Cette étude évalue l'expression de miR-21-5p, son association avec la molécule d'adhésion cellulaire 1, ainsi que ses relations avec la migration, la prolifération, l'expression des marqueurs inflammatoires et la survie dans les tissus et lignées cellulaires de cancer du poumon non à petites cellules.
Article de recherche
L'axe miR-21-5p-molécule d'adhésion cellulaire 1 dans la progression et le pronostic du cancer du poumon non à petites cellules
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11 septembre 2026
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Résumé
Résumé
Des preuves indiquent que le miR-21-5p est un régulateur moléculaire important dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC). La molécule d'adhésion cellulaire 1 (CADM1) est un suppresseur tumoral potentiel, mais la relation régulatoire entre le miR-21-5p et CADM1 dans la progression du CPNPC reste incertaine. La PCR quantitative en temps réel par transcription inverse (qRT-PCR) a été utilisée pour détecter l'expression du miR-21-5p et de CADM1 dans les tissus et cellules de CPNPC ; la liaison cible entre le miR-21-5p et CADM1 a été confirmée par un essai rapporteur du gène de la luciférase double ; la capacité de migration cellulaire a été évaluée par l'essai Transwell ; les données clinicopathologiques et l'analyse de survie ont été combinées pour explorer la signification clinique du miR-21-5p ; l'enrichissement fonctionnel des gènes cibles du miR-21-5p a été analysé par bioinformatique. L'expression du miR-21-5p dans les tissus de CPNPC était significativement plus élevée que dans les tissus normaux adjacents, et les patients présentant une forte expression du miR-21-5p avaient une survie globale plus courte. Une expression élevée du miR-21-5p constitue un facteur de risque indépendant pour la survie des patients atteints de CPNPC ; la surexpression du miR-21-5p a favorisé la migration cellulaire dans les cellules de CPNPC et augmenté l'expression des facteurs inflammatoires ; l'essai rapporteur du gène de la luciférase double a confirmé que le miR-21-5p ciblait directement CADM1 ; la surexpression de CADM1 a inhibé la migration cellulaire dans les cellules de CPNPC et réduit l'expression des facteurs inflammatoires ; l'analyse bioinformatique a montré que les gènes cibles du miR-21-5p étaient enrichis dans plusieurs voies de signalisation liées à l'apparition et au développement des tumeurs. Le miR-21-5p favorise la progression du CPNPC en ciblant et en inhibant CADM1 et pourrait servir de biomarqueur pronostique et de cible thérapeutique.
Introduction
Dans le monde entier, le cancer du poumon figure parmi les principales causes de mortalité liée au cancer, avec une incidence en constante augmentation1,2. Chez les populations d'Asie de l'Est, l'incidence et la mortalité du cancer du poumon atteignent respectivement 222,1 et 155,5 pour 100 000 hommes, contre 158,1 et 87,3 pour 100 000 femmes. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente environ 80 % de tous les cancers pulmonaires et comprend trois sous-types histologiques majeurs3. Comparé au cancer du poumon à petites cellules (CPPC), fortement agressif, le CPNPC évolue et métastase plus lentement ; toutefois, la présence de symptômes cliniques précoces peu spécifiques fait que plus de 75 % des patients reçoivent un diagnostic à un stade intermédiaire ou avancé, ce qui contribue à une survie globale à cinq ans persistamment faible4. La tumorigenèse pulmonaire est provoquée par l'activation d'oncogènes et l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeur5, soulignant ainsi le besoin urgent d'élucider les bases moléculaires du CPNPC afin de développer de nouvelles thérapies6.
Les microARN (miARN, de 18 à 25 nucléotides de longueur) assurent la répression post-transcriptionnelle des gènes en se liant à la région non traduite en 3′ (3′-UTR) des ARNm cibles, entraînant une suppression traductionnelle ou une dégradation de l'ARNm7. La biogenèse des miARN commence par la transcription par l'ARN polymérase II, qui produit des transcrits primaires de miARN, ensuite clivés par des enzymes de type RNase III pour former des précurseurs de miARN en forme de boucle (pré-miARN)8. Alors que la plupart des miARN répriment l'expression génique par complémentarité partielle ou complète avec les 3′-UTR des ARNm, certains miARN peuvent stimuler la traduction des ARNm dans des contextes spécifiques du cycle cellulaire9. À ce jour, des centaines de miARN humains ont été identifiés, régulant des processus biologiques fondamentaux tels que la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose10. Auparavant, la détection de miARN exprimés de manière anormale restait techniquement difficile ; l'avènement du séquençage à haut débit a permis un profilage rapide et sans biais des miARN dysrégulés dans les tissus pathologiques11. Ici, nous nous concentrons sur le miR-21-5p, l'un des premiers miARN transcrits par l'ARN polymérase II à avoir été caractérisé, dont les fonctions régulatrices oncogéniques font l'objet d'investigations approfondies12.
Le miR-21-5p est encodé au sein d'un intron du gène TMEM49 et est régulièrement surexprimé dans plusieurs types de tumeurs humaines, notamment les cancers de l'œsophage, colorectaux et pulmonaires13. Les données précliniques existantes sur le CBNP confirment son activité oncogénique : une augmentation du miR-21-5p accélère la prolifération tumorale, la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et les métastases à distance en inhibant des cibles anti-oncogéniques telles que PTEN et PDCD414. Toutefois, les études antérieures se sont principalement concentrées sur les voies de signalisation apoptotiques et prolifératives induites par le miR-21, et peu de travaux ont systématiquement exploré l'axe régulateur miR-21-5p/CADM1 dans le CBNP15. La molécule d'adhésion cellulaire 1 (CADM1) est un suppresseur tumoral bien établi dans les cancers épithéliaux16 ; elle maintient l'adhésion intercellulaire afin d'empêcher le détachement des cellules tumorales et leur dissémination métastatique, et sa diminution est corrélée à un stade tumoral avancé et à un pronostic moins favorable chez les patients atteints de CBNP. Sur le plan mécanistique, CADM1 limite également la signalisation inflammatoire pro-tumorale du facteur nucléaire kappa B (NF-κB), qui favorise la métastase en induisant la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et en remodelant le microenvironnement tumoral17. Malgré la documentation séparée de l'effet oncogénique du miR-21-5p et des propriétés suppresseur tumoral de CADM1, trois lacunes importantes persistent concernant l'axe miR-21-5p/CADM1 dans le CBNP : premièrement, la liaison directe et la répression de CADM1 par le miR-21-5p n'ont pas été validées expérimentalement dans les cellules cancéreuses pulmonaires ; deuxièmement, on ignore si cet axe induit des phénotypes malins via des voies inflammatoires en aval ; troisièmement, la capacité pronostique prédictive des signatures d'expression combinée de miR-21-5p/CADM1 n'a pas encore été évaluée sur des échantillons cliniques de CBNP.
