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Dissection d'Aedes albopictus et extraction d'ARN total à partir de tissus post-dissection

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DOI :

10.3791/72811

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30 octobre 2026

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1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour disséquer le tube digestif moyen, les ovaires et les glandes salivaires d'Aedes albopictus, suivi de l'extraction d'ARN total afin de permettre la caractérisation moléculaire des tissus vecteurs dans les études sur la transmission des virus transmis par les moustiques.

Résumé

En juillet 2025, à Foshan, dans la province du Guangdong, en Chine, une épidémie de dengue et de chikungunya s'est produite. Ae. albopictus est un vecteur majeur de ces virus. Ce protocole décrit une méthode simple et standardisée pour disséquer l'intestin moyen, les glandes salivaires et les ovaires d'Ae. albopictus et extraire l'ARN total à partir des tissus disséqués. Des moustiques femelles âgés de trois jours et n'ayant pas ingéré de sang ont été anesthésiés par congélation à −20 °C pendant 2 min, après quoi les tissus ciblés ont été disséqués. L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN tissulaire, quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume et utilisé pour une analyse par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative (RT-qPCR). Les résultats montrent que la méthode de dissection permet une séparation rapide et complète des tissus, et que l'ARN provenant des tissus séparés peut atteindre une pureté relativement élevée. La RT-qPCR a mis en évidence les profils d'expression et la stabilité relative de trois gènes de référence (GAPDH, β-actin et RPS6). La méthode est simple, validée et fournit un soutien technique standardisé pour les recherches liées à Ae. albopictus.

Introduction

Aedes albopictus (Ae. albopictus) est un vecteur de plusieurs agents pathogènes, notamment le virus de la dengue (DENV) et le virus du chikungunya (CHIKV)1,2,3. Il est largement réparti et a provoqué des flambées de maladies transmises par les moustiques dans de nombreuses régions4,5. La capacité de Ae. albopictus à transmettre des agents pathogènes, appelée compétence vectorielle, varie selon les populations et est liée à une expression génique spécifique dans les intestins moyens, les ovaires et les glandes salivaires6. Comprendre la structure de ces tissus et extraire de l'ARN de haute qualité sont essentiels pour étudier la réplication, la dissémination et la transmission des virus transmis par les vecteurs7.

La détection de l'expression relative des gènes par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) dépend d'une dissection précise des tissus de Ae. albopictus et de l'extraction d'ARN de haute qualité8,9. À ce jour, les protocoles vidéo publiés pour la dissection du tube digestif moyen, des ovaires et des glandes salivaires se sont principalement concentrés sur Aedes aegypti10. Ce protocole décrit donc la dissection du tube digestif moyen, des ovaires et des glandes salivaires de Ae. albopictus, au cours de laquelle les tissus dissecés sont placés directement dans des tubes de broyage contenant une solution de préservation de l'ARN, évitant ainsi les étapes de transfert des tissus et minimisant les pertes lors du transfert. L'ARN total est extrait des tissus dissecés selon une méthode par colonne, qui nécessite moins d'étapes de manipulation et moins de temps que la méthode classique au TRIzol11. Cette extraction fournit généralement entre 0,1 et 0,3 µg d'ARN total à partir des glandes salivaires de cinq spécimens de Ae. albopictus, avec des rapports A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0, répondant aux critères de pureté requis pour les analyses RT-qPCR ultérieures. Une RT-qPCR est réalisée afin de mesurer l'expression de trois gènes de référence dans différents tissus de Ae. albopictus, permettant ainsi d'évaluer la qualité de l'ARN extrait de chaque tissu.

Il convient de noter que ce protocole a été validé uniquement pour le tube digestif moyen, les ovaires et les glandes salivaires de femelles Ae. albopictus âgées de 3 jours et n'ayant pas ingéré de sang, et qu'il n'est pas adapté à l'extraction d'ARN à partir du corps gras. L'obtention de tissus intacts et individuels constitue la base pour les analyses ultérieures. Grâce à la dissection systématique des tissus de Ae. albopictus et à l'extraction d'ARN de haute qualité, ce protocole offre un soutien technique pour la détection ultérieure de l'expression génique, l'évaluation du potentiel vectoriel au niveau des populations et le contrôle de la transmission des arbovirus.

