Fabrication et utilisation d'une microplaque à 32 puits avec LED intégrées pour le contrôle dynamique optogénétique

Résumé

Ce protocole décrit comment fabriquer, programmer et utiliser une microplaque de 32 puits intégrant une diode électroluminescente (DEL) pour des études optogénétiques (LEMOS 2.0) à l'intérieur d'un lecteur de microplaques, afin de permettre une stimulation optogénétique à haut débit et des mesures quantitatives de l'expression génique dans des cultures microbiennes.

Résumé

Le contrôle optogénétique permet une régulation activée par la lumière de l'expression génique et offre une interface programmable entre les cellules vivantes et les systèmes électroniques. Toutefois, la conception courante de constructions optogénétiques reste limitée par les infrastructures. Les plateformes en boucle fermée existantes nécessitent souvent des chimostats, de la microfluidique, une manipulation robotisée ou des capteurs optiques sur mesure, ce qui peut augmenter les coûts, réduire l'accessibilité ou limiter les performances de mesure.

Ici, LEMOS 2.0 est présenté, un microplaque mis à jour intégrant des diodes électroluminescentes (DEL) pour les études d'optogénétique, un dispositif peu coûteux permettant la stimulation optogénétique et la caractérisation de circuits génétiques à l'intérieur de lecteurs de microplaques standards. LEMOS 2.0 améliore la plateforme LEMOS initiale en augmentant le débit de 16 à 32 micropuits et en réduisant les fuites lumineuses entre les micropuits adjacents, permettant ainsi des conditions d'obscurité comme état d'illumination supplémentaire. Le dispositif est composé d'un cadre imprimé en trois dimensions (3D), de DEL adressables individuellement placées à côté de chaque micropuit, d'une batterie rechargeable et d'un microcontrôleur intégré assurant une communication sans fil par Bluetooth. Des micropuits en polydiméthylsiloxane (PDMS) biocompatible sont moulés directement dans le dispositif par moulage par réplication, permettant la stimulation de cultures bactériennes à travers le moule transparent. Le dispositif s'insère dans des lecteurs de plaques standards, permettant la mesure de la densité optique et de la fluorescence.

Ce protocole décrit l'ensemble du flux de travail LEMOS 2.0, incluant la fabrication du dispositif, l'assemblage du circuit, la programmation Arduino, la moulure des micropuits en PDMS, la configuration du lecteur de plaques, la préparation des souches et des cultures, l'exécution automatisée de l'expérience, le nettoyage du dispositif, ainsi que l'analyse des données de fluorescence et d'OD₆₀₀. À titre de démonstration, le protocole utilise le système optogénétique CcaSR, dans lequel l'expression de sfGFP est activée par la lumière verte et réprimée par la lumière rouge. LEMOS 2.0 a pour objectif de rendre les perturbations optogénétiques et la caractérisation de l'expression génique plus accessibles aux utilisateurs en laboratoire, permettant des cycles conception-réalisation-test-apprentissage plus rapides sans nécessiter d'infrastructure spécialisée en bioréacteur ou en microfluidique.

Introduction

L'optogénétique fournit une interface programmable entre les cellules vivantes et les systèmes de contrôle électroniques. En utilisant la lumière pour réguler l'expression génique, le comportement cellulaire peut être activé avec une précision temporelle, une réversibilité et une perturbation minimale du milieu de culture¹. Lorsqu'elle est associée à des capteurs fluorescents ou luminescents, les systèmes optogénétiques permettent de mesurer électroniquement les états biologiques et de les réguler par rétroaction¹. Cette interface optique bidirectionnelle a permis un contrôle cybernétique des processus cellulaires, notamment l'expression génique, la croissance cellulaire et la composition des populations^2,3,4. Toutefois, de nombreux systèmes optogénétiques en boucle fermée performants nécessitent des chimostats spécialisés⁵, des dispositifs microfluidiques^4,6,7 ou des prélèvements robotisés^2,3,8, ce qui peut limiter l'accessibilité et entraver les cycles itératifs conception-construction-test-apprentissage.

Les lecteurs de microplaques comptent parmi les instruments les plus largement utilisés pour mesurer la croissance microbienne et la dynamique d'expression génique. Ils fournissent des mesures fiables de densité optique et de fluorescence sur de nombreux échantillons, permettent un contrôle environnemental et sont déjà intégrés aux flux de travail standards de biologie synthétique⁹. Toutefois, les trajets d'illumination des lecteurs de plaques commerciaux standards sont conçus pour la mesure optique, et non pour une activation optogénétique programmable et spécifique à chaque puits pendant la croissance des cultures. En conséquence, les expériences optogénétiques nécessitent souvent des dispositifs d'illumination séparés^{10,11,12,13,14}, un transfert robotisé entre les plateformes de stimulation et de mesure^8,15, ou un matériel personnalisé pour l'acquisition des données^5,16,17. Ces étapes supplémentaires réduisent la résolution temporelle, introduisent une variabilité liée à la manipulation et compliquent la commande en boucle fermée.

La microplaque intégrant des DEL pour les études d'optogénétique, ou LEMOS, a été précédemment développée pour combler cette lacune¹⁸. LEMOS est un dispositif compatible avec les lecteurs de microplaque, qui contient des DEL adressables individuellement positionnées autour de micropuits de culture. Le dispositif reste à l'intérieur d'un lecteur de microplaque commercial tout au long de l'expérience, permettant ainsi la stimulation optique et la mesure de la fluorescence ou de la densité optique à 600 nm (DO₆₀₀) sur la même plateforme. Dans la version initiale, LEMOS prenait en charge 16 micropuits de culture et a été utilisée pour démontrer une stimulation optogénétique en boucle ouverte ainsi qu'un contrôle en boucle fermée de l'expression génique en culture par lots¹⁸. Le dispositif était synchronisé avec un ordinateur externe afin que l'illumination des DEL puisse être désactivée pendant les fenêtres de mesure, minimisant ainsi toute interférence directe avec les lectures de fluorescence et de densité optique.

