Une nouvelle méthode de biopsie à l’échelle permet de collecter des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë provenant de poissons-zèbres vivants. Les résultats montrent une abondance de lymphocytes dans les écailles de poissons de type sauvage (WT), et une augmentation spectaculaire des lymphocytes dans les écailles chez les poissons atteints de LLA (leucémie lymphoblastique aiguë). Cette technique permet une étude peu invasive des lymphocytes épidermiques normaux et malins.
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Article de méthode
Une nouvelle méthode de biopsie à l’échelle pour collecter les lymphocytes malins et non malins du poisson-zèbre
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle puissant pour étudier la lymphopoïèse et les cancers lymphoïdes, puisque le poisson-zèbre et les humains partagent des systèmes immunitaires adaptatifs similaires, incluant les lymphocytes B et T. Plusieurs modèles de leucémie lymphoblastique aiguë à lymphoblastes à lymphocytes D. rerio (T-ALL) sont décrits, y compris des poissons exprimant un MYC humain spécifique aux lymphoblastes (hMYC). Nous avons rapporté que les poissons rag2 :hMYC développent également une leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL), ce qui les rend utiles pour étudier les deux types TOUS les types. Une limitation des modèles ALL poisson-zèbre est qu’il n’existe pas de méthode non létale pour l’échantillonnage en série de ALL. Pour y remédier, nous avons mis au point une nouvelle méthode de « biopsie à l’échelle » visant à collecter TOUTES les cellules de poissons-zèbres vivants. Cependant, les connaissances sur les lymphocytes présents dans les écailles normales du poisson-zèbre sont rares. Ainsi, pour définir les identités normales des lymphocytes épidermiques, nous avons réalisé des biopsies à l’échelle sur des lignées transgéniques marquées par des lymphocytes dépourvues de rag2 :hMYC. Nous avons utilisé la microscopie conventionnelle et la microscopie confocale pour analyser les écailles, révélant une abondance de lymphocytes épidermiques. Nous avons également analysé des écailles de poissons présentant des LAP et des B, qui ont montré une augmentation marquée des lymphocytes dans des feuilles confluentes de cellules ALL sur de nombreuses écailles. Nous avons ensuite utilisé le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour purifier les lymphocytes non malins et TOUS à partir de balances pour des études ex vivo . Les analyses cytométriques et d’expression en flux des cellules ALL provenant d’écailles ou d’autres tissus du même poisson ont montré que l’expression des gènes cellulaires ALL sur les écailles ressemblait à celle des cellules ALL ailleurs. Nous avons également quantifié le nombre de cellules normales T, B, T-ALL et B-ALL pouvant être purifiées par échelle. Dans l’ensemble, la biopsie par écaille offre une technique non létale et peu invasive pour étudier les lymphocytes épidermiques du poisson-zèbre, permettant des études ex vivo , y compris l’analyse d’échantillons malins.
Introduction
La fonction barrière de la peau des mammifères et son rôle dans l’immunité sont établis 1,2,3. Les lymphocytes mammifères contribuent à l’immunité cutanée, avec des lymphocytes T cytotoxiques dans l’épiderme, et des cellules B, T et naturelles tueuses (NK) présentes dans lederme 1,3,4,5. Les poissons-zèbres possèdent ces lymphocytes, avec des immunoglobulines de surface, des récepteurs des lymphocytes T, des récepteurs du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC), des cytokines et leurs récepteurs, ainsi que d’autres molécules immunitaires, partageant ainsi la plupart des caractéristiques immunologiques desmammifères 6,7,8,9. Des études récentes sur la peau et les écailles du poisson-zèbre ont révélé diverses populations de lymphocytes cutanés, dont les cellules T et Bépithéliales 10,11, ainsi qu’un réseau lymphoïde facilitant le trafic des cellules T et la surveillanceantigénique 12. Les similitudes entre les lymphocytes des poissons téléostéens et des mammifères font de D. rerio un modèle in vivo puissant pour étudier la lymphopoïèse, la fonction lymphocytaire et les maladies lymphoïdes, y compris la leucémie lymphoblastique aiguë (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.
