
Caractérisation des nanomatériaux et isolement des cellules souches
Le protocole standardisé fournit initialement une confirmation quantifiable des propriétés du support et des phénotypes des cellules souches. Après la synthèse, les nanomatériaux préparés sont validés par microscopie électronique en transmission à haute résolution (MET) et diffraction des rayons X (DRX) afin de confirmer la taille des particules et la cristallinité (Figure 1A,B). Parallèlement, les DPSC ou SCAP isolées par digestion enzymatique présentent un bon taux d’attachement et une prolifération robuste en milieu de culture complet. L’analyse par cytométrie en flux valide l’immunophénotype des cellules récoltées au troisième passage, montrant une forte expression des marqueurs mésenchymateux (CD44, CD43) et confirmant leur origine non hématopoïétique par l’absence de CD45 (Figure 1C).
Établissement de la concentration sûre des matériaux et de la prolifération
En cultivant des cellules souches dans des dilutions sériées des nanomatériaux (50–1.56 µg/mL) pendant 72 h, une régression logistique à quatre paramètres des dénombrements de cellules viables fournit une CE fiable₅₀ valeur (modèle de réponse dose-dépendante non linéaire en forme de sigmoïde, tel que décrit à l'étape 4.1). Des valeurs de viabilité MTT dépassant 100 % indiquent une stimulation proliférative par rapport au témoin non traité, car les valeurs sont normalisées par rapport au groupe témoin négatif (cellules non traitées fixées à 100 %). Une valeur d'environ 196 % pour Nano-NeoMTA2, par exemple, reflète une stimulation bioactive de l'activité mitochondriale plutôt qu'une >100 % de survie cellulaire absolue9.
Dans plusieurs études appliquant ce protocole standardisé, des valeurs de CE₅₀ de 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 et de 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 ont été établies à l’aide du modèle logistique à quatre paramètres (étape 4.1), confirmant ainsi des concentrations de travail sûres pour les tests de différenciation décrits dans ce protocole. Ces valeurs sont intégrées au Tableau 1 comme métriques représentatives de validation.
Quantification de la différenciation ostéogénique et odontogénique (évaluation par double marqueur)
L'approche de double immunofluorescence fournit deux mesures d'issue distinctes et complémentaires à partir de la même préparation cellulaire. Pour l'évaluation ostéogénique, les scores H de RANKL distinguaient les quatre groupes avec une signification statistique : les cellules cultivées avec le Nano-NeoMTA2 présentaient une expression de RANKL nettement plus élevée que le témoin négatif, ce qui est compatible avec une activation ostéoblastique accrueFigure 2A, Tableau 1)8,9Pour l'évaluation odontogénique, les scores H de la DMP-1 ont révélé une différenciation robuste de type odontoblaste dans les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) cultivées avec le Nano-NeoMTA2, les scores H étant significativement plus élevés que dans les groupes nanohydroxyapatite et contrôle négatif, confirmant une orientation privilégiée vers la lignée dentinogénique. (Figure 3A, Tableau 1)10L'identité cellulaire a été confirmée par microscopie en contraste de phase et selon des critères morphologiques caractéristiques (morphologie en fuseau ou polygonale) avant le comptage.
L'activité de la phosphatase alcaline a été distinguée par spectrophotométrie dans tous les groupes à 405 nm, servant de marqueur enzymatique précoce d'engagement ostéogénique et odontogénique (Tableau 1). L'analyse spectrophotométrique au MTT a confirmé que tous les nanomatériaux, à des concentrations sûres dérivées de la CE₅₀, maintenaient une forte viabilité cellulaire par rapport au témoin négatif, en accord avec les valeurs représentatives présentées (Tableau 1).