Ce protocole décrit une version actualisée du dispositif, LEMOS 2.0, ainsi que son utilisation pour des expériences optogénétiques sur des cultures microbiennes. LEMOS 2.0 a été repensé afin d'augmenter le nombre de micropuits de culture adressables indépendamment, passant de 16 à 32, ce qui améliore le débit expérimental et permet de tester davantage de conditions, de réplicats ou de conceptions de régulateurs lors d'un même essai. La conception du dispositif a également été modifiée pour réduire les fuites de lumière entre les micropuits illuminés et les micropuits sombres adjacents, améliorant ainsi la fiabilité des témoins en conditions d'obscurité et des expériences de stimulation spatialement structurée. Ces modifications rendent la plateforme plus adaptée à la caractérisation optogénétique comparative, aux tests de régulateurs dans plusieurs conditions, ainsi qu'à l'adoption routinière du protocole par des laboratoires utilisant déjà des lecteurs de microplaques.

LEMOS 2.0 est conçu pour des expériences microbiennes en culture par lots nécessitant des mesures répétées de la DO₆₀₀ et de la fluorescence, avec un éclairage programmable dans des états rouges, verts, bleus ou sombres. Le lecteur de plaques doit permettre des mesures cinétiques de la DO₆₀₀ et de la fluorescence, un contrôle de la température, un agitage, une définition personnalisée de la disposition de la plaque pour les 32 micropuits LEMOS, ainsi qu'une exportation automatisée des fichiers de mesure vers un dossier surveillé par le script de contrôle Python. La version actuelle a été validée à l'aide d'un lecteur de microplaques BioTek Synergy H1 avec BioTek Gen5 v3.14 ; son utilisation avec d'autres logiciels de lecteurs de plaques nécessite des modifications appropriées du format d'exportation, de l'analyseur de fichiers et des étapes d'automatisation de l'écran. Étant donné que l'appareil utilise des LED dont les pics d'émission se situent à 620–630 nm, 515–525 nm et 465–475 nm, les utilisateurs doivent choisir des effecteurs optogénétiques et des capteurs fluorescents dont les spectres d'activation et de détection sont compatibles avec ces canaux^19,20. De nouvelles souches hôtes, de nouveaux capteurs, systèmes optogénétiques, milieux, températures de croissance, intervalles d'échantillonnage ou conceptions de régulateurs exigeraient probablement un recalibrage de l'intensité des LED, de la plage du cycle de travail, de la correction du blanc, de la normalisation de la fluorescence et des paramètres du régulateur.

Le protocole couvre l'ensemble du flux de travail LEMOS 2.0 : fabrication du dispositif, assemblage du circuit, programmation d'Arduino, moulage de micropuits en polydiméthylsiloxane (PDMS), configuration du lecteur de plaques, préparation des souches et des cultures, exécution automatisée de l'expérience, nettoyage du dispositif et analyse des données de fluorescence et d'OD₆₀₀. Bien que l'exemple de flux de travail se concentre sur le contrôle optogénétique de l'expression génique bactérienne, ce même cadre peut être adapté à d'autres souches microbiennes, capteurs fluorescents, systèmes effecteurs optogénétiques et algorithmes de contrôle. En combinant une illumination programmable avec des mesures standards à l'aide d'un lecteur de plaques, la plateforme mise à jour LEMOS 2.0 offre un accès facilité à des expériences de perturbation optogénétique et de contrôle en boucle fermée à haut débit dans des cultures en lot.

Protocole

All experimental procedures involving Escherichia coli strain MG1655  were performed in designated Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratories at Texas A&M University. Bacterial cultures and manipulations were carried out in certified Class II Biosafety Cabinets in accordance with standard containment guidelines. Procedures were performed under designated containment conditions reviewed and approved by the Texas A&M Institutional Biosafety Committee (IBC) under permit number IBC2023-044.

1. Fabrication of the LEMOS 2.0 Frame and LED Array

NOTE: Begin fabricating LEMOS 2.0 by 3D-printing the LEMOS 2.0 frame and placing the LED strips into the device body. The goal is to generate a mechanically stable frame in which each LED is positioned next to the corresponding microwell. Correct LED placement at this stage is important because misalignment can reduce stimulation uniformity and increase optical crosstalk between microwells.

1. 3D-print the LEMOS 2.0 inner frame and the casting mold for the PDMS microwells using the provided STL files in the GitHub repository (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Remove all support material after printing.
   NOTE: It is recommended to use polylactic acid (PLA) filament and a fused deposition modelling (FDM) printer with the following printing parameters: 0.2 mm layer height, 20% infill for the LEMOS 2.0 frame, and 40% infill for the casting mold.
2. Cut the LED strips across the center of the soldering pads into 2 sets of 16 LEDs. Ensure each strip end has three soldering pads available for soldering, as discussed further in Section 2.
3. Fold each LED strip in half, with the LEDs facing outward (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1).
4. Manually conform the LED strip to the device geometry and insert it between the microwells, with the +5 V soldering pads oriented downward, noting the arrow on the LED strip (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1). Adjust the strip position iteratively until each LED is correctly seated in its slot before continuing.