Sur la base de ces questions en suspens, nous proposons une hypothèse mécanistique centrale : la surexpression de miR-21-5p dans le CBNPC lie directement la région 3′-UTR de CADM1 afin de supprimer l'expression de CADM1, ce qui entraîne la dérépression de la signalisation inflammatoire métastatique normalement inhibée par CADM1, et accélère ainsi la migration du CBNPC, conférant un pronostic clinique défavorable. Cette étude vise trois objectifs de recherche prédéfinis : (1) Vérifier le ciblage moléculaire direct de CADM1 par miR-21-5p et évaluer la migration dans des lignées cellulaires de CBNPC A549 et H1299 ; (2) Élucider si la cascade miR-21-5p/CADM1 module le potentiel métastatique par la transduction du signal inflammatoire ; (3) Évaluer la valeur pronostique clinique du profil d'expression miR-21-5p/CADM1 afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et des candidats thérapeutiques pour le CBNPC métastatique.
Protocole
Cette étude rétrospective a été examinée et approuvée par le Comité d'éthique de l'Hôpital de médecine traditionnelle chinoise de Quzhou (numéro d'approbation : 202402208). Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de chaque patient inclus ou de son représentant légal avant le prélèvement des échantillons.
Prélèvement des échantillons
Les tissus tumoraux primaires de CBNPC ont été obtenus chirurgicalement auprès des patients inclus, tandis que leurs tissus pulmonaires normaux adjacents appariés ont été collectés rétrospectivement auprès du Centre national de recherche et d'ingénierie pour la biopsie clinique (ville de Quzhou, province du Zhejiang, Chine). Un total de 157 échantillons de patients atteints de CBNPC inclus consécutivement entre janvier 2019 et décembre 2024 ont été inclus dans cette étude de cohorte. La taille de l'échantillon de 157 paires d'échantillons était justifiée statistiquement d'après des recherches publiées antérieurement sur le pronostic des microARN dans le CBNPC : en supposant une taille d'effet modérée de 0,5, un α = 0,05 et une puissance statistique de 80 %, la taille minimale requise d'échantillon a été calculée à 122 cas. Compte tenu des pertes potentielles d'échantillons, de nécroses tissulaires sévères et de patients perdus de vue pendant le suivi, nous avons inclus consécutivement 157 patients éligibles entre janvier 2019 et décembre 2024 afin de garantir une puissance statistique suffisante. Tous les tissus tumoraux et les tissus pulmonaires normaux adjacents appariés ont été prélevés chez le même patient lors de la résection chirurgicale, formant ainsi des échantillons appariés destinés à des analyses comparatives ultérieures.
Les critères d'inclusion étaient les suivants : (1) Patients confirmés histologiquement comme ayant un CBNP primitif par biopsie postopératoire ; (2) Données complètes de base sur le plan clinique, de stadification histopathologique et de survie à long terme issues d'un suivi prolongé ; (3) Aucune radiothérapie, chimiothérapie ou thérapie ciblée préalable avant le prélèvement tissulaire ; (4) Prélèvements appariés complets de tissus tumoraux et para-tumoraux disponibles.
Les critères d'exclusion étaient les suivants : (1) tumeurs malignes secondaires combinées d'autres organes ; (2) patients perdus de vue moins de 3 mois après la chirurgie ; (3) échantillons présentant une nécrose sévère ou un volume de tissu insuffisant pour la détection moléculaire ultérieure.
Tous les échantillons de tissus frais ont été placés dans de l'azote liquide dans les 15 minutes suivant la résection chirurgicale, transférés dans un congélateur à très basse température et conservés à −80 °C pour l'extraction d'ARN et de protéines. Un suivi clinique a été effectué régulièrement, et la survie globale a été mesurée en mois à compter du diagnostic anatomopathologique jusqu'au décès ou à la date limite du dernier suivi.
Stratification du niveau d'expression de miR-21-5p
Les valeurs d'expression relative de miR-21-5p des 157 patients ont été triées par ordre croissant, et la cohorte a été stratifiée selon un seuil médian d'expression. En raison de plusieurs valeurs identiques autour de la médiane, les patients dont l'expression était inférieure à la médiane ont été assignés au groupe à faible expression (n = 61) ; les patients dont l'expression était égale ou supérieure à la médiane, incluant toutes les observations identiques à la médiane, ont été classés dans le groupe à forte expression (n = 96). Cette règle d'affectation des valeurs identiques avait été prédéfinie avant le regroupement afin de résoudre les mesures médianes en double, et le résultat du regroupement a été vérifié croisément par rapport aux données brutes de quantification par qRT-PCR.
Culture cellulaire
Les lignées cellulaires humaines de CBNP A549 et H1299 ont été obtenues auprès d'un fournisseur commercial (voir Tableau des matériaux). Les cellules A549 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640, et les cellules H1299 ont été cultivées dans un milieu DMEM. Les deux milieux de culture cellulaire ont été enrichis avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (100 µg/mL). Les cellules ont été cultivées dans des conditions standard à 37 °C dans un incubateur humidifié alimenté en 5 % de CO₂.
Un profilage par répétitions courtes en tandem (STR) a été réalisé afin d'authentifier l'identité des lignées cellulaires A549 et H1299 avant tous les expériences fonctionnelles. Un test de contamination par les mycoplasmes a été effectué mensuellement à l'aide d'un kit de détection des mycoplasmes basé sur la PCR, et seules les cellules négatives pour les mycoplasmes ont été utilisées pour les dosages ultérieurs.
Des cellules en phase de croissance logarithmique et présentant une morphologie intacte ont été récoltées pour la transfection transitoire. Un réactif de transfection à base de lipides (voir Tableau des matériaux) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Les tests cellulaires en aval ont été réalisés 50 h après la transfection.
Transfection cellulaire
Pour la transfection, les cellules en phase de croissance logarithmique et présentant une morphologie intacte ont été semées dans des plaques de culture 24 h auparavant afin d'atteindre une confluence de 60 % à 70 %. La transfection a été réalisée à l'aide d'un réactif de transfection à base de lipides (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Quatre groupes expérimentaux ont été utilisés : contrôle négatif du mimique (mimique-NC), mimique de miR-21-5p, contrôle négatif de l'inhibiteur (inhibiteur-NC) et inhibiteur de miR-21-5p. Les séquences nucléotidiques sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1.