Nos travaux antérieurs ont montré que la lignée T et B ALL (T-ALL, B-ALL) provient toutes deux du poisson-zèbre transgénique rag2 :hMYC, ce qui rend cette lignée utile pour étudier les deux typesALL 13,15,21,22. Une limitation majeure des modèles ALL de D. rerio, en particulier dans les études d’expression longitudinale ou les études de dépistage de drogues, est l’absence de méthodes pour collecter des échantillons ALL en série sur des animaux individuels. Les méthodes précédentes, telles que la prélèvement de sang rétro-orbitale, sont techniquement complexes en raison de la petite taille de D. rerio, ce qui rend l’extraction sérielle de sang difficile23. Ainsi, la plupart des chercheurs euthanasient le poisson-zèbre pour obtenir les cellules ALL. Cela a été une pratique courante en laboratoire et pour la plupart des acteurs du terrain, mais cela empêche la possibilité de réaliser des expériences longitudinales sur des animaux vivants. Pour surmonter cela, nous avons récemment décrit des lymphocytes épithéliaux T et B dans des écailles de poisson-zèbre collectées à l’aide d’une stratégie de biopsie non létalesur une échelle 10. Une autre étude récente a démontré un réservoir de cellules T à la surface ou près de la surface du poisson-zèbre, entre les écaillesadjacentes 12. D. rerio abrite des centaines d’écailles, qui se régénèrent rapidement quelques jours seulement après leur retrait24. Ensemble, ces résultats et caractéristiques indiquent que les écailles du poisson-zèbre sont une source de lymphocytes qui ne nécessitent pas d’euthanasie, permettant des études longitudinales chez les poissons vivants.
Ici, nous décrivons une méthode de biopsie à échelle pour collecter des lymphocytes épidermiques de poisson-zèbre chez des poissons présentant des marqueurs fluorophores spécifiques aux lymphocytes, avec ou sans ALL. Pour étudier les cellules de la lignée T, nous avons utilisé des poissons bien établis lck :GFP et une lignée similaire lck :mCherry ; toutes deux étiquetent les cellules T et T-ALL10, 13, 15, 20. Pour étudier les cellules de la lignée B, nous avons utilisé des poissons transgéniques cd79a :GFP et cd79b :GFP avec des cellules B et B-ALL marquéesfluorescentement 10,13,17. Chacune de ces lignées permet la visualisation par microscopie fluorescente et la purification cellulaire par cytométrie enflux 13. Nous avons examiné les écailles après biopsie, généré des images haute résolution des lymphocytes dans des écailles, identifié l’expression génique des lymphocytes épidermiques par qRT-PCR, la comparant à celle des lymphocytes provenant d’autres tissus lymphoïdes du même poisson, et quantifiant les lymphocytes par échelle par cytométrie de flux et tri cellulaire activé par fluorescence. En résumé, le protocole décrit une méthode simple et pratique pour obtenir des lymphocytes à partir de poissons-zèbres vivants, incluant l’échantillonnage longitudinal d’animaux individuels à travers plusieurs moments dans une séquence expérimentale. Cette méthode vise à étudier la biologie des lymphocytes du poisson-zèbre, la progression de la leucémie, les réponses aux médicaments ou d’autres plans expérimentaux longitudinaux nécessitant des échantillonnages répétés sur des poissons zèbres individuels. Nous avons développé le protocole en utilisant des poissons-zèbres transgéniques adultes avec des populations de lymphocytes marquées fluorescentement et l’avons validé pour des applications en aval, notamment la microscopie à fluorescence, la cytométrie en flux/tri cellulaire activé par fluorescence, les analyses d’expression ARN et d’autres études ex vivo nécessitant des lymphocytes viables.