2. Assembly and Validation of the Electrical Circuit

NOTE: Assemble the power, charging, microcontroller, switch, and LED connections required for wireless device operation. After assembly, the LEMOS 2.0 device should operate from the onboard battery, recharge through the charging module, and receive LED commands from the peripheral Arduino board. Verify each power connection before connecting the LED strips, as incorrect voltage routing can damage the microcontroller or LEDs.

CAUTION: The protocol requires prior proficiency in soldering, including appropriate safety practices (e.g., use of a smoke absorber, protective eyewear, and burn-prevention methods), soldering iron maintenance, and basic through-hole/wire-soldering techniques. Users without this experience should obtain training before attempting the steps in this section.

1. Gather all electronic components listed in the Table of Materials and inspect for visible physical damage. Review the wiring diagram (Supplementary File 1).
2. Configure the step-up voltage converter to output 5 V, instead of the default 12 V. Following the configuration key on the back of the board, disconnect pads A and B by applying heat from a soldering iron to remove the connection.
3. Solder the Arduino Nano BLE Rev2 (referred to hereafter as BLE Nano) VIN pin to the step-up converter OUT+ pin and the BLE Nano GND pin to the step-up converter OUT- pin (Supplementary Figure 1B).
4. Solder the step-up converter IN– pin to the battery charging module negative (-) pin.
5. Separate the two wires of the 'JST PH 2-Pin Cable – Female Connector, 100 mm' by pulling the battery-connection ends from the white housing. Trim each to ~70 mm to better fit in the device by trimming from the non-battery-connection ends (Supplementary Figure 1C).
6. Modify the switch. First, remove the mounting pins in each corner. Second, trim all pins to 30% of their length. Then, remove completely T1, T3, and B3 (Notation: T = top, B = bottom, numbered left to right from 1 to 4 when looking directly at the pins with the switch on top) (Supplementary Figure 1D).
7. Solder the red JST cable to B2, leaving the battery-connection end exposed for connecting to the battery’s male connector later (Supplementary Figure 1D).
8. Solder a connecting wire between B1 and B4.
9. Solder the battery charging module B+ pin to B1, being careful to leave the connecting wire from the previous step also soldered to B1 (Supplementary Figure 1E).
10. Solder the step-up converter IN+ pin to T4.
11. Solder the battery charging module positive (+) pin to T2.
12. Solder the black JST cable to the battery charging module B– pin. Leave the battery-connection end loose for later connection to the battery’s male connector.
13. Verify connections under normal device operation mode. Connect the Li-ion battery to the circuit via battery connecting wires left loose in soldering steps, with the switch in the center/off position (Supplementary Figure 1E).
14. Flip the switch to the left/on position (the side with only 2 occupied pins).
15. Verify power to the BLE Nano via the onboard power LED (labeled ‘ON’, next to the USB port), which should turn green (Supplementary Figure 1E, Supplementary Video 1).
16. Verify power to the step-up converter via its on-board LED, which should turn blue.
    NOTE: If LED indicators do not illuminate, verify all connections with a multimeter before proceeding.
17. Remove the first LED strip (inserted in step 1.4) and solder wires to both sets of VIN, DIN, and GND pads. Reinsert the LED strip, feeding the wires through the port on the side of the frame (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1).
18. Repeat with the second LED strip, according to Supplementary Video 1.
19. Solder the first LED strip to the BLE Nano GND pin, BLE Nano D13 pin, and BLE Nano VIN pin.
    NOTE: Soldering to the VIN pin requires soldering two wires to the same Arduino pin. Solder one wire inside the pin hole, and the other to the outside of the pin hole, at the indentation in the Nano board.
20. Solder the two LED strips together.
21. Verify connections with a multimeter in continuity mode by touching the VIN pin on the BLE Nano and the +5 V pad on the last unsoldered LED pad. Repeat for GND.
22. Secure the LED strips in place using a hot glue gun (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1). Move slowly, gluing only one or two LED pairs at a time, allowing the glue to cool between applications. Use tweezers as needed to hold the LEDs in place.

3. Programming the Central and Peripheral Arduino Boards

NOTE: Program the two Arduino boards used for wireless communication and LED control. The central Arduino (Arduino Nano IOT 33) is connected to the computer during an experiment, and it relays commands from the Python script. The peripheral Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) is stationed in the LEMOS 2.0 device and controls the LED array. Both boards must be loaded with the appropriate sketches before starting an experiment. Visual indicators of successful connection to the other device are available by uncommenting the listed lines in the Arduino scripts: Central – Lines 34–37, Yellow LED flashes; Peripheral – Lines 99–106, Green LED flashes. Re-comment these lines after observing successful connections between devices. Otherwise, flashing LEDs may turn on while the device is inside the plate reader, potentially compromising the measurements.

1. Download the Arduino files from the GitHub repository: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Download and install the latest version of the Arduino integrated development environment (IDE) from http://www.arduino.cc/en/software.
2. Install the latest version of the board package from the Boards Manager (Tools > Board > Boards Manager) (Supplementary Figure 2A).
   Central: Arduino SAMD Boards
   Peripheral: Arduino Mbed OS Nano Boards
3. Install the following Arduino libraries in the Library Manager (Tools > Manage Libraries) (Supplementary Figure 2B): 'ArduinoBLE’ for Bluetooth Low Energy communication between both peripheral and central devices, and ‘Adafruit_NeoPixel’ for LED programming.
4. Open the LEMOS_Central.ino Arduino file in the Arduino IDE.
5. Connect the corresponding device to the computer via universal serial bus (USB) data cable.
6. Select the correct COM port for the connected device (Tools > Port). If the COM port is unclear, observe which port appears and disappears when connecting and disconnecting the device.
7. Select the Arduino Nano 33 IoT board from the board menu (Tools > Board).
8. Upload the script to the device.
9. Repeat for the LEMOS_Peripheral.ino file and peripheral device (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Casting PDMS Microwells by Replica Molding

NOTE: Cast optically clear PDMS microwells directly inside the LEMOS 2.0 frame using replica molding²¹. The PDMS microwells hold the bacterial cultures during plate-reader experiments and must have clear, bubble-free bottoms for reliable OD₆₀₀ and fluorescence measurements. Dust, bubbles, or incomplete curing can introduce well-to-well variation and should be avoided during casting. Ensure the fume hood surface is clean before casting, as any dust or debris in the PDMS will compromise its optical transparency and result in inconsistent OD₆₀₀ readings across microwells.