L'ARN total a été extrait 50 h après la transfection, et une PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR) a été réalisée afin de mesurer l'expression relative de miR-21-5p et de vérifier l'efficacité de la transfection. Des tests de migration cellulaire ont été effectués 50 h après la transfection. Pour la transfection transitoire, les cellules ont été traitées avec un analogue de miR-21-5p ou un contrôle négatif de l'analogue (mimic-NC) à une concentration finale de 50 nM, tandis que l'inhibiteur de miR-21-5p et le contrôle négatif de l'inhibiteur (inhibitor-NC) ont été introduits à 100 nM. Afin d'éviter des effets perturbateurs attribuables aux différences d'apport en acides nucléiques, la quantité totale d'acides nucléiques transfectés a été maintenue identique dans les quatre groupes de traitement.
La prolifération cellulaire a été évaluée à l'aide du test au kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8). Les cellules transfectées de façon stable ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 3 × 103 cellules par puits, avec six réplicats techniques réalisés pour chaque groupe. À 24, 48 et 72 h après l'ensemencement, 10 µL du réactif CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, suivis d'une incubation à 37 °C pendant 2 h. La prolifération cellulaire a été quantifiée en mesurant l'absorbance à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
Toutes les expériences de transfection transitoire, de CCK-8 et de migration ont été réalisées avec au moins trois réplicats biologiques indépendants, et chaque réplicat biologique comprenait 3 à 6 réplicats techniques comme décrit ci-dessus.
PCR quantitatif en temps réel par transcription inverse
L'ARN total provenant des cellules de CBNPC et des tissus tumoraux cliniques appariés et des tissus normaux adjacents a été isolé à l'aide d'un réactif d'extraction de l'ARN à base de phénol/guanidine (voir Tableau des Matériaux). La pureté et la concentration de l'ARN ont été déterminées par spectrophotométrie ultraviolette ; seuls les échantillons présentant des rapports d'absorbance (OD) 260/280 et OD 260/230 compris entre 1,8 et 2,1 ont été soumis à la transcription inverse. Les séquences des amorces sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1. Le système de transcription inverse contenait 500 ng d'ARN total, 2 µL de tampon de transcription inverse, 1 µL de mélange de dNTP, 0,5 µL de transcriptase inverse, 1 µL d'amorce spécifique en boucle pour les miARN ou d'amorce oligo(dT) pour les ARNm, et de l'eau sans RNase jusqu'à un volume total de 20 µL. Le système d'amplification par qRT-PCR (volume total de 20 µL) comprenait 10 µL de mix maître SYBR Green qPCR, 0,4 µL d'amorce sens (10 µM), 0,4 µL d'amorce antisens (10 µM), 2 µL de matrice d'ADNc diluée et 7,2 µL d'eau sans RNase.
L'ARN messager de CADM1 et de GAPDH a été rétrotranscrit à l'aide d'un kit de rétrotranscription, tandis que le miR-21-5p a été rétrotranscrit à l'aide d'amorces en boucle ascendante et du cel-miR-39 exogène comme témoin d'ajout. Le témoin exogène cel-miR-39 a été ajouté à chaque échantillon d'ARN total immédiatement après l'isolement de l'ARN total et avant la rétrotranscription. En tant que microARN synthétique de C. elegans n'ayant aucune séquence homologue dans les transcrits humains, le cel-miR-39 permet de corriger les variations dues à l'efficacité différentielle d'extraction de l'ARN, à la dégradation de l'ARN et aux variations d'efficacité de la rétrotranscription entre différents échantillons tissulaires cliniques, servant ainsi de témoin de normalisation exogène universel pour la quantification des microARN. La qRT-PCR a été réalisée à l'aide d'un mélange maître contenant un colorant fluorescent se liant à l'ADN, sur un système de PCR en temps réel (voir Tableau des matériaux) : 95 °C pendant 3 min, suivis de 40 cycles à 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 20 s, avec une analyse de la courbe de fusion pour confirmer l'amplification spécifique. Chaque échantillon comprenait trois réplicats biologiques, chacun avec trois réplicats techniques, et l'expression relative a été calculée selon la méthode 2⁻ΔΔCt. Les séquences complètes des amorces pour l'amplification des ARNm de CRP, TNF-α et IL-6 sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1, aux côtés des séquences d'amorces de CADM1, GAPDH et du miR-21-5p.
Mise en place d'une expression stable de miR-21-5p médiée par un lentivirus
Des vecteurs lentiviraux commerciaux LV-miR-21-5p et un témoin vide LV-NC ont été encapsidés dans des cellules 293T. La séquence précurseur de miR-21-5p a été insérée dans un squelette lentiviral portant des gènes de résistance à la puromycine et de GFP rapporteur. Les surnageants lentiviraux ont été recueillis 48 h et 72 h après transfection, concentrés et purifiés pour l'infection cellulaire.
Les cellules A549 et H1299 ont été semées 24 h avant l'infection afin d'atteindre une confluence de 50 à 60 %. Les cellules ont été infectées à un MOI = 10 (A549) et MOI = 15 (H1299) en présence de 5 µg/mL de polybrene pour améliorer l'efficacité de la transfection. Le milieu a été remplacé 24 h après l'infection, puis les cellules ont été cultivées pendant 48 h supplémentaires avant la sélection à la puromycine.
La sélection des cellules stables a été réalisée avec 5 µg/mL de puromycine pendant 10 jours consécutifs ; des cellules témoins non infectées ont été utilisées pour vérifier l'élimination complète des cellules non transduites dans un délai de 7 jours. Des clones uniques positifs pour la GFP ont été isolés et amplifiés afin de générer des lignées cellulaires monoclonales stables, LV-21 et LV-NC.
Pour les essais de complémentation de CADM1, des lentivirus commerciaux d'overexpression de LV-CADM1 et d'interférence ARN de type sh-CADM1 ont été préparés. Quatre groupes expérimentaux ont été établis : LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 et le groupe de complémentation LV-miR-21-5p + LV-CADM1. Les lentivirus CADM1 ont été utilisés à la même MOI et sous les mêmes conditions de sélection à la puromycine que les vecteurs miR-21-5p. Tous les essais de complémentation concernant la prolifération et la migration ont été répétés avec trois réplicats biologiques indépendants.
Validation de la surexpression stable de miR-21-5p
L'ARN total a été extrait à partir de clones cellulaires stables LV-21 et LV-NC récoltés. Une qRT-PCR a été réalisée pour détecter le niveau d'expression relatif de hsa-miR-21-5p en utilisant cel-miR-39 comme référence exogène. Les clones cellulaires présentant une surexpression de miR-21-5p supérieure à 8 fois par rapport au groupe LV-NC ont été conservés pour tous les tests fonctionnels ultérieurs, confirmant ainsi la construction réussie de lignées cellulaires stables surexprimant miR-21-5p.