Résultats expérimentaux sous-optimaux et infructueux
Les résultats sous-optimaux sont résumés dans le Tableau 2. Une faible viabilité cellulaire dans le test MTT indique généralement que la concentration du nanomatériau dépasse le seuil de CE₅₀ ou que la stérilisation UV a été insuffisante. Une absorbance ALP irrégulière (CV > 20 %) indique habituellement une densité de semis inégale ou une homogénéisation incomplète du tampon de lyse. Un signal d'immunofluorescence faible ou absent, qu'il concerne RANKL ou DMP-1, résulte le plus souvent d'une inactivation des anticorps, d'une perméabilisation insuffisante ou d'une sur-fixation ; l'utilisation de formaldéhyde frais à 4 % et d'aliquots d'anticorps à usage unique permet de résoudre ce problème. La présence d'une éventuelle réaction croisée entre les canaux RANKL et DMP-1 doit être exclue en examinant les images des témoins secondaires uniquement, avant l'analyse.
Figure 1 : Caractérisation normalisée des nanomatériaux et validation du phénotype des cellules souches. (A) Spectres de DRX confirmant la phase cristalline et l'intégrité structurale des nanoparticules. (B) Images représentatives en MET montrant la taille nanométrique des particules, la morphologie et la dispersion homogène des biomatériaux synthétisés ; comparaison entre NeoMTA2 et l'hydroxyapatite. Des vues à faible grossissement sont présentées pour (a) NeoMTA2 et (b) l'hydroxyapatite, tandis que des vues à fort grossissement sont détaillées pour (c) NeoMTA2 et (d) l'hydroxyapatite. Les barres d'échelle sont indiquées en bas à gauche. (C) Protocole de sélection en cytométrie en flux pour la caractérisation des cellules souches. Des diagrammes en nuages de points multiparamétriques représentatifs montrent des cellules marquées pour CD44, CD73 (étiqueté CD43 PE sur les graphiques originaux) et CD45. Les sous-populations CD44+ et CD73+ ont été sélectionnées en fonction de l'expression de CD45. Le panneau A et C sont adaptés de Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) et le panneau B est adapté de Habib et al.10 (CC BY-NC). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation quantitative et semi-quantitative de la différenciation ostéogénique par immunofluorescence de RANKL. (A) Microphotographies immunofluorescentes représentatives à haute résolution montrant l'expression de marqueurs protéiques ostéogéniques clés, RANKL, dans le microenvironnement de la matrice 2D. (a) Les cellules du contrôle négatif forment de petites colonies avec une expression faible et membranaire de RANKL, tandis que (b) les cellules du contrôle positif présentent un nombre accru de colonies de type ostéoblastique avec une expression dense et homogène. Les cellules souches traitées avec (c) NHAP, (d) NHAP/chitosane et (e) des nanoparticules de verre bioactif montrent une différenciation avancée, caractérisée par de grandes colonies de type ostéoblastique fusionnées, avec une localisation intense et homogène de RANKL au niveau de la membrane et du noyau ; adapté de : Elshahat et al.4. (B) Histogrammes représentant la quantification par score H de l'expression de RANKL dans les différentes études. Application de la méthode du score H pour normaliser les données d'immunofluorescence. En intégrant mathématiquement l'intensité visuelle de la coloration (notée de 0 à 3) avec le pourcentage de cellules positivement colorées, le score H transforme l'analyse microscopique qualitative en une métrique robuste et semi-quantitative, réduisant ainsi significativement les biais subjectifs liés à l'observateur. (a) Comparaison entre Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) et les nanoparticules de verre bioactif (NBG ; 500 µg/mL) par rapport au milieu ostéogénique (contrôle positif, OM-PC) et au DMEM (contrôle négatif, DMEM-NC). Les NBG induisent le profil d'expression le plus élevé (p < 0,001). Adapté de Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Évaluation de l'hydroxyapatite nanométrique (NHAP ; 10 µg/mL), du composite NHAP/chitosane (10 µg/mL) et des NBG (500 µg/mL) par rapport aux contrôles, le composite NHAP/chitosane présentant les scores H les plus élevés. Adapté de Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Évaluation de Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) par rapport à NHAP (10 µg/mL) et aux contrôles, montrant une expression de RANKL significativement plus élevée avec Nano-NeoMTA2, adapté de : Zaki et al.8. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives d'immunofluorescence et analyse du score H. (A) Évaluation par microscopie d'immunofluorescence de l'expression de la protéine matricielle de la dentine (DMP-1) dans les différents groupes expérimentaux ; la fluorescence verte indique une coloration positive pour les anticorps polyclonaux anti-DMP-1. (a) Contrôle négatif : les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) cultivées en milieu non différencié (UM) présentent de petits agrégats cellulaires avec une expression faible et uniforme de DMP-1 (+). (b) Contrôle positif : les hDPSC cultivées en milieu odontogénique (OM) montrent une expansion des colonies marquée par des signaux intenses et homogènes de DMP-1 (++). (c) Nanohydroxyapatite (10 μg/mL) et (d) Nano-NeoMTA2 (9,92 μg/mL) : les hDPSC différenciées forment de grandes colonies fusionnées de cellules de type odontoblaste, présentant une expression forte et homogène de DMP-1 localisée au niveau des membranes et des noyaux. Grossissement : ×10. Les cercles jaunes indiquent les colonies de type odontoblaste ; les flèches jaunes montrent une expression intense de DMP-1. (B) Histogramme représentant la quantification du score H de l'expression de la protéine matricielle de la dentine dans les différents groupes de l'étude. Une différence hautement significative a été observée entre les groupes, le score H le plus élevé étant enregistré dans le groupe Nano-NeoMTA2 (169,33 ± 4,04), suivi par celui du groupe nanohydroxyapatite (140,33 ± 2,52) et du contrôle négatif (15,33 ± 1,53). Les panneaux A et B sont adaptés de Habib et al.10 (CC BY-NC). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
| Test / Paramètre | Nanomatériau / Type cellulaire | Valeur représentative (Moyenne ± ÉT) | Normalisation | Source |
| Viabilité cellulaire (test MTT) | ||||
| Viabilité MTT | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | ~196 % (DO = 1,56 ± 0,24) | Normalisé par rapport au témoin non traité (DMEM-NC = 100 %) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilité MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99,97 % | Normalisé par rapport au témoin non traité (DMEM-NC = 100 %) | Elshahat et al.⁴ |
| Viabilité MTT — Témoin positif | OM-PC / SCAPs | 113,46 % (DO = 0,93 ± 0,03) | Normalisé par rapport au témoin non traité (DMEM-NC = 100 %) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilité MTT — Témoin négatif | DMEM-NC / SCAPs | 100 % (DO = 0,82 ± 0,02) — Valeur de référence de base | DMEM-NC défini comme référence à 100 % pour tous les groupes | Abdelaziz et al.⁹ |
| Activité de la phosphatase alcaline (ALP) | ||||
| Activité ALP | Nanoparticules de verre bioactif (500 µg/mL) / SCAPs | 69,86 ± 0,98 U/L | Normalisé par rapport à la teneur totale en protéines (U/mg protéine, test de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Activité ALP — Témoin positif | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Normalisé par rapport à la teneur totale en protéines (U/mg protéine, test de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Activité ALP — Témoin négatif | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Normalisé par rapport à la teneur totale en protéines (U/mg protéine, test de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Concentration sûre du matériau (CE₅₀) | ||||