Protocole

Cette étude a utilisé uniquement des moustiques  Ae. albopictus élevés en laboratoire. Par conséquent, une approbation éthique institutionnelle n’était pas requise pour cette étude. La souche de  Ae. albopictus utilisée dans cette expérience a été fournie par le laboratoire clé pour la prévention et le contrôle des maladies parasitaires de la Commission nationale de la santé de Chine (Jiangsu). Cette colonie a été initialement collectée dans la ville de Wuxi dans les années 1980 et est maintenue depuis dans l’insectarium de l’ Institut de Jiangsu des maladies parasitaires en conditions standard. La colonie de moustiques est hébergée dans une chambre climatique artificielle à 25 °C ± 1 °C, 75 % ± 5 % d’humidité relative, avec un photopériode de 10 h de lumière et 14 h d’obscurité. Les larves sont élevées dans de l’eau ultrapure et nourries avec un mélange de poudre de foie de porc et d’extrait de levure (Shanghai Brewery) dans un rapport de 2:1. Les moustiques adultes sont maintenus avec une solution de glucose à 5 %. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation des solutions
    1. Préparation du tampon PBS 1x : Peser 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, et 0,24 g de KH2PO4. Dissoudre dans 800 mL d'eau ultrapure sous agitation. Ajuster le pH à 7,4. Compléter jusqu'au volume final de 1 L. Stériliser en autoclave à 121 °C pendant 20 min.
    2. Préparation de la solution de DEPC : Ajouter 1 mL de solution mère de DEPC à 1 L d'eau ultrapure. Agiter vigoureusement au moyen d'un agitateur magnétique pendant 12 à 16 heures. Stériliser en autoclave à 121 °C pendant 20 min.
      ATTENTION : Le DEPC est hautement toxique et cancérigène. Portez des gants et des lunettes de protection, et manipulez-le sous une hotte aspirante.
      REMARQUE : Recouvrir le bécher avec du papier d'aluminium pendant l'agitation vigoureuse. Aliquoter la solution de DEPC et conserver à -20 °C pendant jusqu'à 6 mois.
  2. Préparation des consommables
    1. Stériliser les outils de dissection : Placer les aiguilles de dissection de 1 mm et les pinces à pointe fine dans un récipient en aluminium et stériliser au autoclave à 121 °C pendant 20 min.
    2. Préparer des tubes de broyage de 2 mL contenant des billes de silice de 0,5 à 1,0 mm. Placer dans un récipient en aluminium et stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 20 min.
    3. Ajouter 200 µL de solution de conservation de l'ARN fournie avec le kit dans chaque tube de broyage.
      REMARQUE : La qualité de l'ARN dans les tissus diminue considérablement dans la minute suivant leur prélèvement chez l'organisme. Préparer à l'avance les tubes de broyage contenant la solution de préservation.

2. Collecte d'Ae. albopictus

REMARQUE : Portez des blouses blanches de laboratoire et des gants. Ne portez pas de vêtements foncés, car les couleurs sombres attirent les moustiques.

  1. Fermez toutes les portes, fenêtres et systèmes de ventilation de la pièce contenant la cage à moustiques afin d'éviter toute évasion de Ae. albopictus.
  2. Activez l'aspirateur électrique et insérez-le dans la cage à moustiques. Orientez l'aspirateur vers les Ae. albopictus en repos sur les parois intérieures de la cage et collectez les moustiques.
  3. Gardez l'aspirateur en marche tout en le retirant lentement de la cage. Fermez immédiatement la cage et refermez le couvercle de l'aspirateur.
  4. Retirez la chambre de collecte et placez-la à -20 °C pendant 2 min pour l'immobilisation au froid des Ae. albopictus.
  5. Placez un plat en verre de 10 cm sur de la glace pour le pré-refroidir. Transférez les Ae. albopictus immobilisés de la chambre de collecte vers le plat en verre.
    NOTE : Contrôlez strictement la durée d'immobilisation au froid afin d'éviter tout dommage tissulaire.