Dosage double luciférase
Des plasmides rapporteurs de la région 3'-UTR sauvage de CADM1 (WT-CADM1) contenant la séquence de liaison prédite pour le miR-21-5p, ainsi que des plasmides rapporteurs de la région 3'-UTR mutée de CADM1 (MUT-CADM1) avec une région « graine » de liaison mutée, ont été construits. Les cellules A549 ont été ensemencées dans des plaques 24 puits 24 h avant la transfection afin d'atteindre une confluence de 60 à 70 %. Chaque puits a été co-transfecté avec 500 ng de plasmide rapporteur WT ou MUT, 50 nM de mimétique du miR-21-5p ou mimétique-NC, et un plasmide de référence interne exprimant la luciférase Renilla, selon un rapport massique fixe. Après 48 h d'incubation post-transfection, les cellules ont été complètement lysées, et les signaux de luminescence des luciférases Firefly et Renilla ont été détectés séquentiellement à l’aide d’un kit de détection double luciférase. L’activité luciférase relative a été calculée comme le rapport entre la valeur de luminescence Firefly et la valeur de luminescence Renilla. Chaque groupe expérimental comprenait trois réplicats biologiques indépendants, chacun avec trois réplicats techniques, et un test t de Student pour échantillons indépendants à deux groupes a été utilisé pour la comparaison statistique de l’activité luciférase relative entre les groupes mimétique-NC et mimétique du miR-21-5p.
Essai de migration Transwell
Pour l'essai de migration Transwell, les cellules transfectées de manière stable ont été suspendues dans un milieu sans sérum et mises en culture dans les inserts supérieurs à raison de 4 × 104 cellules par puits. Les chambres inférieures ont été remplies de milieu de culture complet supplémenté avec 10 % de FCS afin d'établir un gradient chimiotactique. Après une incubation de 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂, les cellules restantes sur la surface supérieure de la membrane ont été soigneusement éliminées. Les cellules ayant migré vers l'inférieur de la membrane ont été fixées dans du méthanol et colorées au violet de crésyl. La migration a été quantifiée en comptant les cellules présentes dans cinq champs microscopiques choisis aléatoirement par insert. Chaque expérience a été réalisée en trois réplicats biologiques indépendants, chaque réplicat biologique comprenant trois réplicats techniques.
Analyses statistiques
Toutes les expériences in vitro ont été réalisées avec un minimum de trois réplicats biologiques indépendants, chacun accompagné de réplicats techniques correspondants. La distribution des données a d'abord été évaluée à l'aide du test de normalité de Shapiro-Wilk afin de guider l'analyse statistique. Pour les comparaisons appariées entre tissus tumoraux et tissus normaux adjacents, un test t apparié ou un test de Wilcoxon pour échantillons appariés a été utilisé, selon la distribution des données. Les comparaisons entre deux groupes indépendants ont été analysées à l'aide du test t indépendant ou du test U de Mann-Whitney. Les différences entre plusieurs groupes, y compris les expériences de sauvetage, ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'une correction post hoc de Bonferroni, tandis qu'une ANOVA pour mesures répétées a été utilisée pour analyser les jeux de données longitudinaux tels que les tests de prolifération CCK-8 et de cicatrisation des blessures. Les associations entre variables cliniques catégorielles ont été examinées à l'aide du test χ2, et la relation entre l'expression de miR-21-5p et celle de CADM1 a été évaluée par une analyse de corrélation de Pearson. La survie des patients a été analysée à l'aide de courbes de Kaplan-Meier, les comparaisons étant effectuées par le test du log-rank. Les facteurs pronostiques indépendants ont été identifiés par des analyses de régression de Cox univariées et multivariées. La significativité statistique a été définie comme P < 0,05. La régression multivariée de Cox a été ajustée en fonction de l'âge, du sexe, du type histologique, du niveau de miR-21-5p et du statut ganglionnaire (référence : âge ≤ 60 ans, sexe féminin, carcinome épidermoïde, faible niveau de miR-21-5p, ganglions négatifs) ; les résidus de Schoenfeld ont permis de vérifier l'hypothèse de proportionalité des risques, et les variables présentant une valeur P univariée < 0,10 ont été incluses par sélection entrante.
Résultats
Corrélation entre l'expression de miR-21-5p et les caractéristiques clinicopathologiques des patients atteints de CBNPC
Un total de 157 échantillons tumoraux de CBNPC a été réparti en deux groupes selon l'expression de miR-21-5p, faible (n = 61) et élevée (n = 96), en se basant sur les niveaux médians de miR-21-5p. Des analyses par le test du chi-deux n'ont révélé aucune corrélation significative entre l'expression de miR-21-5p et l'âge du patient (χ2 = 1,36, P = 0,2435), le sexe (χ2 = 1,06, P = 0,3032), le type histologique (χ2 = 1,09, P = 0,2965) ou la taille de la tumeur (χ2 = 5,623, P = 0,0601). En revanche, une expression élevée de miR-21-5p était significativement associée à un stade tumoral avancé (χ2 = 16,25, P = 0,00006), à une métastase ganglionnaire positive (χ2 = 12,17, P = 0,00049) et à un stade T plus élevé (χ2 = 4,30, P = 0,117), suggérant que miR-21-5p exerce des effets oncogéniques favorisant la progression du CBNPC (Tableau 1).
Analyse de régression multivariée de Cox à risques proportionnels pour les facteurs pronostiques indépendants du CBNPC
L'analyse de régression multivariée de Cox intégrant l'âge, le sexe, le type histologique, l'expression de la miR-21-5p et la métastase ganglionnaire a révélé qu'une forte expression de la miR-21-5p (rapport de risque [HR] = 3,066 ; intervalle de confiance à 95 % [IC] : 1,412–6,659 ; P = 0,005) et une métastase ganglionnaire positive (HR = 22,295 ; IC à 95 % : 3,039–163,588 ; P = 0,002) constituaient des facteurs de risque pronostiques indépendants défavorables pour la survie globale des patients atteints de CBNPC, tandis que l'âge, le sexe et le sous-type histologique du patient n'avaient aucun impact pronostique indépendant significatif (tous P > 0,05) (Tableau 2).