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Protocole
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation animale du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (protocoles 24-028-EAH et 25-068-CHACUN). Ce protocole propose une approche visant à isoler et analyser les lymphocytes normaux et/ou malins des écailles de poissons-zèbres vivants, avec des détails sur l’objectif, l’exécution et les principes sous-jacents à ces procédures.
ATTENTION : MS-222 est un anesthésique chimique dangereux et doit être manipulé avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, tel que des gants de laboratoire, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Éliminer les solutions MS-222 conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets chimiques. Faites preuve de prudence lorsque vous manipulez des aiguilles et des pinces pour éviter les blessures par coups de poisseau. Considérer tous les échantillons biologiques potentiellement bio-dangereux et éliminer les déchets conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité.
1. Préparation des supports de tri
- Compléter 1× solution de milieu RPMI 1640 avec 1 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine.
REMARQUE : Le milieu RPMI 1640 maintient la viabilité des lymphocytes ex vivo. Le RPMI 1640 peut être remplacé par un PBS de 0,9×. Le sérum bovin fœtal (FBS) fournit des facteurs de croissance pour favoriser la viabilité cellulaire. La pénicilline et la streptomycine limitent la contamination bactérienne. - Des milieux aliquotes dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL en volumes de 500 μL, chaque tube étant destiné à des échelles de 10 à 20 secondes. Maintenez les tubes de tri sur la glace.
2. Anesthésie du poisson-zèbre, dépistage par microscopie à fluorescence et imagerie
- Anesthésiez D. rerio avec un méthanassulfonate de tricaïne tampon (MS-222) préparé selon les directives institutionnelles de soins aux animaux en utilisant de l’eau du système piscicole.
- Une fois sédaté, placez délicatement le poisson dans une cuve de culture cellulaire contenant suffisamment d’eau du système (plus 0,02 % de MS-222) pour maintenir l’humidité lors de la manipulation ultérieure.
- Examinez et imagez les poissons anesthésiés à l’aide d’un microscope épifluorescent pour détecter la fluorescence du ou des transgènes. Cette étape permet d’identifier les écailles fluorescentes pour la biopsie.
REMARQUE : Les lignées dépourvues de transgènes fluorescents peuvent être observées par microscopie optique standard. - Utilisez la fluorescence pour identifier les lymphocytes T (lck : GFP ou lck : mPoissons cerise) ou T-ALL (rag2 :hMYC + lck :GFP ou lck :mPoissons cerise). Les cellules de la lignée T sont vivement fluorescentes dans ces lignées ; Les cellules B-ALL sont faiblement fluorescentes dans les fonds lck :GFP et lck :mCherry 13,15,21.
- Criblez les poissons marqués cd79a :GFP ou cd79b :GFP (avec ou sans rag2 :hMYC) pour les cellules B épidermiques et/ou B-ALL, en utilisant la GFP pour sélectionner les écailles à biopsie.
- Entraînez-vous à positionner le poisson-zèbre et à ajuster les réglages du microscope avant la biopsie, si l’imagerie est souhaitée
REMARQUE : L’imagerie et la biopsie nécessitent 5 à 7 minutes de sédation via un MS-222 à 0,02 %. Surveillez les mouvements operculaires en continu. Si le mouvement opérculaire ralentit fortement ou s’arrête, transférez immédiatement le poisson dans une eau sans anesthésie et interrompez la biopsie. Réappliquer ~50 à 100 μL d’eau de poisson contenant un anesthésique sur la peau, l’opercule et les branchies toutes les 1 à 2 minutes lors de l’imagerie et de la biopsie afin de maintenir l’humidité de surface.
3. Collecte et préparation des écailles
- Pour positionner le poisson en vue de la biopsie, placez-le sur le côté dans un plat de culture cellulaire.
- Pour éviter que le poisson ne glisse pendant la biopsie, utilisez une éponge humide avec une découpe linéaire ou en V et placez-la dans le plat de culture cellulaire pour bercer le poisson.
- Sinon, assurez-vous que le niveau d’eau du système couvre à peine le fond de la cuvette de culture cellulaire (suffisamment pour maintenir la surface humide) afin de permettre la tension de surface à stabiliser le poisson.