3. Identification des femelles Ae. albopictus avant la dissection

  1. Sélectionner des spécimens morphologiquement intacts et anesthésiés au froid de Ae. albopictus dans la coupelle en verre et les transférer sur une lame de microscope. Observer au stéréomicroscope à un grossissement de 80x.
  2. Identifier la bande longitudinale blanche sur le mésanotum.
  3. Confirmer la présence de bandes blanches à la base des segments tarsiens et à la base des tergites abdominaux II-VI12.
  4. Examiner les antennes à un grossissement de 80x. Différencier les antennes filiformes (femelle) des antennes plumées (mâle) afin d'identifier les femelles.

4. Dissection abdominale de Ae. albopictus

  1. Déposer trois gouttes de PBS 1x stérile de gauche à droite sur une lame de verre stérilisée, chaque goutte ayant un volume d'environ 20 µL et espacée d'environ 5 mm.
    NOTE : Les gouttes de PBS doivent être suffisamment grandes pour immerger entièrement l'Ae. albopictus.
  2. Utiliser une pince fine pour saisir les ailes de l'Ae. albopictus et placer le moustique dans la goutte de PBS la plus à gauche.
  3. Positionner l'Ae. albopictus avec la face ventrale vers le haut. Tenir une aiguille de dissection de la main gauche et appuyer sur le deuxième segment abdominal pour immobiliser l'Ae. albopictus.
  4. De la main droite, insérer une aiguille de dissection de 1 mm au milieu du sixième segment abdominal. Effectuer une incision transversale en forme de demi-cercle pour ouvrir la cavité abdominale.
  5. Déplacer l’aiguille de dissection tenue de la main droite d’environ 2 mm vers l’arrière et appuyer sur la région médiane des segments abdominaux VI–VIII afin de stabiliser l’abdomen.
    NOTE : Les ovaires sont situés dorsalement dans les segments abdominaux II à VI. Ne pas déplacer l’aiguille de manière aléatoire lors de l’appui sur les segments VI à VIII afin d’éviter d’endommager la morphologie intacte des ovaires.
  6. De la main gauche, saisir le deuxième segment abdominal avec l’aiguille de dissection et tirer doucement vers l’extérieur pour séparer l’abdomen au niveau du sixième segment. Lors de cette séparation, le préventricule, le mésentéron et les tubes de Malpighi seront entièrement exposés.
    NOTE : Les tubes de Malpighi sont blancs et fins. Le mésentéron est semi-transparent et fusiforme.
  7. Séparer le mésentéron du préventricule et du postventricule. Rincer le mésentéron deux fois dans la goutte centrale de PBS.
  8. Le transférer dans un tube de broyage contenant 200 µL de solution de conservation d’ARN fournie dans le kit commercial d’extraction d’ARN.
  9. Appuyer sur le milieu du huitième segment abdominal avec l’aiguille de dissection afin d’exposer les paires d’ovaires situées de chaque côté. Retirer les ovaires, les rincer deux fois dans la goutte centrale de PBS, puis les transférer dans un tube de broyage contenant 200 µL de solution de conservation d’ARN.
    NOTE : Les paires d’ovaires sont symétriques, en forme de grain de riz et de couleur blanc laiteux. Manipuler avec précaution afin de préserver l’intégrité structurelle des ovaires pendant leur prélèvement.

5. Dissection des glandes salivaires de Ae. albopictus

  1. Augmenter le grossissement du microscope à 400x. Transférer l’abdomen disséqué de Ae. albopictus dans la goutte de PBS la plus à droite.
  2. Appliquer une pression douce sur le mésothorax avec l’aiguille de dissection tenue dans la main gauche jusqu’à ce que la tête soit légèrement soulevée.
  3. Utiliser la main droite pour soulever la tête au niveau du col avec l’aiguille de dissection et tirer lentement vers l’extérieur. Observer les glandes salivaires (structure trilobée) lorsqu’elles se détachent du thorax en même temps que la tête.
    NOTE : Les glandes salivaires sont situées dans le thorax antérieur et sont reliées à la tête via le canal salivaire. Appliquer une pression constante sur le thorax empêche la rupture du canal salivaire et permet aux glandes salivaires de se détacher intactes du thorax avec la tête. La maîtrise de la force à cette étape nécessite une pratique répétée.
  4. Séparer les glandes salivaires de la tête. Les rincer deux fois dans la goutte de PBS centrale et les transférer dans un tube de broyage préparé.
    NOTE : Les glandes salivaires mesurent environ 1 mm. Les transférer dans un tube de broyage contenant 200 µL de solution de conservation de l’ARN et les observer à la lumière blanche afin de confirmer la présence de petits points blancs flottant dans la solution.