Caractéristiques d'expression clinique du miR-21-5p et sa corrélation avec CADM1 et les facteurs inflammatoires
La détection par qRT-PCR de tissus tumoraux de CBNP appariés et de tissus normaux adjacents a montré des niveaux relatifs de miR-21-5p significativement élevés dans les tissus cancéreux par rapport aux témoins normaux (Figure 1A, P < 0,001). Les courbes de survie de Kaplan-Meier ont montré que les patients présentant une forte expression du miR-21-5p avaient une survie globale significativement plus faible que ceux ayant une faible expression du miR-21-5p (Figure 1B, P = 0,0027). Les abondances d'ARNm des médiateurs inflammatoires protéine C-réactive (CRP), facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et interleukine-6 (IL-6) étaient toutes fortement augmentées dans les échantillons de CBNP (Figure 1C, P < 0,01, P < 0,001). Une analyse de corrélation de Pearson a révélé une corrélation négative fortement significative entre l'expression du miR-21-5p et celle de l'ARNm de CADM1 dans les échantillons cliniques (r = -0,7773, IC à 95 % : -0,8325 à -0,7076, P < 0,0001, Figure 1D).
Validation fonctionnelle cellulaire du miR-21-5p dans les cellules de CBNPC
La RT-qPCR a confirmé l'efficacité réussie de la transfection du mimétique du miR-21-5p dans les cellules A549 et H1299 (Figure 2A). Les essais Transwell ont montré qu'une surexpression du miR-21-5p augmentait significativement la capacité de migration relative et le nombre de cellules migrantes dans les deux lignées cellulaires (Figure 2B,C). La détection par RT-qPCR de cytokines inflammatoires a révélé une augmentation marquée des niveaux d'ARNm de CRP, TNF-α et IL-6 après la transfection avec le mimétique du miR-21-5p, tandis que le traitement par l'inhibiteur du miR-21-5p inversait cette surexpression (Figure 2D). Des expériences de sauvetage ont confirmé que le mimétique du miR-21-5p supprimait fortement la transcription de CADM1, et que la co-transfection avec le LV-CADM1 restaurait complètement l'expression de l'ARNm de CADM1 dans les cellules A549 et H1299 (Figure 2E,F). Dans leur ensemble, ces données cellulaires ont démontré que le miR-21-5p favorise la migration des cellules de CBNPC et la réponse inflammatoire en réprimant CADM1.
Effets de miR-21-5p sur la prolifération des cellules de CBNP
Les courbes de prolifération au CCK-8 à 24 h, 48 h et 72 h ont montré que la transfection par un mimétique de miR-21-5p augmentait nettement les valeurs d'OD à 450 nm dans les cellules A549 et H1299, tandis que l'inhibiteur de miR-21-5p réduisait significativement la viabilité cellulaire, des différences statistiquement significatives étant observées à 72 h (Figure 3A,B ; P < 0,001). Ces données démontrent que miR-21-5p exerce un effet pro-prolifératif sur les cellules de CBNP.
Validation de CADM1 comme cible directe de miR-21-5p par prédiction bioinformatique et test rapporteur à double luciférase
Trois bases de données en ligne de prédiction de cibles d'ARNi (miRWalk, StarBase, TargetScan) ont été croisées afin de sélectionner les gènes candidats en aval de miR-21-5p, permettant d'obtenir 95 gènes cibles communs (Figure 4A). Une analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) a indiqué que ces gènes candidats étaient principalement enrichis dans des processus biologiques, des composants cellulaires et des fonctions moléculaires liés au métabolisme cellulaire, à la réponse au stress et à la régulation de la transcription (Figure 4B). L'analyse d'enrichissement des voies du Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a révélé en outre un enrichissement marqué dans des cascades de signalisation associées aux tumeurs, notamment les voies de la kinase activée par un mitogène (MAPK) et de Ras (Figure 4C). Le test rapporteur à double luciférase a montré que le mimétique de miR-21-5p supprimait significativement l'activité luciférase relative du rapporteur contenant la région 3'-UTR sauvage de CADM1, tandis qu'aucun effet inhibiteur n'était observé dans le groupe portant la 3'-UTR mutée de CADM1 (Figure 4D, P < 0,01, ns : non significatif), confirmant ainsi la liaison directe entre miR-21-5p et CADM1.
Promotion de phénotypes malins du CBNPC par la suppression de CADM1 dans des expériences de sauvetage
La qRT-PCR a confirmé l'efficacité de transfection du mimétique et de l'inhibiteur de miR-21-5p dans les cellules A549 et H1299 (Figure 5A). La surexpression de CADM1 (LV-CADM1) a réduit les niveaux d'ARNm des facteurs pro-inflammatoires CRP, TNF-α et IL-6, tandis que l'extinction de CADM1 par ARN interférent court (si-CADM1) a fortement augmenté leur expression (Figure 5B). Les essais de migration Transwell ont montré que la transfection par LV-CADM1 supprimait significativement la capacité migratoire des deux lignées cellulaires de CBNPC (Figure 5C,D). La détection de la prolifération par CCK-8 a en outre démontré que l'effet pro-prolifératif induit par LV-21 était entièrement compensé par une co-transfection avec LV-CADM1, tandis que l'accélération de la croissance cellulaire induite par si-CADM1 pouvait être corrigée par l'inhibiteur de miR-21-5p (Figure 5E,F). Dans leur ensemble, ces données de sauvetage ont validé que CADM1 agit comme un médiateur fonctionnel en aval, responsable de la prolifération, de la migration et de l'activation inflammatoire induites par miR-21-5p dans le CBNPC.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les données brutes soutenant les résultats de cette étude sont fournies dans le Fichier supplémentaire 2 et sont disponibles avec l'article publié.