CAUTION: Work in a fume hood when handling uncured PDMS. Avoid skin contact with the curing agent.

1. Sanitize the interior of the LEMOS 2.0 frame where the microwells are cast by spraying 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs. Allow the LEMOS 2.0 frame to dry completely before casting PDMS microwells.
   NOTE: Ethanol exposure to the LEDs is safe, but will damage all other electrical components.
2. Spray the casting mold for the PDMS microwells with a release agent, and wait 10 min for the spray to settle on the plastic surface. A second application after an additional 10 min can improve mold release, but it is optional.
   NOTE: The release agent (e.g., Ease Release 200) will make the casting mold hydrophobic, allowing for easy removal of the casting mold from the cured PDMS microwells.
3. Weigh and mix the curing agent and base of 184 silicone elastomer to a 10:1 mass ratio of base to curing agent in a disposable plastic cup.
   NOTE: It is recommended to use 2.5 g of curing agent + 25 g of base for a total of 27.5 g mixture for one LEMOS 2.0 device; scale up proportionally if casting multiple devices simultaneously.
4. Mix vigorously for at least 5 min using a disposable spatula or wooden stick, scraping the sides and bottom of the cup to ensure complete mixing.
   NOTE: Thorough mixing is critical. Undermixed PDMS will not cure uniformly and will yield inconsistent baseline OD₆₀₀ readings across microwells.
5. Place the cup containing the PDMS mixture in a vacuum desiccator. Apply vacuum (at least 65 cmHg /25 inHg) for 45–60 min, until all visible air bubbles have been removed from the mixture. The PDMS will expand as air bubbles rise to the surface and may overflow its cup. Use a container with at least 3× the volume of the mixture.
   NOTE: Residual air bubbles in the cured PDMS will alter the optical transmission of the microwell bottoms, leading to inconsistent baseline OD₆₀₀ measurements.
6. Secure the LEMOS 2.0 frame to the outer shell using binder clips of appropriate sizes on all four sides.
   NOTE: The binder clips minimize the amount of PDMS that seeps into the gap between the outer shell and the LEMOS 2.0 frame. Excess PDMS in this gap can increase the overall device height and prevent the LEMOS 2.0 frame from sitting level within the outer shell. Placing Kapton tape along the bottom perimeter of the LEMOS 2.0 frame, adjacent to the microwells, can further reduce seepage.
7. Pour the degassed PDMS carefully into the LEMOS 2.0 frame. Use a syringe to add PDMS into each microwell in the frame to ensure they are filled with minimal bubbles.
   NOTE: Formation of small bubbles is unavoidable; they will eventually rise to the surface and disappear. Pour the degassed PDMS immediately after degassing to minimize the reintroduction of bubbles during handling.
8. Insert the 3D-printed casting mold into the PDMS-filled frame. Press the mold gently and evenly, ensuring the circular protrusions in the casting mold sit in the holes of the LEMOS 2.0 frame. The mold defines square microwells aligned next to the LEDs. Wipe away excess PDMS that overflows from the edges with a clean lint-free wipe.
9. Allow the PDMS to cure at room temperature (25 °C) on a level surface for a minimum of 30 h. If needed, accelerate curing by placing the device at 37 °C for 4 h, but only once all visible air bubbles have been removed from the PDMS.
   CAUTION: Do not expose the LEMOS device to temperatures above 37 °C, as this may cause the onboard Li-ion battery to overheat and rupture.
10. Remove the casting mold after the PDMS microwells are cured by gripping it at the edges and pulling it up with a steady force. Ensure the PDMS microwells remain in the frame.
11. Inspect each microwell to ensure that the walls are optically clear and the bottom is free of bubbles. The LEMOS 2.0 device with fresh PDMS microwells is now ready for use.

5. Configuring the Microplate Reader and Data Export Workflow

NOTE: Configure the microplate reader to obtain LEMOS 2.0-compatible kinetic measurements and automation of data export. The reader must recognize the custom LEMOS 2.0 microwell layout, acquire OD₆₀₀ and fluorescence measurements at defined intervals, and export data files to the folder monitored by the Python control script. Perform a baseline measurement with sterile medium before biological experiments to confirm that the PDMS microwells and plate-reader settings produce consistent readings. This protocol uses a BioTek Synergy H1 microplate reader operated via BioTek Gen5 software v3.14.

1. Launch Gen5.
2. Go to Plate Types and import LEMOS 2.0.xml from GitHub, or alternatively set up the custom plate layout for LEMOS 2.0 in Gen5 by referring to Supplementary File 2 (Section 1)  and Supplementary File 3.
3. Perform a baseline measurement with the LEMOS 2.0 device (microwells filled with 200 µL of sterile M9CA media, covered with a medical-grade sealing film [e.g., Breathe-Easy film]). Record the OD₆₀₀ and fluorescence baseline values for all 32 microwells and compare these values to those obtained from a standard 96-well microplate. If a large discrepancy is observed, re-cast the PDMS microwells, as bubbles or debris in the cured PDMS are the most likely cause.
   NOTE: Breathe-Easy film is gas-permeable, maintaining aerobic conditions for cell growth, while remaining optically transparent to avoid interference with fluorescence and OD₆₀₀ measurements.
4. Open the experiment protocol closed_loop_protocol.prt from the GitHub repository in Gen5.
   NOTE: A pre-configured experiment file template.xpt is available in the GitHub repository for convenience. However, the settings are described in detail in Supplementary File 2 (Section 2) and Supplementary File 3 to provide a reference for troubleshooting for users with different versions of Gen5.