| CE₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7,9 µg/mL | Modèle logistique à quatre paramètres (réponse dose-dépendante sigmoïdale non linéaire, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| CE₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9,92 µg/mL | Modèle logistique à quatre paramètres (réponse dose-dépendante sigmoïdale non linéaire, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| Score H — Expression protéique de RANKL (marqueur ostéogénique) | ||||
| Score H (RANKL) marqueur ostéogénique | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Zaki et al.⁸ |
| Score H (RANKL) marqueur ostéogénique | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Zaki et al.⁸ |
| Score H (RANKL) Témoin positif | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Zaki et al.⁸ |
| Score H (RANKL) Témoin négatif | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Zaki et al.⁸ |
| Score H — Expression protéique de DMP-1 (marqueur odontogénique) | ||||
| Score H (DMP-1) marqueur odontogénique | Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs | 169,33 ± 4,04 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Habib et al.10 |
| Score H (DMP-1) marqueur odontogénique | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140,33 ± 2,52 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Habib et al.10 |
| Score H (DMP-1) Témoin négatif | DMEM-NC / DPSCs | 15,33 ± 1,53 (échelle 0–300) | Nombre total de cellules visibles par champ (microscopie à contraste de phase) | Habib et al.10 |
| Score H (DMP-1) marqueur odontogénique [Témoin positif -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 score H (échelle 0–300) | Nombre total de cellules par champ (microscopie à contraste de phase) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| Score H = Σ(i × Pi) : i = intensité de coloration (1, 2 ou 3) ; Pi = pourcentage de cellules à chaque niveau d’intensité (0–100 %) ; plage 0–300. La viabilité MTT est exprimée par rapport au DMEM-NC défini comme référence à 100 %. L’activité ALP est exprimée en U/L à partir de la déphosphorylation enzymatique du phosphate de p-nitrophényl ; normalisée ensuite par rapport à la teneur totale en protéines (U/mg protéine). OM-PC = milieu d’induction ostéogénique/odontogénique (témoin positif). DMEM-NC = milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (témoin négatif). | ||||
Tableau 1 : Résultats représentatifs de la procédure normalisée d'évaluation in vitro. Résultats quantitatifs représentatifs issus d'études précédemment publiées, illustrant la prolifération cellulaire, l'activité de la phosphatase alcaline et les analyses d'immunofluorescence réalisées à l'aide du protocole standardisé.
| Problème observé | Cause potentielle | Solution recommandée |
| Faible viabilité cellulaire dans le test MTT (OD < témoin non traité | La concentration du nanomatériau dépasse la CE₅₀, ou une stérilisation UV insuffisante, ou une dispersion inadéquate des nanoparticules. | Relancer EC₅₀ détermination (section 4). Prolonger la stérilisation UV à 30 min. Vérifier la suspension homogène des nanoparticules par sonication par sonde (40 W, 30 s marche/arrêt, 3 cycles à 4 °C) juste avant utilisation. |
| CV de viabilité MTT >15 % entre les réplicats | Erreur de pipetage, semis inégal des cellules ou variation du temps/température d'incubation du MTT. | Utilisez une pipette multicanal calibrée pour toutes les additions. Vérifiez la densité de semis à l’aide d’un hématimètre avant la mise en culture. Maintenez une incubation stricte de 4 h à 37 °C dans un CO₂ humidifié₂ incubateur. Inclure un puits témoin pour la correction du fond. |
| Lectures absorbancées incohérentes de la PAL (CV >20 % entre les puits | Densité de semis cellulaire irrégulière, lyse cellulaire incomplète ou manque de reproductibilité lors de la pipette lors de l'ajout du substrat. | Respecter strictement 1 × 10⁴ cellules/puits dans des plaques de 24 puits. Vortexer le tampon de lyse soigneusement avant utilisation. Maintenir une incubation de lyse constante (10 min, 4 °C, agitation douce). Vérifiez l'absorbance du fond avec un puits témoin sans cellules. |