Figure 1 : Profils d'expression de miR-21-5p, des facteurs inflammatoires et de leur corrélation avec CADM1 dans des échantillons cliniques de CBNPC. (A) Expression relative de miR-21-5p dans les tissus pulmonaires normaux et les tissus tumoraux de CBNPC. (B) Courbes de survie globale de Kaplan-Meier des patients atteints de CBNPC stratifiés selon le niveau d'expression de miR-21-5p. (C) Expression relative de l'ARNm des facteurs inflammatoires CRP, TNF-α et IL-6 dans les tissus normaux et les tissus de CBNPC. (D) Nuage de points de corrélation de Pearson montrant la corrélation linéaire négative entre l'expression de miR-21-5p et celle de l'ARNm de CADM1. **P < 0,01, ***P < 0,001. Pour le panneau C : des comparaisons statistiques ont été réalisées entre les tissus tumoraux appariés et les tissus normaux adjacents pour CRP, TNF-α et IL-6 respectivement ; **P < 0,01, ***P < 0,001 indiquent des différences significatives par rapport aux tissus pulmonaires normaux appariés. Tous les panneaux comprennent au moins 3 réplicats biologiques indépendants ; les données de qRT-PCR sont exprimées en moyenne ± écart-type ; un test t apparié a été utilisé pour la comparaison entre groupes ; l'analyse de corrélation par nuage de points a utilisé le test de Pearson. Abréviations : CADM1 = molécule d'adhésion cellulaire 1 ; CI = intervalle de confiance ; CRP = protéine C-réactive ; IL-6 = interleukine-6 ; CBNPC = cancer du poumon non à petites cellules ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Phénotypes cellulaires et expression de CADM1 régulés par miR-21-5p dans les cellules de CPCA A549 et H1299. (A) Détection par qRT-PCR de l'expression de miR-21-5p après transfection par un mimétique. (B) Quantification statistique de la migration cellulaire relative à partir des essais Transwell. (C) Quantification du nombre de cellules migrées par champ microscopique. (D) Expression relative des ARNm de CRP, TNF-α et IL-6 en cas de surexpression ou d'inhibition de miR-21-5p. (E) Expression relative de l'ARNm de CADM1 dans les groupes de sauvetage A549 (NC, mimétique de miR-21-5p, LV-CADM1, mimétique + LV-CADM1). (F) Expression relative de l'ARNm de CADM1 dans les groupes de sauvetage H1299. **P < 0,01, ***P < 0,001. Tous les essais cellulaires ont été répétés trois fois dans des réplicats biologiques indépendants, chacun comprenant trois réplicats techniques ; les barres d'erreur représentent la moyenne ± ÉT ; les comparaisons entre groupes ont utilisé une ANOVA à un facteur avec correction de Bonferroni ; les étiquettes des groupes correspondent strictement aux groupes de transfection décrits dans la section Méthodes. Abréviations : CADM1 = molécule d'adhésion cellulaire 1 ; CRP = protéine C-réactive ; IL-6 = interleukine-6 ; LV = vecteur lentiviral ; NC = contrôle négatif ; CPCA = cancer du poumon non à petites cellules ; qRT-PCR = PCR en temps réel par transcription inverse ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Courbes de prolifération CCK-8 reflétant la viabilité cellulaire après surexpression ou inhibition du miR-21-5p. (A) Courbes d'absorbance OD₄₅₀ en fonction du temps pour les cellules A549 transféctées avec le mimic-NC, le mimique du miR-21-5p, l'inhibiteur-NC ou l'inhibiteur du miR-21-5p. (B) Courbes d'absorbance OD₄₅₀ en fonction du temps pour les cellules H1299 dans les quatre groupes de transfection. ***P < 0,001. Les tests CCK-8 comprenaient six réplicats techniques par groupe répartis sur 3 répétitions biologiques ; les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SD) ; une ANOVA à mesures répétées a été utilisée pour les comparaisons entre les points temporels. Abréviations : CCK-8 = Cell Counting Kit-8 ; NC = contrôle négatif ; OD = densité optique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse bioinformatique et dosage de la luciférase double pour le gène cible CADM1 de miR-21-5p. (A) Diagramme de Venn illustrant les gènes cibles communs de miR-21-5p identifiés par les bases de données de prédiction miRWalk, StarBase et TargetScan. (B) Graphique en bulles de l'analyse d'enrichissement fonctionnel GO pour les gènes cibles intersectés. (C) Graphique en barres des voies de signalisation KEGG les plus enrichies. (D) Activité du rapporteur de luciférase double du fragment 3'-UTR sauvage et muté de CADM1 après surexpression de miR-21-5p. **P < 0,01 ; ns, non significatif. Le panneau D utilise uniquement le 3'-UTR WT-CADM1 et le 3'-UTR MUT-CADM1 co-transfectés avec un mimétique de miR-21-5p ou un mimétique-NC pour la détection par luciférase double ; les étiquettes Contrôle/sur-expression/interférence présentes dans les brouillons initiaux ont été ajustées pour correspondre au regroupement standard WT/MUT dans les figures finales. L'analyse de prédiction cible a utilisé trois bases de données en ligne ; les valeurs d'enrichissement P ont été corrigées par la méthode de correction FDR de Benjamini-Hochberg ; les expériences de luciférase double comprenaient trois réplicats biologiques (trois réplicats techniques chacun) ; les barres d'erreur représentent la moyenne ± écart-type ; test t à deux groupes pour la comparaison statistique. Abréviations : CADM1 = molécule d'adhésion cellulaire 1 ; GO = Ontologie des gènes ; KEGG = Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes ; MUT = mutant ; NC = contrôle négatif ; ns = non significatif ; UTR = région non traduite ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expériences de restauration fonctionnelle confirmant l'axe régulateur miR-21-5p/CADM1 dans les cellules A549 et H1299. (A) Expression relative du miR-21-5p après transfection avec un mimétique ou un inhibiteur. (B) Expression relative des ARNm de CRP, TNF-α et IL-6 dans les groupes LV-CADM1 et si-CADM1. (C) Quantification statistique de la capacité relative de migration sous surexpression de CADM1. (D) Quantification du nombre de cellules migrées par champ microscopique dans les groupes LV-CADM1. (E) Valeurs d'OD₄₅₀ au test CCK-8 des groupes de restauration A549 (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+inhibiteur de miR-21). (F) Valeurs d'OD₄₅₀ au test CCK-8 des groupes de restauration H1299 soumis aux mêmes traitements de transfection. **P < 0,01, ***P < 0,001. Tous les tests de restauration comprenaient trois réplicats biologiques indépendants ; les barres d'erreur indiquent la moyenne ± ÉT, ANOVA à un facteur avec test post-hoc de Bonferroni pour les comparaisons entre plusieurs groupes. Abréviations : CADM1 = molécule d'adhésion cellulaire 1 ; CRP = protéine C-réactive ; IL-6 = interleukine-6 ; LV = vecteur lentiviral ; NC = contrôle négatif ; OD = densité optique ; qRT-PCR = PCR quantitative par transcription inverse ; si = ARN interférent court ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Expression de miR-21-5p | Total | x2 | Valeur P | |||
| Faible | Élevée | |||||
| Âge (années) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1,357 | 0,244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Sexe | Masculin | 42 | 73 | 115 | 1,06 | 0,3032 |
| Féminin | 19 | 23 | 42 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Type histologique | Carcinome épidermoïde | 31 | 41 | 72 | 1,09 | 0,2965 |
| Adénocarcinome | 30 | 55 | 85 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Grade tumoral | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16,25 | 0,00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Métastase ganglionnaire | Négative | 41 | 37 | 78 | 12,17 | 0,00049 |
| Positive | 20 | 59 | 79 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Taille de la tumeur (cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5,623 | 0,0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Stade T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4,295 | 0,117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
Tableau 1 : Association entre l'expression de miR-21-5p et les caractéristiques clinicopathologiques chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules. Les valeurs indiquent le nombre de patients. Les associations ont été évaluées à l'aide du test χ2. Abréviation : NSCLC = cancer du poumon non à petites cellules. Chaque test χ2 a été réalisé pour les variables clinicopathologiques catégorielles ; toutes les analyses ont inclus l'ensemble des 157 échantillons de patients.