6. Extraction d'ARN à partir de Ae. albopictus et de ses glandes salivaires, ovaires et intestin moyen

REMARQUE : Toutes les étapes d'extraction de l'ARN ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant du kit commercial d'extraction de l'ARN à partir de tissus, sans modification.

  1. Prérefroidir le broyeur de tissus à 4 °C. Régler les paramètres sur 30 Hz, 30 s de durée de broyage, 10 cycles et 8 s de pause.
  2. Placer les tubes de broyage contenant les échantillons de tissu dans le broyeur et lancer le programme.
    REMARQUE : Après broyage, vérifiez si le tissu est complètement dispersé dans la solution de conservation de l'ARN. Si le broyage est incomplet, effectuez 5 cycles supplémentaires.
  3. Transférer l'homogénat dans un tube de centrifugation stérile de 1,5 mL. Centrifuger à 12 000 x g à 4 °C pendant 5 min.
  4. Transférez le surnageant dans un nouveau tube stérile de 1,5 mL. Ajoutez 30 µL chloroforme
    ATTENTION : Le chloroforme est toxique et cancérigène. Porter des gants et des lunettes de protection, et manipuler sous une hotte aspirante.
  5. Vortexer vigoureusement pendant 20 s. Incuber à température ambiante pendant 15 min, puis centrifuger à 12 000 x g à 4 °C pendant 15 min.
    REMARQUE : Aspirez soigneusement la phase aqueuse supérieure en évitant la couche blanche intermédiaire afin de prévenir toute contamination par des protéines.
  6. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube stérile de centrifugation de 1,5 mL. Ajouter 75 µL isopropanol
  7. Mélanger par inversion et transférer l'ensemble du mélange dans une colonne à silice montée sur centrifugeuse. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
  8. Ajouter 600 µL tampon de lavage sur la colonne. Centrifuger à 12 000 x g pendant 30 s. Jeter le flux traversant.
  9. Ajouter 600 µL 80 % d'éthanol sur la colonne. Centrifuger à 12 000 x g pendant 30 s. Jeter le liquide de filtration. Répéter cette étape de lavage une fois, pour un total de deux lavages.
  10. Ajouter 30 µL de l’eau DEPC au centre de la membrane de la colonne. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
  11. Placer la colonne dans un tube de centrifugation stérile de 1,5 mL. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min pour éluer l'ARN.
  12. Prendre 1 µL de l'ARN élué et mesurer la concentration et la pureté à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume.

7. Transcription inverse de l'ARN

  1. Préparation du système de réaction
    1. Dégeler sur de la glace le mélange maître de transcription inverse 4x, l'eau sans nucléase et le modèle d'ARN.
    2. Dans un tube PCR de 200 µL, préparer un système de réaction de 20 µL en ajoutant 5 µL du mélange maître de transcription inverse 4x, 10 µL de modèle d'ARN total et 5 µL d'eau sans nucléase.
    3. Centrifuger brièvement à 1 000 x g pendant 1 min pour rassembler le mélange de réaction au fond du tube.
    4. Placer le tube PCR dans un thermocycleur et exécuter le programme de transcription inverse : 50 °C pendant 5 min ; 85 °C pendant 5 s.
      NOTE : Diluer le produit de transcription inverse 20 fois avant utilisation afin de réduire l'effet potentiel des inhibiteurs sur la RT-qPCR.

8. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)

  1. Préparation du système de réaction de RT-qPCR
    1. Dégeler sur de la glace le mélange maître 2x SYBR Green qPCR, le modèle d'ADNc et les amorces directe et inverse à 10 µM, en protégeant l'ensemble de la lumière pendant toute la manipulation.
    2. Dans une plaque PCR 96 puits, préparer un système de réaction de 20 µL par puits en ajoutant 10 µL de mélange maître 2x SYBR Green qPCR, 0,8 µL de chaque amorce à 10 µM (concentration finale de 400 nM), 2 µL de modèle d'ADNc dilué 20 fois et 6,4 µL d'eau sans nucléase.
    3. Fermer la plaque 96 puits avec un film adhésif optique, en veillant à ce que tous les puits soient parfaitement scellés.
    4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min afin de rassembler le mélange de réaction au fond des puits.
    5. Placer la plaque PCR dans un système de détection en temps réel et lancer le programme de cyclage thermique.
      NOTE : Programme de cyclage thermique : dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s (1 cycle) ; amplification : 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s (40 cycles) ; analyse de la courbe de fusion : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min, rampe jusqu'à 95 °C à 0,15 °C/s. Chaque échantillon d'ARN tissulaire est soumis à une qPCR en quadruplant des réplicats techniques. Chaque échantillon tissulaire est constitué de tissus regroupés provenant de 5 Ae. albopictus. Les séquences des amorces utilisées pour la RT-qPCR sont indiquées dans le tableau 1.
  2. Analyse des données
    1. Examiner la courbe de fusion pour chaque paire d'amorces afin de confirmer la présence d'un seul pic de dissociation bien défini.
    2. Exporter les valeurs de Ct à partir du logiciel de l'appareil. La représentation graphique et l'analyse des données sont effectuées à l'aide de logiciels statistiques et de traçage de graphiques.
Nom des amorcesSéquences des amorces (5'-3')
Ae. albopictus amorce directe β-actine GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus amorce inverse β-actineTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus amorce directe GAPDHCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus amorce inverse GAPDHTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus amorce directe RPS6ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus amorce inverse RPS6CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tableau 1 : Séquences des amorces d'Ae. albopictus utilisées en RT-qPCR.

Résultats

Cette étude comprend deux parties : la dissection d'Ae. albopictus et l'extraction d'ARN à partir des tissus post-dissection. Le flux opératoire global est présenté dans la Figure 1, où la Figure 1A illustre la dissection d'Ae. albopictus et la Figure 1B illustre l'extraction d'ARN et la détection ultérieure des niveaux d'expression des gènes de référence.

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Figure 1 : Schéma de la dissection d'Ae. albopictus et d'extraction d'ARN total à partir des tissus post-dissection. (A) Collecte, anesthésie et dissection d'Ae. albopictus. (B) Extraction d'ARN à partir des tissus post-dissection, identification de la pureté et détection des niveaux d'expression des gènes de référence. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Cinq spécimens de Ae. albopictus élevés en laboratoire ont été disséqués afin d'isoler le tube digestif moyen, les glandes salivaires et les ovaires. À un grossissement de 80×, le foregut transparent, le midgut et le hindgut de Ae. albopictus étaient clairement visibles, les ovaires de forme granuleuse étant situés de chaque côté et recouverts par les tubules de Malpighian blancs (Figure 2A). Lorsque le champ a été ajusté à 400×, les glandes salivaires translucides de Ae. albopictus sont devenues nettement observables (Figure 2B). Figure 2C,D illustrent les tissus isolés de midgut et d'ovaires. Les résultats ont indiqué que les tissus isolés par cette méthode de dissection conservaient leur intégrité structurelle, ce qui est essentiel pour l'extraction ultérieure d'ARN total à partir des spécimens post-dissection.

figure-results-2
Figure 2 : Analyse après dissection des tissus de Ae. albopictus. (A) Tissus isolés de l'abdomen de Ae. albopictus. (B) Glandes salivaires translucides et trilobées de Ae. albopictus. (C) Antre intestin et intestin moyen de Ae. albopictus. (D) Ovaires appariés en forme de grain de riz de Ae. albopictus. I : antre intestinal ; II : intestin moyen ; III : intestin postérieur ; IV : tubes de Malpighi ; V : ovaires. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