- Appliquez périodiquement ~50 à 100 μL de MS-222 à 0,02 % préparé dans de l’eau du système sur l’opercule et les branchies pour maintenir l’humidité et maintenir l’anesthésie lors de l’imagerie et de la biopsie.
- Réaliser une biopsie à l’aide de la microscopie par épifluorescence pour sélectionner des écailles hautement fluorescentes enrichies en lymphocytes ou en cellules ALL.
- Collectez 10 à 20 écailles adjacentes d’une seule région très fluorescente, de préférence à l’intérieur de la première ou deuxième bande pigmentée horizontale.
REMARQUE : Une seule échelle suffit généralement pour l’imagerie. Une collection de 10 à 20 écailles permet généralement de produire >1 000 lymphocytes provenant de poissons WT et est recommandée pour des analyses en aval telles que la cytométrie en flux et la qRT-PCR. - Main dominante (aiguille) : Utilisez une aiguille de seringue de calibre 31, placez doucement la pointe de l’aiguille sous le bord postérieur d’une balance, puis basculez-la vers l’avant (c’est-à-dire céphalée). Utilisez une aiguille stérile différente pour chaque poisson. Pinces nettoyantes entre les poissons ; Stériliser si les procédures institutionnelles l’exigent.
REMARQUE : Il vaut mieux élever la balance avec une aiguille que d’utiliser uniquement des pinces, car elle soulève la balance pour minimiser le grattage de surface. Cela garantit que la couche épidermique délicate sous la coche reste adhérente à la surface de l’écaille, ce qui est essentiel pour maximiser le rendement cellulaire. - Main non dominante (pinces) : Tenant la balance en position inclinée vers l’avant avec l’aiguille, saisir la surface externe rigide de la balance avec une pince. D’un mouvement fluide, retirez la balance de sa poche.
REMARQUE : Des saignements mineurs peuvent survenir aux sites d’extraction de coprice, qui sont généralement auto-limités. - En cas de saignement excessif, appliquez une pression douce avec des pinces et rincez brièvement avec 0,02 % de MS-222 dans l’eau du système.
REMARQUE : L’hémostasie peut être atteinte en quelques secondes avant de passer à l’échelle suivante. - Pour biopsier plusieurs écailles, il faut prélever 10 à 20 écailles par poisson, en retirant les écailles adjacentes d’une région contiguë en une bande pigmentée horizontale, plutôt que sur plusieurs régions du corps ou les deux côtés de l’animal.
- Pincez les écailles individuellement de manière séquentielle et maintenez-les sur les extrémités des pinces pendant la collecte, avec la surface médiale de l’échelle vers le haut.
- Pour éviter l’interférence des écailles accumulées avec le retrait ultérieur, basculez d’abord chaque écaille vers l’avant puis saisissez-la par son bord postérieur. Transférez les balances vers un tube contenant un milieu de tri après que toutes les 5 balances ont été collectées, ou chaque fois que des balances supplémentaires ne peuvent pas être maintenues en toute sécurité sur les pointes des pinces.
- Après la collecte des balances, traitez les échantillons aussi rapidement que possible. Transférez immédiatement les écailles des pinces vers des tubes de 1,5 mL contenant 500 μL de milieu de tri froid sur glace pour préserver la viabilité cellulaire. Décontaminez les pinces entre poissons à 70 % d’éthanol avant de prélever les échantillons suivants. Traiter les écailles de chaque poisson dans des tubes séparés tout au long de la collecte, de la dissociation et pour les analyses en aval.
- Après la collecte des écailles, transférez immédiatement les poissons dans un bassin de récupération avec de l’eau douce du système sans MS-222.
- Surveillez les mouvements operculaires et le comportement de nage jusqu’à ce que la respiration et la posture normales soient rétablies. Observez le site de la biopsie pour détecter des saignements persistants ou des signes de détresse avant de remettre le poisson dans le système de recirculation.