| n | P valeur | Risque relatif | Intervalle de confiance à 95 % | |||
| Inférieur | Supérieur | |||||
| Âge (années) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Sexe | Masculin | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Féminin | 42 | |||||
| Type histologique | Carcinome épidermoïde | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Adénocarcinome | 85 | |||||
| Expression de miR-21-5p | Élevée | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| Faible | 61 | |||||
| Métastase ganglionnaire | Négative | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| Positive | 79 | |||||
Tableau 2 : Analyse multivariée de régression de Cox proportionnelle aux risques pour la survie globale chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules. Les valeurs sont des rapports de risques avec des intervalles de confiance à 95 %. Abréviations : CI = intervalle de confiance ; NSCLC = cancer du poumon non à petites cellules. Une régression de Cox multivariée a été réalisée sur l'ensemble des données cliniques de la cohorte ; les HR et les IC à 95 % ont été calculés pour le dépistage pronostique indépendant.
Fichier supplémentaire 1 : Séquences d'oligonucléotides et d'amorces utilisées pour la transfection et la PCR quantitative par transcription inverse. Ce fichier recense le mimétique et l'inhibiteur de miR-21-5p, leurs contrôles négatifs respectifs, ainsi que les amorces pour CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p et cel-miR-39. Toutes les séquences sont indiquées dans le sens 5′–3′. Abréviations : CADM1 = molécule d'adhésion cellulaire 1 ; cel = Caenorhabditis elegans ; GAPDH = déshydrogénase du glycérinaldéhyde-3-phosphate ; hsa = Homo sapiens ; miR = microARN ; PCR = réaction en chaîne par polymérase. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2. Données brutes à l'appui des figures. Ce fichier contient les jeux de données de base et les analyses statistiques utilisées pour produire les figures présentées dans le manuscrit, notamment les caractéristiques cliniques, les analyses d'expression, les données de survie et les résultats statistiques associés. Ces données brutes étayent les résultats rapportés dans le texte principal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cette étude a confirmé de manière systématique une expression élevée de miR-21-5p dans les tissus cliniques de CBNPC, corrélée à une transcription accrue des facteurs inflammatoires, ainsi qu'à une migration cellulaire et une capacité de prolifération renforcées, tandis que des expériences de double luciférase, de qRT-PCR et de sauvetage ont identifié CADM1 comme sa cible fonctionnelle directe ; des prédictions par bioinformatique ont en outre indiqué que les cibles en aval de miR-21-5p étaient enrichies dans les cascades oncogéniques MAPK et Ras, fournissant ainsi des éléments préliminaires suggérant que l'axe miR-21-5p/CADM1 pourrait être impliqué dans des voies de signalisation liées à la progression maligne tumorale.
L'analyse de la cohorte clinique a révélé qu'une forte expression de miR-21-5p était étroitement associée à un stade tumoral avancé, à une métastase ganglionnaire et à une survie globale plus courte. La régression de Cox multivariée a confirmé miR-21-5p comme un facteur pronostique indépendant défavorable, suggérant que miR-21-5p pourrait servir de biomarqueur potentiel pour évaluer le risque de progression et le pronostic de survie des patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
Des tests fonctionnels in vitro ont montré que la surexpression de miR-21-5p favorisait la prolifération, la migration et la réponse inflammatoire des cellules de CBNPC, tandis qu'une surexpression de CADM1 inversait tous ces phénotypes oncogéniques ; la corrélation négative d'expression entre miR-21-5p et CADM1 dans les échantillons de patients, conjuguée aux données cellulaires de sauvetage, a pleinement élucidé le mécanisme régulateur selon lequel miR-21-5p induit les comportements malins du CBNPC en inhibant directement CADM1.
Conformément aux études antérieures rapportant le rôle oncogène de miR-21-5p dans le carcinome pulmonaire, ce travail complète les données de corrélation clinique intactes et apporte une validation complète par expérience de sauvetage afin de confirmer sa fonction favorisant la tumeur ; contrairement aux recherches existantes, qui ne s'intéressent qu'à un seul phénotype de métastase, la présente étude relie simultanément miR-21-5p à la prolifération cellulaire et au microenvironnement inflammatoire tumoral via la cible CADM1, élargissant ainsi le réseau régulateur de miR-21-5p dans le CBNPC.
Sur la base des éléments préliminaires ci-dessus, la détection de l'expression tissulaire de miR-21-5p présente une valeur auxiliaire potentielle pour la stratification du risque et l'évaluation pronostique du CBNPC, et l'axe miR-21-5p/CADM1 pourrait fournir de nouvelles cibles moléculaires candidates pour le développement de stratégies d'intervention anti-progression dans le CBNPC, bien que son efficacité thérapeutique clinique reste à confirmer.
Cette étude présente plusieurs limites. Elle s'est appuyée sur des tests cellulaires in vitro et une seule cohorte clinique rétrospective, sans validation par xénogreffe in vivo ni cohorte externe indépendante. Des tests supplémentaires de prolifération (par exemple, incorporation d'EdU et formation de colonies), ainsi que des analyses d'invasion, d'apoptose et du cycle cellulaire, n'ont pas été réalisés. Des analyses sanguines périphériques pour évaluer le potentiel diagnostique non invasif, une validation au niveau protéique de CADM1, la liste complète des gènes cibles chevauchants et une analyse systématique du réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) n'étaient pas non plus disponibles. Les travaux futurs devraient remédier à ces limitations et examiner plus en détail les régulateurs en amont de miR-21-5p ainsi que la signalisation en aval de CADM1.