L'ARN total a été extrait de tissus disséqués de Ae. albopictus. Les échantillons de tissus (glandes salivaires, intestin moyen et ovaires) ont été complètement broyés avant l'extraction. Les concentrations en ARN variaient selon le type de tissu : les glandes salivaires présentaient une concentration de 7,8 ng/µL, tandis que l'intestin moyen, les ovaires et les homogénats entiers de femelles Ae. albopictus étaient respectivement de 55,3, 45,7 et 42,7 ng/µL. Tous les échantillons présentaient une grande pureté, avec des rapports A260/A280 compris entre 1,87 et 2,10 et des rapports A260/A230 compris entre 1,73 et 2,13 (Tableau 2). Les niveaux d'expression de trois gènes de référence candidats (GAPDH, β-actin et RPS6) ont été évalués par RT-qPCR dans tous les tissus. Bien que leur expression varie légèrement en fonction de la concentration en ARN, les trois gènes sont restés relativement stables selon les différents types de tissus (Figure 3). GAPDH, β-actin et RPS6 sont donc appropriés comme gènes de référence stables pour la normalisation de l'expression génique dans différents tissus de Ae. albopictus.

TissuNombre d'échantillonsConcentration d'ARN (ng/μL)A260/A280A260/A230
Glande salivaire57,81,871,73
Milieu digestif555,31,941,98
Ovaire545,72,102,13
Femelle142,72,041,92

Tableau 2 : Concentration et pureté de l'ARN extrait des tissus de Ae. albopictus.

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Figure 3 : Valeurs de Ct des gènes de référence (GAPDH, β-actin et RPS6) détectées par RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ae. albopictus est largement réparti dans les régions tempérées, subtropicales et tropicales de tous les continents, à l'exception de l'Antarctique13,14. En tant que vecteur important d'arbovirus tels que le virus de la dengue (DENV), le virus Zika (ZIKV) et le virus du chikungunya (CHIKV), il a provoqué à plusieurs reprises des flambées de maladies transmises par les moustiques dans la province du Guangdong, en Chine15.

Pour faciliter la recherche sur les virus liés à Ae. albopictus et leur transmission, nous avons mis au point une méthode simple pour disséquer les tissus de Ae. albopictus. Dans les protocoles conventionnels de dissection, lorsque la tête est séparée du thorax lors de la dissection des glandes salivaires, celles-ci peuvent rester attachées soit au thorax, soit à la tête, selon la force appliquée ; comme les glandes salivaires mesurent environ 1 mm, il devient difficile de les localiser à l'intérieur du thorax16. Cette méthode s'appuie sur les protocoles standards d'isolement d'organes de moustiques et optimise la séparation des glandes salivaires situées sous les sternoïtes prothoraciques et mésothoraciques, qu'il convient d'observer sous un grossissement de 400×17. Pour effectuer la dissection, appuyez doucement sur le mésathorax avec une aiguille tout en utilisant une autre aiguille pour exercer une pression permettant de séparer la tête, ce qui permet aux glandes salivaires de se détacher intactes. Cette approche évite de devoir rechercher les glandes salivaires à l'intérieur du thorax, prévient toute contamination ou lésion des glandes et réduit le temps total de dissection. Les ovaires se situent près des segments abdominaux VI à VIII et sont préservés en commençant la dissection au niveau du sixième segment abdominal, puis en extrayant soigneusement l'intestin moyen, les tubes de Malpighi et les ovaires de l'abdomen18. Cette méthode permet d'obtenir des glandes salivaires intactes, des formes d'ovaires typiques sans adhérence et un intestin moyen non rompu (Figure 2). Cette technique de dissection fournit des indications précieuses pour les études sur Ae. albopictus ainsi que sur la réplication, la dissémination et la transmission des virus transmis par vecteurs.