6. Preparation of Bacterial Cultures for LEMOS 2.0 Experiments

NOTE: Prepare bacterial cultures for a LEMOS 2.0 optogenetic time-course experiment. A cautious approach to culture preparation is important because starting density and pre-experiment light exposure can affect the measured gene-expression dynamics. The demonstration strain is Escherichia coli (E. coli) MG1655 carrying pSR58.6 and pNO286-3²². pSR58.6 contains superfolder green fluorescent protein (sfgfp) under P_cpcG2 and constitutive CcaR, chloramphenicol resistance, and a pColE1 origin. pNO286-3 contains constitutive CcaS, spectinomycin resistance, and a p15A origin. Together, these plasmids reconstitute a green-light-inducible, red-light-repressible gene expression system. pSR58.6 and pNO286-3 were transformed into chemically competent E. coli MG1655 using standard heat-shock transformation²³. Plates were kept in a box to protect cells from ambient light to avoid premature activation of the optogenetic circuit.

1. Inoculate a single colony of the CcaSR optogenetic strain and a fluorescence-negative control strain into separate 14 mL round-bottom culture tubes, each containing 2 mL of M9CA broth supplemented with 50 µg/mL spectinomycin and 25 µg/mL chloramphenicol. Use this media formulation for all subsequent culture steps throughout the experiment.
2. Cover each tube with aluminum foil and incubate overnight (14–16 h) at 37 °C with shaking at 220 rpm.
   NOTE: Foil wrapping maintains dark conditions and prevents unintended activation of the CcaSR system. Alternatively, cultures can be incubated under constant red light by housing the tubes in an LED enclosure wired with the same electrical setup described in section 2, which more closely mimics the repressed state of the system prior to the experiment.
3. Transfer 100 µL of each overnight culture into 2 mL of fresh media in a new foil-wrapped culture tube. Incubate for 4 h at 37 °C with shaking at 220 rpm.
4. Measure the OD₆₀₀ of each sub-culture after 4 h using the microplate reader.
   NOTE: Cultures should have reached an OD₆₀₀ of 0.4–0.6.
5. Dilute each culture to OD₆₀₀ = 0.1 in fresh media, pipette 200 µL into each microwell of the LEMOS 2.0 device, taking care while pipetting to avoid the formation of air bubbles, and seal the device with a medical-grade sealing film.

7. Initiation of a LEMOS 2.0 Optogenetic Time-Course Experiment

NOTE: Start the automated LEMOS 2.0 experiment by coordinating the microplate reader, the central Arduino, and the Python control script. During the run, the computer coordinates plate-reader measurements, data export, Bluetooth communication, and LED actuation. It is critical that the Gen5 window remains visible, as the Python script uses screen-based automation to interact with the plate-reader software. A successful start is indicated by exported data files appearing in the expected folder, terminal output confirming Bluetooth communication, and LED commands updating at each control interval.

1. Slide the switch to the left to power on the LEMOS 2.0 device. The first LED on the LED strip in LEMOS 2.0 will illuminate green.
2. Connect the central Arduino to the computer via USB and select it in the Arduino IDE from the drop-down menu (Tools > Board).
3. Open the Serial Monitor and connect the peripheral Arduino staged in LEMOS 2.0 to the central Arduino.
4. Turn off the indicator LED on the LED strip by entering the letter 'o' into the serial monitor.
5. Open the experiment file LEMOS-start-data.xpt in Gen5 and take a baseline reading of the cultures in the device, ensuring that the OD₆₀₀ and fluorescence values are consistent with expectations. Close the experiment file.
6. Open the protocol file saved in step 5.4 in Gen5 and save it as an experiment by referring to the Supplementary File 2 (Section 3) and Supplementary File 3.
7. Ensure that Python 3.10 or newer is installed on the system, and install the required packages using the provided requirements.txt file.
8. Open control_duty_cyle.py (for duty cycle experiments) or control_pid.py (for PID experiments) in any suitable IDE, such as Visual Studio Code or Spyder.
   NOTE: Ensure the working directory is set to the folder containing all the Python scripts so they can be imported during script execution. The choice of IDE is not critical.
9. In the Main section of the python script, modify the file variable to match the filename chosen for the Gen5 experiment file in step 7.6.
10. Set up the experiment file and Python script side by side (Figure 1).
11. Click Run on the Gen5 experiment, then abort it once the kinetic step begins.
    NOTE: The Python script looks for a Continue button after clicking Run. However, in a fresh experiment file, this button is not displayed until the second reading is taken or the kinetic run is aborted.
12. Run the Python script. Do not minimize or cover the Gen5 window during the run.
    NOTE: The Python script uses screen-based automation and must be able to locate the Gen5 window approximately every 20 min to handle data export after each kinetic cycle. Obscuring or minimizing the window during this time may disrupt the experiment.

8. Device Cleaning, PDMS Removal, and Battery Recharging

NOTE: Clean and reset the LEMOS 2.0 device after the experiment. Remove the bacterial cultures and the used PDMS microwells, sanitize the reusable frame and shell, and recharge the battery for the next run. Avoid exposing the non-LED electronic components to ethanol or excessive mechanical force during cleaning.