| Immunofluorescence faible ou absente de RANKL signal (étape 5.4a) | Inactivation des anticorps due à un stockage inapproprié, une sur-fixation réduisant l'accessibilité des épitopes ou une perméabilisation insuffisante. | Préparer du formaldéhyde à 4 % fraîchement juste avant utilisation. Ajouter une perméabilisation au Triton X-100 0,1 % (10 min, température ambiante) avant le blocage. Titre la dilution de l'anticorps primaire (commencer à 1:200). Inclure une section de tissu témoin positif. Aliquoter le stock d'anticorps afin d'éviter des cycles de congélation-décongélation répétés. |
| Immunofluorescence faible ou absente de la DMP-1 signal (étape 5.4b) | Inactivation des anticorps due aux cycles de congélation-décongélation, à une dilution inappropriée de l'anticorps primaire ou à une espèce hôte incompatibles pour l'anticorps secondaire. | Répartir l'anticorps anti-DMP-1 en aliquotes afin d'éviter les cycles de congélation-décongélation. Titrer la dilution à partir de 1:200. Vérifier la compatibilité des espèces hôtes entre l'anticorps primaire (DMP-1) et l'anticorps secondaire. Inclure une section de tissu dentinaire comme témoin positif pour DMP-1. |
| Réactivité croisée entre RANKL et DMP-1 canaux de fluorescence | Chevauchement spectral dans les spectres d'émission si le même fluorochrome est utilisé pour les deux anticorps secondaires, ou séparation inadéquate des canaux sur le microscope à fluorescence. | Utiliser des fluorochromes de second anticorps spectralement distincts pour RANKL et DMP-1 (par exemple, Alexa Fluor 488 pour un marqueur, Alexa Fluor 594 pour l'autre). Examiner les images des témoins sans premier anticorps pour chaque canal indépendamment avant l'analyse. Acquérir les images de RANKL et de DMP-1 séparément en utilisant le mode d'acquisition séquentielle. |
| Fond élevé non spécifique dans coloration en immunofluorescence | Blocage insuffisant par la protéine, concentration d'anticorps secondaire trop élevée ou étapes de lavage inadéquates entre les incubations. | Prolonger l’incubation de blocage à 2 h à température ambiante. Augmenter la dilution de l’anticorps secondaire à 1:1000. Vérifier la spécificité à l’aide du témoin secondaire uniquement (sans anticorps primaire). S’assurer que tous les lavages avec le PBS sont complets (3 × 5 min chacun). |
| Variabilité inter-observateurs du score H (Coefficient kappa de Cohen <0,7, étape 5,6) | Application incohérente de l'échelle d'intensité de coloration à quatre niveaux (0, 1+, 2+, 3+) entre les observateurs, ou étalonnage insuffisant avant les séances d'évaluation. | Mener une séance de calibration conjointe en utilisant des images d'entraînement représentatives avant l'évaluation formelle. Utiliser des paramètres d'affichage d'image identiques (luminosité, contraste) pour tous les observateurs. Évaluer un minimum de cinq champs à fort grossissement par puits et calculer le kappa après chaque lot de 10 champs afin de surveiller les dérives. |
| EC₅₀ la courbe ne converge pas ou si l'ajustement est médiocre (étape 4.1) | Nombre insuffisant de points de données, plage de concentration trop étroite ou suspension non homogène avant l'ensemencement. | Étendre la gamme de dilutions sérielles afin d'inclure au moins 6 concentrations s'étendant de 50 à1.56 µg/mL. S'assurer que la sonication de la sonde est effectuée immédiatement avant chaque étape de dilution. Répéter avec au moins 3 réplicats biologiques indépendants. Confirmer le CV <15 % entre les réplicats. |
Tableau 2 : Paramètres critiques et guide de dépannage. Problèmes techniques courants rencontrés pendant le protocole, leurs causes possibles et les solutions recommandées pour améliorer la reproductibilité expérimentale et la qualité des données. Abréviations : CV = coefficient de variation ; RT = température ambiante.