Dans leur ensemble, ces résultats fournissent des preuves préliminaires que le miR-21-5p agit comme un microARN oncogénique, accélérant la prolifération, la migration et l'inflammation du CBNPC en ciblant directement CADM1, et que sa forte expression prédit un pronostic défavorable pour la survie des patients.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers ou non financiers pertinents à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Formol tamponné neutre à 10 % | Fisher Scientific (Fisherbrand)™) | SF100-4 (typique) | Fixatif pour tissus ; tissus coupés en tranches &épaisseur <5 mm, fixé à température ambiante pendant 14 à 26 heures |
| Plaque de culture cellulaire 24 puits | Corning | 3526 | Plaque pour la mise en culture de cellules transfectées et la réalisation d'un test de cicatrisation (essai de rayure) |
| Ligne cellulaire A549 | ATCC (ou Centre de ressources de Shanghai) | CCL-185 | Ligne cellulaire humaine de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) (adénocarcinome) |
| Kit d'essai CCK-8 | Dojindo | CK04 | Détection de la prolifération |
| Milieu de culture cellulaire (non spécifié) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Divers (par exemple, RPMI-1640 : 11875093, F-12K : 21127022) | Milieu basal pour les lignées cellulaires de CBNPC ; la composition exacte dépend de la lignée cellulaire utilisée |
| cel-miR-39 (contrôle exogène de type « spike-in ») | GenePharma (Shanghai, Chine) | Personnalisé (par exemple, B010302) | Référence externe pour la normalisation de l'expression des miARN, ajoutée lors de l'isolement de l'ARN |
| CO2 Incubateur (humidifié) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Fournit 37°C, 5 % CO₂2, et humidité saturée pour la culture cellulaire |
| CRP/TNF-ααPaires d'amorces IL-6 | Sangon Biotech | synthèse sur mesure | Séquences complètes dans le fichier supplémentaire 1 |
| Solution de coloration au violet de crésyl | Solarbio | G1062 | Coloration des cellules migrées |
| milieu DMEM | Gibco | 11965092 | Pour la culture de H1299/293T |
| Kit d'essai de double luciférase rapporteur | Promega | E1910 | Détection des séquences 3'UTR de CADM1 WT/MUT |
| miR-39 exogène de C. elegans | Qiagen | spike-in personnalisé | Ajouté après l'isolement de l'ARN pour la normalisation |
| Sérum de veau fœtal (SVF) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Supplément ajouté au milieu de culture à une concentration finale de 10 % pour favoriser la croissance cellulaire |
| Extrémité de pipette fine (par exemple, 10 µL embout | Axygen (Corning) | T-300 | Utilisé pour gratter manuellement une monocouche de cellules afin de créer un "plaie" intervalle |
| GAPDH (contrôle endogène) | Plusieurs fournisseurs (par exemple, Sangon Biotech, RiboBio ; amorces sur mesure) | Personnalisé | gène de référence pour la normalisation de l'ARNm utilisé en qRT-PCR |
| GO/KEGG (annotation clusterProfiler) | Bioconductor | Construction 2026 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v9.5.1 | Tracé & statistiques in vitro |
| Ligne cellulaire H1299 | ATCC (ou centre de ressources de Shanghai) | CRL-5803 | Ligne cellulaire de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) humain dérivée d'une métastase ganglionnaire |
| Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur | Gibco | 10099141 | concentration de travail de 10 % |
| Ligne cellulaire HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID : CVCL_0063 ; profil STR testé mensuellement, détection de mycoplasmes négative |
| Mix de conditionnement de lentivirus | Genecopoeia (ou Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Fournit des plasmides d'emballage (gag/pol, rev, vsv-g) pour la production de lentivirus |
| Vecteur de lentivirus-21 (LV-21) | GeneChem (Shanghai, Chine) ou Genecopoeia | Personnalisé | Vecteur lentiviral contenant le miR-21-5p pour la construction de lignées cellulaires à expression stable |
| Vecteur de lentivirus-NC (LV-NC) | GeneChem (Shanghai, Chine) ou Genecopoeia | Personnalisé | Vecteur lentiviral de contrôle négatif sans insert de miR-21-5p |
| Réactif de transfection lipidique | Thermo Fisher | L3000015 | Pour la transfection transitoire |
| Réactif de transfection Lipofectamine 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 ou L3000008 | Réactif de transfection à base de lipides ; 50 heures après la transfection pour les expériences ultérieures |
| Méthanol | Sinopharm | 67-56-1 | Fixation des cellules |
| Méthanol (fixateur/diluant pour coloration) | Sigma-Aldrich | 34860 | Utilisé comme fixatif ou diluant pour la coloration au violet de crésyl |
| inhibiteur de miR-21-5p/inhibiteur-NC | GenePharma | synthèse sur mesure | Séquences dans le fichier supplémentaire 1 |
| mimique de miR-21-5p/mimique-NC | GenePharma | synthèse sur mesure | Séquences dans le fichier supplémentaire 1 |
| miRDB | Université de Washington | v6.0 | |
| miRWalk | Université de Heidelberg | v3.0 | |
| Centre national d'ingénierie des biopsies | Centre national d'ingénierie des biopsies (Chine) | N/A | Fournisseur institutionnel d'échantillons de tissus de cancer du poumon accompagnés de données cliniques enregistrées et de diagnostic histopathologique |
| Tissu de CBNP (pour culture primaire) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Commande personnalisée | Source du tissu ; cultivé dans un milieu contenant 10 % de SBF 37°C; cellules présentant une bonne morphologie en phase de croissance logarithmique sélectionnées pour la transfection |
| Appareil de PCR | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | Obtenir les produits d'amplification pour la qRT-PCR |
| Pénicilline-streptomycine | Solarbio | P1400 | 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL streptomycine |
| Pipettes (unique & Multicanaux | Eppendorf | Série Recherche Plus | Pour une manipulation précise des liquides dans toutes les expériences |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Final 5 μg/mL pour l'infection par lentivirus |
| Puromycine | InvivoGen | ant-pr-1 | 5 μg/mL pour le criblage de cellules stables |
| Puromycine dihydrochlorure | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen) ; P7255 (Sigma-Aldrich) | Antibiotique de sélection, utilisé à 5 μg/mL pour établir des lignées cellulaires transfectées de manière stable |
| R | Fondation R | v4.2.1 | Package : clusterProfiler, ggplot2 |
| Kit de transcription inverse | Takara | RR047 | RT en boucle-pinceau pour les miARN, oligo(dT) pour les ARNm |
| Tubes EP sans RNase | Axygen (Corning) | MCT-150-C | Tubes sans RNase de 1,5 mL pour le stockage et la manipulation de l'ARN |
| milieu RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Pour la culture de A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | synthèse sur mesure | Séquences dans le fichier supplémentaire 1 |
| si-NC | GenePharma | synthèse sur mesure | Séquences dans le fichier supplémentaire 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | Analyse clinique/régression de Cox |
| SYBR Green qPCR Master Mix | Roche | 4913914001 | amplification par RT-PCR quantitative |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| Réactif d'extraction d'ARN total | Takara | 9109 | Lyse à base de phénol/guanidine |
| Chambre Transwell | Corning (Costar) | 3422 (24 puits, 8.0 µm) | Pour la transfection cellulaire en milieu à température ambiante ; ajout de primers chimiques et incubation pendant 48 h |
| Chambres de migration Transwell | Corning | 3422 | 8 μm taille des pores |
| TRIzol Reagent | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Extraction d'ARN total à partir d'échantillons de tissus ; évaluation de la qualité de l'ARN par les rapports OD260/280 et OD260/230 |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Pour détacher les cellules des vaisseaux de culture avant leur semis dans des plaques de 24 puits |
Références
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- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
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- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
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