L'extraction d'ARN à partir de tissus de Ae. albopictus est essentielle pour la détection des virus transmis par les moustiques. La méthode classique au TRIzol est longue et exigeante sur le plan technique, mais elle fournit généralement des rendements élevés en ARN et peut produire de l'ARN de haute qualité lorsqu'elle est correctement réalisée. En revanche, la méthode basée sur les colonnes offre une meilleure reproductibilité et est plus facile à mettre en œuvre, mais elle peut entraîner une récupération moindre de l'ARN et fonctionne de manière inefficace lorsqu'elle est appliquée au corps gras19,20. Dans cette étude, les tissus disséqués ont été immédiatement conservés dans un stabilisateur d'acides nucléiques, broyés soigneusement, puis traités selon la méthode de la colonne à centrifuger pour extraire l'ARN destiné à la synthèse d'ADNc21. Afin d'assurer une normalisation précise des données de RT-qPCR malgré les variations de qualité de l'ADNc, des gènes de référence stables sont nécessaires22. Bien que des gènes de référence aient déjà été établis pour divers stades de développement de Ae. albopictus, les gènes de référence spécifiques aux tissus nécessitent une validation supplémentaire23,24. L'analyse par RT-qPCR de l'ARN rétrotranscrit provenant de tous les tissus disséqués a donné une amplification constante de GAPDH, β-actin et RPS6, confirmant que la qualité de l'ARN obtenue grâce à ce protocole de dissection est suffisante pour permettre des études ultérieures d'expression génique spécifiques aux tissus chez Ae. albopictus.

Lors de la dissection des tissus de Ae. albopictus selon ce protocole, il peut parfois arriver que les glandes salivaires ne se détachent pas en même temps que la tête. Ce problème résulte généralement d'une pression insuffisante appliquée sur le thorax combinée à une séparation trop rapide de la tête. Pour y remédier, appliquez une pression constante sur le mésothorax et tirez lentement la tête vers l'extérieur, afin de permettre aux glandes salivaires de se détacher intégralement avec la tête. Lors du transfert des glandes salivaires dans un tube de broyage contenant la solution de préservation de l'ARN, examinez attentivement la solution à la lumière pour repérer d'éventuelles petites particules blanches flottantes. Si les glandes salivaires ne sont pas visibles dans le tube, vérifiez immédiatement si elles sont restées attachées à l'aiguille de dissection. Lors de l'extraction de l'ARN, suivez scrupuleusement le protocole du fabricant du kit. Si la concentration d'ARN obtenue est faible, une seconde élution avec le tampon d'élution peut être effectuée. En RT-qPCR, des pics multiples peuvent apparaître sur la courbe de fusion ; dans ce cas, vérifiez d'abord la spécificité des amorces. Si les valeurs de Ct sont élevées, ajustez la température d'hybridation du programme en fonction de la température de fusion des amorces. En général, la température d'hybridation dans le programme doit être fixée à 1–2 °C en dessous de la température de fusion des amorces25.

Cette étude présente certaines limites. La portée de l'échantillon est relativement restreinte, se concentrant uniquement sur le mésentère, les glandes salivaires et les tissus ovariens, sans examiner d'autres tissus comme les tubes de Malpighi et le corps gras26. De plus, l'analyse a été limitée aux femelles de moustiques élevées en laboratoire âgées de 3 jours, les individus nourris au sang et infectés par un virus ayant été exclus27. Les améliorations futures devraient inclure l'élargissement de la portée de l'échantillon afin d'intégrer des tissus comme les tubes de Malpighi, ainsi que la prise en compte d'individus de Ae. albopictus dans différents états physiologiques.

En résumé, la dissection du tube digestif moyen, des ovaires et des glandes salivaires d'Ae. albopictus, suivie de l'extraction d'ARN total, fournit une base technique pour les évaluations ultérieures de la compétence vectorielle et les études sur la transmission des arbovirus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pipette Pasteur extra-longue de 3 mLWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 rxns
Kit HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix pour qPCRVazymeR433-01100 rxns
Kit d'extraction d'ARN total microMedTechMDT-CFR07100T/boîte
Micro-pipettes 0,5-10μLEppendorf4043444
Lames de microscopeCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MicrospectrophotomètreKAIAOK5600C
Buffer d'extraction des acides nucléiquesMedTechMDT-TP01100 mL
Solution saline tamponnée au phosphate PBS (stérile)ServicebioG4202500 ML
Cycleur thermique PCREppendorfMastercycler X50s
Système de PCR en temps réel QuantStudioTM 7 ProApplied biosystemsEN61326-1
Ensemble microscope Stemi 305 LABZEISS435063-9010-000

Références

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