Discussion
Les étapes critiques de ce protocole comprennent la détermination précise de la CE₅₀, la suspension homogène des nanomatériaux et la normalisation des résultats des tests biologiques. Le calcul de la CE₅₀ par régression non linéaire (modèle logistique à quatre paramètres) fournit une estimation plus rigoureuse de la relation dose-réponse que l'interpolation linéaire et doit être privilégié lorsque suffisamment de points de données sont disponibles13,14. Il est essentiel d'assurer une suspension homogène des nanoparticules par sonication au moyen d'une sonde juste avant l'exposition cellulaire ; des suspensions mal dispersées produisent des courbes dose-réponse peu fiables et faussent les estimations de la CE₅₀. Pour des matériaux nouveaux tels que NeoMTA2, le broyage à l'échelle nanométrique constitue une première étape indispensable, car la taille des particules en vrac modifie considérablement la réactivité de surface et, par conséquent, l'activité biologique13,14. Si une faible viabilité cellulaire est observée à des concentrations censées être sans danger, les chercheurs doivent vérifier le protocole de stérilisation aux UV et réexaminer les procédures de broyage et de dispersion avant de répéter le test de CE₅₀10.
Un pilier de ce protocole réside dans l'utilisation de deux marqueurs d'immunofluorescence complémentaires reflétant des voies de différenciation distinctes mais partiellement superposées. La surexpression de RANKL sur les cellules de type ostéoblastique reflète une signalisation ostéogénique induite par les ions calcium et est proportionnelle au nombre de cellules ostéogéniques8,9, tandis que l'expression de DMP-1 constitue un indicateur spécifique de la différenciation de type odontoblaste et de l'activité dentinogénique, ce qui la rend particulièrement pertinente lorsque la population cellulaire cible est constituée de DPSC10. En quantifiant les deux marqueurs selon la méthodologie du score H, ce protocole permet aux chercheurs de distinguer l'engagement ostéogénique de l'engagement odontogénique au sein d'un système d'essai standardisé unique, une avancée par rapport aux approches à un seul marqueur qui ne permettent pas de différencier l'engagement en faveur de la formation osseuse de celui en faveur de la formation de la dentine. Les scores H de RANKL et de DMP-1 doivent être rapportés dans toutes les publications utilisant ce protocole afin de préserver la comparabilité entre les études. Les chercheurs doivent utiliser des fluorochromes spectralement distincts pour les deux anticorps secondaires afin d'éviter le recouvrement des canaux et doivent examiner les images des contrôles sans anticorps secondaires avant l'analyse.
Plusieurs modifications méthodologiques peuvent être nécessaires lors de l'adaptation de ce protocole à d'autres biomatériaux ou modèles cellulaires. Pour les échafaudages fortement opaques ou colorés, une interférence avec l'absorbance du MTT à 570 nm peut imposer le recours à un test de viabilité alternatif, tel que CellTiter-Glo (luminescence) ou PrestoBlue (réduction de la résazurine), qui sont moins sensibles aux interférences optiques provenant des matériaux d'échafaudage. Les chercheurs utilisant des SCAP plutôt que des DPSC doivent noter que les SCAP présentent généralement une expression plus forte de RANKL, reflétant leur engagement ostéogénique plus marqué, tandis que les DPSC montrent une expression plus prononcée de DMP-1, reflétant leur orientation plus marquée vers la lignée odontogénique/dentinogénique. Le numéro de passage constitue une variable critique : les cellules au-delà du passage 6 doivent être évitées, car elles peuvent présenter une capacité de différenciation réduite ainsi qu'une expression altérée des marqueurs de surface.
Les limites de ce cadre méthodologique incluent une fenêtre d'évaluation à court terme (72 h), qui pourrait ne pas rendre compte des événements de minéralisation en phase tardive, nécessitant généralement 14 à 21 jours. L'absence de validation in vivo représente un fossé translationnel important. L'utilisation du score H introduit une variabilité potentielle entre observateurs ; la fiabilité inter-observateurs (kappa de Cohen) indiquée à la section 5.10 devrait être incluse dans tous les résultats publiés.