1. Gently peel the medical-grade sealing film from the top of the LEMOS 2.0 device and discard.
2. Aspirate and discard all cell suspension fluid from each microwell using a pipette according to biological waste disposal procedures.
3. Separate the outer shell from the LEMOS 2.0 frame by applying a steady, even force. Avoid excessive bending or twisting of the PLA frame, as this may cause cracking or permanent deformation.
4. Peel away the bulk PDMS layer from the exterior of the frame and use tweezers to carefully remove PDMS microwells from the LEMOS 2.0 frame.
5. Sanitize the LEMOS 2.0 frame and outer shell with 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs, as described in step 4.1.
6. Recharge the Li-ion battery for the next experiment:
   1. Slide switch to the right/charging position.
   2. Connect USB to charging module.
   3. Confirm charging via the onboard LED, which will flash while charging (Supplementary Figure 1E).

9. Analyzing Fluorescence and Growth Dynamics

NOTE: Process the fluorescence and OD₆₀₀ data generated during the LEMOS 2.0 experiment. The analysis notebook imports the exported plate-reader data, applies blank and negative-control corrections, calculates normalized fluorescence, and generates time-course plots. Before running the notebook, confirm that the microwell assignments and condition labels match the experimental layout.

1. Open either FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb or FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
   NOTE: This uses fluorescence (FL) and optical density (OD) data, which are stored in these files, generated during the run: Datafile/fl.csv and Datafile/od.csv. The PID analysis sheet also uses the errors of expression from the set point that are stored in Datafile/errors.csv.
2. Set the conditions variable with condition names and wells.
3. Set neg_wells equal to a bracketed list of negative control microwell names.
4. Set od_blank and fl_blank to averages across blank wells, or to known values if no blank was run.
5. Set colors_4_figures to desired colors (full list of named colors available at https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
6. Set figsize to the desired width and height of resultant figures in inches.
7. Confirm filenames listed under Constants.
8. Run the notebook, figures will be generated as .png files.

10. Troubleshooting

1. During LED wiring, if the LED soldering pads break off, consider the following:
   1. Bend the corner of the LED strip to more easily fit the wires through the wiring port.
   2. If a stiffer (solid) wire was used, switch to a more flexible (stranded) wire.
2. If the switch is turned on and the BLE Nano's power LED does not illuminate, consider the following:
   1. First, confirm whether the battery is charged. Set the switch to charging mode and connect the charging module to power. If charged, the indicator LED should stop flashing and turn solid green after a few minutes. If the battery was drained, allow it to charge fully before retrying.
   2. If the battery is charged and the LED still does not illuminate, use a multimeter to measure the voltage across the BLE Nano's VIN and GND pins.
      1. 0 V: A wiring connection is broken. Inspect each solder joint along the battery > switch > step-up converter > Nano path and re-flow any joint that looks cold or incomplete.
      2. 5 V: Power is reaching the Nano correctly, so the board itself may be damaged. Attempt to power the Nano via cable to confirm this. If the power LED still does not illuminate, solder a new Nano to replace the faulty Nano.
      3. Greater than 5 V: The step-up converter has not been configured to output 5 V. Confirm pads A and B have been disconnected on the step-up converter, as described in the device assembly section.
3. If the Python script fails to run, consider the following:
   1. Confirm whether the Python script is opened from within its full project folder rather than as a standalone file; both control_duty_cycle.py and control_pid.py depend on other local modules and will fail if opened independently.
   2. Confirm that Arduino IDE is closed, since the Arduino can only have one active connection at a time. The operating system grants access to whichever program opens the port first.
   3. Confirm that the Gen5 protocol is set up correctly, especially if using different software. Refer to Supplementary File 2 (Section 2).
   4. Ensure the required packages are installed. Create a virtual environment and install the packages as listed in the requirements.txt file.
4. If the experiment stops unexpectedly, consider the following:
   1. Stops after the first cycle: The Gen5 data export path is likely misconfigured. Confirm the export destination matches the folder the Python script expects to read from the file variable.
   2. Stops after several cycles: PyAutoGUI occasionally fails to recognize on-screen elements, often after a change in screen resolution, display scaling, or window size. Re-capture the reference screenshots used by the script and keep the Gen5 window active and in the foreground throughout the run; the Python IDE window can be minimized.
   3. In the event that Gen5 reports that the chamber temperature is outside the target range, allow the reader to equilibrate before continuing. Do not override the temperature warning, because doing so can trigger an audit report window that must be closed manually and may interrupt automation.
5. If unusually high or inconsistent OD₆₀₀/fluorescence baseline values across microwells are observed, consider the following:
   1. Inspect the PDMS microwells for trapped dust or debris, which scatters light and inflates readings.
   2. Avoid leaving PDMS uncovered and exposed to ambient air for extended periods before casting or use.
6. If cells show no detectable response to light despite running the experiment, consider the following:
   1. Confirm LED "on" commands are being issued by checking both the IDE terminal output and the BLE communication log.
   2. If commands are being sent but no light is visible, check the LED soldering connections with a multimeter.