- Ramenez le poisson dans son bac d’origine après l’équilibre normal et la reprise de la baignade.
4. Dissociation cellulaire et filtrage
- Vérifiez les écailles au bas du tube. Les écailles sont facilement visibles à l’œil nu avant la dissociation. Dissociez les écailles à l’aide d’un homogénéisateur de pilon microtubulaire en plastique stérile en appliquant une pression manuelle douce et contrôlée pendant 30 à 60 secondes.
- Utilisez un mouvement lent de rotation et de haut en bas pour libérer les cellules épidermiques tout en évitant un cisaillement excessif des écailles.
- Continuez la dissociation jusqu’à ce que les médias de tri deviennent visiblement troubles.
REMARQUE : Le succès de la procédure est indiqué par le fait que le milieu devient trouble, indiquant une forte concentration de cellules libérées en suspension. - Faites passer des échantillons homogénéisés à travers un filtre en maille nylon de 35 μm pour éliminer les débris et générer des suspensions unicellulaires pour la cytométrie en flux et le tri cellulaire activé par fluorescence.
- Si des agrégats cellulaires visibles sont présents après la filtration initiale, on passe l’échantillon à nouveau dans un filtre à maille de 35 μm immédiatement avant l’analyse cytométrique en flux. Répétez la filtration au maximum deux fois pour minimiser la perte cellulaire.
5. Analyse cytométrique en flux
- Analysez les échantillons par cytométrie en flux.
REMARQUE : La cytométrie en flux peut être réalisée avant la purification cellulaire activée par fluorescence ou l’extraction d’ARN pour évaluer la composition de l’échantillon. - Analysez les suspensions monocellulaires à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser de 488 nm pour la détection de GFP et d’un laser de 561 nm pour la détection de mCherry.
- Excluez les débris à l’aide des paramètres de diffusion directe (FSC) et de dispersion latérale (SSC). Identifier les lymphocytes à l’aide de la porte lymphocytairedécrite précédemment 10,13,21.
- Excluez les agrégats cellulaires via des paramètres de gating de singlets (c’est-à-dire la zone SSC [SSC-A] versus la hauteur SSC [SSC-H]).
- Évaluer la viabilité cellulaire à l’aide de propidium iodure (PI) ou d’un colorant vivant/mort équivalent. Excluez les cellules PI-positives des analyses et procédures de tri ultérieures.
- Établir des portes de fluorescence à l’aide de témoins poisson-zèbre non transgéniques et de témoins transgéniques fluorescents transgéniques monocolore. Définissez les populations GFP-positives et mCherry-positives par rapport aux témoins négatifs.
- Exportez les fichiers standards de cytométrie en flux (FCS) et analysez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en écoulement.
6. Tri cellulaire activé par fluorescence
- Pour trier les cellules, utilisez un tri cellulaire activé par fluorescence équipé de lasers 488 nm et/ou 561 nm pour la détection GFP et mCherry.
- Des lymphocytes à gate séquentielle (FSC/SSC), des singlets (SSC-A versus SSC-H) et des cellules viables (PI-négatives) avant le tri par fluorescence.
- Définir les populations deGFP lo, GFPhi et mCherry-positives à l’aide de portes de fluorescence établies à partir d’échantillons témoins négatifs.
- Triez les populations deGFP lo, GFPhi et mCherry-positives dans des tubes de collecte contenant un milieu de tri refroidi.
REMARQUE : Dans ce travail avec la lignée lck :GFP, les cellules de GFP élevée (GFP hi) et de cellules GFP basse (GFP lo) sont des lignées lymphocytaires distinctes, comme décritprécédemment 10,13,15,21. - Maintenir les échantillons triés sur la glace et passer immédiatement aux applications en aval, telles que l’isolement de l’ARN.