Ce cadre présente plusieurs avantages par rapport aux approches existantes à point final unique. Les dosages ostéogéniques conventionnels s'appuient souvent uniquement sur la coloration au rouge d'alizarine ou sur l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) à un seul point temporel. L'intégration du criblage de viabilité par MTT, de la quantification de l'activité de l'ALP et du score H d'immunofluorescence double RANKL + DMP-1 dans un même protocole fournit une sortie multiparamétrique permettant une comparaison statistique directe entre différents types de supports dans des conditions expérimentales identiques. Les stratégies de normalisation décrites — activité de l'ALP exprimée par mg de protéine, résultats du MTT exprimés en pourcentage du témoin non traité, et score H normalisé au nombre total de cellules par champ — éliminent les interférences dues à la variabilité entre puits4,8.
Des études futures pourraient appliquer cette méthodologie afin d'évaluer les effets des biomatériaux sur les marqueurs inflammatoires, les réponses angiogéniques ou d'autres modèles de cellules souches. La séquence du test peut également être adaptée à des formats de support tridimensionnel (3D). En définitive, l'adoption de ce cadre normalisé par des laboratoires indépendants permettra des comparaisons significatives par méta-analyse du rendement des supports dans la recherche préclinique en médecine dentaire régénérative15.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaques de culture 24 puits | Corning | 3527 | Utilisées pour les dosages de la phosphatase alcaline (ALP) |
| Plaques 96 puits | Corning | 3596 | Utilisées pour les mesures d'absorbance de l'ALP et les dosages MTT |
| Kit de dosage de l'ALP | Abcam | ab83369 (ou équivalent) | Utilisé pour mesurer l'activité de la phosphatase alcaline |
| Solution tampon substrat de l'ALP (2-amino-2-méthyl-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/A | Utilisée pour initier la réaction catalytique de l'ALP |
| Hydroxyde d'ammonium (NH4OH) | N/A | N/A | Utilisé pour l'ajustement du pH lors de la synthèse de nanohydroxyapatite. CORROSIF |
| Anticorps primaire anti-DMP-1 | N/A | N/A | Marqueur odontogénique ; dilution 1:200 dans le tampon de blocage ; incubation toute la nuit à 4 °C |
| Anticorps anti-CD44 humain (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Utilisé pour la cytométrie en flux ; marqueur positif des cellules souches mésenchymateuses |
| Anticorps anti-CD45 humain (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Utilisé pour la cytométrie en flux ; marqueur négatif de lignée hématopoïétique |
| Anticorps anti-CD73 humain (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Utilisé pour la cytométrie en flux ; marqueur positif des cellules souches mésenchymateuses |
| Autoclave (réacteur hydrothermal) | Tuttnauer | N/A | Utilisé pour le traitement hydrothermal de la nanohydroxyapatite à 140 °C, 0,3 MPa |
| Kit de dosage des protéines BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (ou équivalent) | Utilisé pour déterminer la concentration totale en protéines afin de normaliser l'activité de l'ALP |
| Incubateur CO2 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Réglé à 37 °C et 5 % de CO2 pour toutes les étapes de culture cellulaire |
| Collagénase de type I | Sigma-Aldrich | C0130 | Utilisée pour la digestion enzymatique des tissus dentaires lors de l'isolement des cellules souches |
| DMEM (milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Milieu de culture de base ; également utilisé comme groupe témoin négatif |
| Sérum bovin fœtal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Complément pour le milieu de culture complet ; FBS qualifié pour les cellules souches mésenchymateuses utilisé dans le milieu de différenciation |
| Cytomètre en flux (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Utilisé pour l'immunophénotypage des cellules souches |
| Logiciel d'analyse de cytométrie en flux (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Utilisé pour le réglage des portes et l'analyse des données des panneaux de cytométrie en flux |
| Microscope à fluorescence | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Utilisé pour l'imagerie en immunofluorescence et le calcul du score H |