Résultats

LEMOS 2.0 est une plateforme compatible avec les lecteurs de microplaques, dotée de 32 puits²⁴ pour la stimulation optogénétique programmable et la mesure quantitative de l'expression génique (Figure 2A,B). Chaque micropuits est associé à une diode électroluminescente (DEL) WS2812B adressable individuellement, contrôlée par un Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 via la bibliothèque Adafruit_NeoPixel. Le dispositif communique avec un ordinateur externe par Bluetooth, ce qui permet de mettre à jour les commandes d'illumination pendant l'expérience. De nouveaux micropuits en PDMS sont moulés dans le dispositif avant utilisation par moulage par réplication (Figure 2C,D). E. coli cultures cultivées dans LEMOS 2.0 à 30 °C sous une illumination constante par LED a montré une croissance reproductible dans les micropuits, indiquant que le dispositif permet la culture bactérienne et la mesure par lecteur de plaque pendant toute la durée de l'expérience¹⁸ (Figure 2E). De plus, les courbes de croissance étaient similaires quelles que soient les conditions d'illumination, indiquant que l'exposition aux LED n'affectait pas de manière mesurable la croissance cellulaire dans ces conditions.

Pour démontrer le contrôle de l'expression génique par optogénétique, le système CcaSR v3.0 a été adopté²², un système à deux composants activé par la lumière verte et réprimé par la lumière rouge, qui contrôle l'expression de sfGFP (Figure 3A). Sous lumière verte, CcaS s'autophosphoryle et transfère le phosphate au régulateur de réponse CcaR, qui s'associe en dimère pour activer l'expression de sfGFP dépendante du promoteur P_cpcG2. Sous lumière rouge, CcaS est déphosphorylé, réduisant ainsi l'activité de P_cpcG2 et réprimant l'expression de sfGFP. Les plasmides CcaSR ont été transformés dans E. coli MG1655 et utilisés pour les expériences décrites dans ce protocole (Figure 3B). Pendant l'expérience, le lecteur de microplaques a mesuré l'OD₆₀₀ et la fluorescence toutes les 10 minutes. Afin d'éviter que l'illumination par LED n'interfère avec les mesures optiques, les LED ont été programmées pour s'éteindre pendant les fenêtres de mesure situées au début et à la fin de chaque intervalle de 10 minutes (Figure 3C).

La communication entre puits a d'abord été évaluée en plaçant des micropuits en condition d'obscurité adjacents, de manière verticale ou horizontale, à des micropuits soumis à une illumination verte constante (Figure 3D). Les micropuits obscurs adjacents aux micropuits éclairés en continu par une lumière verte n'ont montré aucune augmentation significative de l'expression par rapport aux micropuits obscurs sans micropuits voisins illuminés, indiquant une fuite de lumière négligeable entre les micropuits. Sur la base de ces résultats, une valeur de modulation de largeur d'impulsion (PWM) de 1 sur 255 a été utilisée pour les expériences ultérieures afin d'assurer une stimulation optique suffisante tout en minimisant la communication entre puits.

Une stimulation en boucle ouverte a ensuite été utilisée pour définir le paramètre de commande pour le contrôle optogénétique basé sur LEMOS. Le paramètre de commande était le cycle de travail de la lumière verte, défini comme la fraction de chaque fenêtre d'illumination active attribuée à la lumière verte, le temps d'illumination restant étant attribué à la lumière rouge. Chaque intervalle de contrôle durait 10 min, les DEL étant activées pendant 8 min et éteintes pendant les 2 min restantes afin d'éviter toute interférence avec les mesures du lecteur de plaques. Des cycles de travail de la lumière verte compris entre 5 % et 80 % ont produit une expression graduée de sfGFP, montrant que le cycle de travail peut être utilisé comme une entrée réglable pour la régulation optogénétique (Figure 3E). Le taux d'expression augmentait lorsque le cycle de travail passait de 5 % à 40 %, sans augmentation significative supplémentaire à des cycles de travail plus élevés (Figure 3F), suggérant que le système atteint une saturation sous une stimulation prolongée par la lumière verte.

Enfin, une commande en boucle fermée avec rétroaction a été mise en œuvre afin de tester si LEMOS 2.0 pouvait réguler dynamiquement l'expression génique vers une valeur cible définie²⁵ (Figure 4A). Les composants du système de commande ont été attribués comme suit : actionneur — DEL, contrôleur — ordinateur externe exécutant le script PID, et sortie mesurée — fluorescence de sfGFP normalisée par l'OD₆₀₀. Le contrôleur comparait la valeur mesurée de FL/OD₆₀₀ à la valeur cible assignée et mettait à jour le cycle de travail de la lumière verte pour les 10 minutes suivantes. Une commande proportionnelle-intégrale-dérivée (PID) a été mise en œuvre, où la durée d'exposition à la lumière verte à chaque cycle, t_green, était calculée selon l'équation suivante :

Ici, e(t) est l'erreur entre le signal mesuré de FL/OD₆₀₀ et le point de consigne au temps t. K est le gain proportionnel, τ_I  est la constante de temps intégrale, et τ_D est la constante de temps dérivée. Les paramètres de contrôle en boucle fermée ont été choisis à l'aide du modèle d'expression génique au cours des phases de croissance (GEAGS), qui avait été précédemment décrit²⁶. À l'aide de ces paramètres, le signal mesuré a atteint et suivi le point de consigne cible de FL/OD₆₀₀ (Figure 4B).

Les commandes correspondantes du cycle de travail sont indiquées dans la Figure 4C. La hauteur des barres représente la fraction de lumière verte délivrée pendant chaque fenêtre d'illumination de 8 minutes. La commande du cycle de travail a changé par étapes discrètes, car le contrôleur mettait à jour l'entrée toutes les 10 minutes. Lorsque l'expression de sfGFP s'est rapprochée du point de consigne, l'exposition à la lumière verte a diminué tandis que l'exposition à la lumière rouge a augmenté. Une fois que le signal mesuré a atteint le point de consigne, une faible intensité d'entrée en lumière verte était encore observée. Cette commande résiduelle reflète probablement le terme dérivé réagissant au changement brutal du taux d'expression près du point de consigne. Ces résultats montrent que LEMOS 2.0 peut mettre en œuvre un contrôle par rétroaction PID guidé par un modèle pour l'expression génique optogénétique en culture en lot.