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Résultats
En suivant les étapes ci-dessus, nous avons anesthésé et dépisté les poissons-zèbres adultes pour détecter des lymphocytes fluorescents ou LAL par microscopie. Les poissons de type sauvage ( WT) lck :GFP ont présenté une fluorescence principalement dans la région thymique, tandis que les poissons cd79b :GFP ont montré une fluorescence dans la région tête/branchie, cohérente avec les observationsprécédentes 10 (Figure 1A
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode de biopsie à l’échelle non létale pour collecter les lymphocytes épidermiques du poisson zèbre, incluant à la fois les lymphocytes non malins et les cellules de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les poissons-zèbres sont des modèles bien établis pour la lymphopoïèse et les cancers lymphoïdes, mais la plupart des approches pour obtenir des lymphocytes nécessitent l’euthanasie et des dissections tissulaires, empêchant les études longitudinales sur des ani...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financiers.
Remerciements
Nous remercions Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., et Brashé Wood pour leurs contributions à ce projet. Les études ont été soutenues par le programme pilote de subventions du Centre de cancérologie Stephenson de l’OUHSC, le Centre d’Oklahoma pour la recherche sur les cellules souches adultes (OCASCR), les programmes Science d’équipe et subventions d’amorçage de la Fondation Presbyterian Health, ainsi que la Fondation familiale W.J. Jones. Le FACS du Noyau de recherche en biologie moléculaire et cytométrie du Centre de cancérologie Stephenson de l’OUHSC a été financé par la subvention de soutien du Centre de Cancer du NCI P30 CA225520. Cette étude a été en partie soutenue par des fonds de l’American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens est boursière du programme « STRONG » post-baccalauréat de l’ACS.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs & Consommables: | |||
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Agent anesthésique |
| RPMI 1640 medium | ThermoFisher | 11875093 | Média pour la viabilité des lymphocytes |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pour la viabilité cellulaire |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | Limiter la contamination bactérienne |
| 70% ethanol | ThermoScientific | T038181000 | Pour stériliser les forceps |
| CellPro 1x PBS | VWR | 104027-280 | Diluer à 0,9x avec de l'eau stérile |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MMP | Discrimination cellules vivantes/mortes pour flux/FACS |
| Cut Goods Misc-Pn; Size: 12 x 12 IN. 35um filter paper Lab Pak 03-35/16 | Sefar | Pour le tri cellulaire Référence: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating malignant and non-malignant b cells from lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019). | |
| Alternative au papier filtre: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-One | Greiner | 89508-342 | Pour le tri cellulaire |
| Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1,5 ml | Eppendorf® | 20901-551 | tube microcentrifugé pour le tri cellulaire |
| UltiCare VetRx U-100 Insulin Syringes 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit Marking | UltiCare | 9436 | Pour les biopsies à l'échelle |
| 100 x 25 mm Deep Petri Dish | USA Scientific | 8609-0625 | Pour les biopsies à l'échelle |
| Bel-Art® Disposable Pestles | Bel-Art® | BAF199230001 | Pour la dissociation des écailles |
| E-Z Pik 6-Piece Tweezer Set | Aven | 18480EZ | Pour les biopsies à l'échelle |
| Corning® microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25 | Pour l'imagerie |
| Cover glasses | Sigma-Aldrich | C8181 | Pour l'imagerie |
| SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, with DAPI | ThermoFisher | S36920 | Pour monter les écailles sur lame |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Pour l'extraction d'ARN |
| Équipement: | |||
| Nikon AZ100 microscope and DS-Qi1MC camera | Nikon | Microscope à fluorescence & caméra | |
| CFX96 Touch-PCR System | Bio-Rad | 3600037 | |
| CytoFLEX | Beckman-Coulter | Analyses de cytométrie en flux | |
| Leica SP8 | Leica | Microscope confocal | |
| Logiciel: | |||
| Kaluza Analysis software version 2.1 | Beckman-Coulter | Analyses de cytométrie en flux Référence: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads | |
| LAS-X software version 3.7.4.23463 | Leica | Microscope confocal Référence: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
Références
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Réimpressions et autorisations