| Lyophilisateur (séchoir par congélation) | Labconco | N/A | Utilisé pour sécher les précipités de nanomatériaux à −50 °C |
| Anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Anticorps secondaire fluorescent ; dilution 1:500 ; 1 h à température ambiante |
| Anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (ou équivalent) | A-11012 (ou équivalent) | Anticorps secondaire à spectre distinct utilisé pour l'immunofluorescence de DMP-1 lors de colorations multiplex |
| Logiciel GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9 | Utilisé pour le calcul de la CE50 et pour l'analyse statistique |
| Hémocytomètre | Neubauer | N/A | Utilisé pour le comptage manuel des cellules et le nombre total de cellules pour la normalisation du score H |
| Microscope inversé à contraste de phase | Olympus | N/A | Utilisé pour le suivi quotidien de la croissance et de la morphologie cellulaires |
| Milieu de montage antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Utilisé pour le montage des lames après coloration en immunofluorescence |
| Réactif MTT | Invitrogen | M6494 | Utilisé pour évaluer l'activité métabolique cellulaire ; 0,5 mg/mL, 4 h à 37 °C |
| Nanohydroxyapatite (NHAP) | Nanogate, Le Caire, Égypte | N/A | Synthétisée par précipitation humide ou obtenue commercialement ; utilisée à 10 µg/mL |
| Poudre de NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Matériau de départ pour la préparation de Nano-NeoMTA2 par broyage planétaire |
| Sérum de chèvre normal | N/A | N/A | Utilisé pour le blocage (5 % dans le PBS) avant l'application de l'anticorps primaire |
| Milieu de différenciation ostéogénique/odontogénique | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Milieu témoin positif ; contient du DMEM, du FBS, de l'ascorbate, du bêta-glycérophosphate et de la dexaméthasone |
| Paraformaldéhyde (4 %) | Sigma-Aldrich | P6148 | Utilisé pour la fixation cellulaire avant l'immunofluorescence. TOXIQUE — à utiliser sous hotte |
| PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Utilisé pour le lavage des cellules, la dilution des anticorps et la suspension des nanomatériaux |
| Solution de pénicilline-streptomycine | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Complément antibiotique ; utilisé à 1 % dans le milieu de culture complet |
| Broyeur planétaire | Retsch (ou équivalent) | PM 400 | Utilisé pour la nanosisation de la poudre de NeoMTA2 ; 350 tr/min, 10 h |
| Étalons de p-nitrophénol | Sigma-Aldrich | N/A | Utilisés pour générer la courbe standard d'activité de l'ALP |
| Anticorps primaire anti-RANKL de lapin | Abcam | ab9957 | Marqueur ostéogénique ; dilution 1:200 ; incubation toute la nuit à 4 °C |
| Anticorps témoin d'isotype IgG de lapin | N/A | Témoin négatif pour l'immunofluorescence ; concentration équivalente à celle de l'anticorps primaire | |
| Solution de solubilisation SDS-HCl | Sigma-Aldrich | N/A | Utilisée pour dissoudre les cristaux de formazan MTT. CORROSIVE |
| Plaques de culture tissulaire 6 puits | Corning | 3516 | Utilisées pour les dosages de différenciation |
| Hydroxyde de sodium (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (ou équivalent) | N/A | Utilisé pour interrompre la réaction de l'ALP avant la mesure de l'absorbance ; CORROSIF |
| Sonicateur (sonde / bain ultrasonique) | Branson Ultrasonics | N/A | Utilisé pour la dispersion des nanoparticules avant les tests biologiques |
| Flacons de culture T-75 | Corning | 430641 | Utilisés pour l'expansion des cellules souches |
| TEOS (tétraéthyl orthosilicate) | N/A | N/A | Précurseur de silice pour la synthèse sol-gel du verre bioactif 45S5. INFLAMMABLE |
| Microscope électronique en transmission | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Utilisé pour la caractérisation de la taille et de la morphologie des nanomatériaux |
| Triton X-100 (0,1 % dans le PBS) | N/A | N/A | Utilisé pour la perméabilisation cellulaire avant l'immunofluorescence |
| Solution de bleu de trypan (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | Utilisée pour l'évaluation de la viabilité cellulaire |
| Diffractomètre aux rayons X (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Utilisé pour l'analyse cristallographique des nanoparticules |
Références
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