Figure 1 : Configuration du logiciel LEMOS 2.0 pendant une expérience. Exemple de capture d'écran montrant le script de contrôle Python en cours d'exécution dans VS Code (à gauche), avec les commandes LED qui apparaissent dans le terminal au fur et à mesure de leur envoi à la carte microcontrôleur Arduino. Le répertoire du projet contenant le script principal et les modules de fonctions associés est visible dans le panneau de l'explorateur de fichiers. À droite, le logiciel du lecteur de plaques affiche un cycle de mesure cinétique en cours ; à la fin de chaque cycle, le script Python déclenche automatiquement le cycle suivant via l'interface Gen5 et met à jour en conséquence les commandes du cycle de fonctionnement des LED. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Conception du dispositif LEMOS et caractérisation de la croissance cellulaire. (A) Schéma éclaté du dispositif LEMOS montrant les micropuits en PDMS, les DEL de stimulation, la batterie, l’interrupteur, le microcontrôleur, le module de charge, le bâti du dispositif et le boîtier externe. (B) Dispositif assemblé avec les micropuits en PDMS remplis d’eau déionisée. (C) Micropuit en PDMS moulé dans le dispositif LEMOS. Reproduit de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, sous licence CC BY 4.0. (D) Moule imprimé en 3D pour la fabrication des micropuits. (E) Courbes de croissance de E. coli dans le dispositif LEMOS à 30 °C (N = 3 réplicats techniques pour chaque puits, éclairés en continu soit avec de la lumière verte, soit avec de la lumière rouge, ou maintenus à l’obscurité). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation du système optogénétique dans LEMOS et dynamique de commande en boucle ouverte. (A) Carte du plasmide du système optogénétique à deux composants CcaSR : la lumière verte (522 nm) active CcaS/CcaR pour induire la surexpression de sfGFP, et la lumière rouge (620 nm) réprime cette expression. (B) Protocole pour la réalisation d'expériences optogénétiques avec le système optogénétique CcaSR. (C) Schéma de fonctionnement de LEMOS. Pendant le suivi sur 12 heures, l'appareil reste dans le lecteur de microplaque. Le lecteur mesure la fluorescence de sfGFP et l'OD₆₀₀, puis transmet les données à un ordinateur, qui gère le chronométrage et exécute les programmes Arduino. Ces programmes Arduino commandent au microcontrôleur embarqué de désactiver temporairement l'illumination par LED pendant chaque mesure. Adapté de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, sous licence CC BY 4.0. (D) Effet de l'interférence de la lumière verte sur des cellules non stimulées dans des conditions obscures. Dans la disposition de la plaque, les cases vertes indiquent les micropuits éclairés en lumière verte (N = 9), les cases grises indiquent les micropuits dans l'obscurité sans interférence lumineuse provenant des micropuits adjacents (N = 6), les cases violettes indiquent les micropuits obscurs (N = 3) adjacents verticalement aux micropuits éclairés en vert, les cases jaunes indiquent les micropuits obscurs (N = 3) adjacents horizontalement aux micropuits éclairés en vert, et les cases bleues indiquent les micropuits éclairés en vert (N = 2) contenant une souche témoin pour mesurer l'autofluorescence. (E) Réponses en boucle ouverte dans LEMOS à différents cycles de travail en lumière verte (5–80 %, N = 3) utilisés comme paramètre d'actionnement. Les lignes pleines indiquent les moyennes ; les zones ombrées indiquent les écarts types. (F) Taux moyen d'expression pendant la phase exponentielle de croissance en fonction du cycle de travail. N indique le nombre de réplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Contrôle par rétroaction en boucle fermée dans LEMOS 2.0. (A) Schéma du fonctionnement en boucle fermée : le lecteur de microplaque joue le rôle de capteur mesurant la FL/OD₆₀₀, l'ordinateur celui de contrôleur, et le dispositif LEMOS 2.0 commande les LED pour réguler l'expression génique. Le processus concerné est l'expression génique dans des cellules bactériennes vivantes. Adapté de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, sous licence CC BY 4.0. (B) Suivi par contrôle proportionnel intégral dérivé (PID) du point de consigne de FL/OD₆₀₀ (SP = 18,5 × 10⁵ u.a.). Les références sous lumière constante sont en vert et rouge (N = 3). Les expériences de suivi du point de consigne sont représentées par des lignes oranges (N = 3). Les lignes continues indiquent la moyenne de FL/OD₆₀₀ ; les zones ombrées indiquent les écarts types. La ligne pointillée indique le point de consigne. (C) Commandes typiques du cycle de fonctionnement générées par le contrôleur PID lors du suivi du point de consigne en boucle fermée. La hauteur des barres indique la fraction de lumière verte délivrée durant chaque intervalle d'illumination. N désigne le nombre de réplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Plateforme	Format de culture	Lecture	Contrôle par rétroaction démontré	Format de croissance	Contrainte abordée par LEMOS 2.0
LEMOS 2.0	32 micropuits en PDMS dans un lecteur de plaques	Lecteur de plaques commercial	Suivi de consigne PID guidé par modèle	Culture lot agitée	Cette étude	Cette étude
LEMOS 1.0	16 micropuits en PDMS dans un lecteur de plaques	Lecteur de plaques commercial	Suivi de consigne PI et PID guidé par modèle	Culture lot agitée	Débit inférieur ; compatibilité limitée en conditions sombres	18
Turbidostat automatisé + échantillonnage robotisé	Turbidostat	Cytométrie en flux + capteur d'OD	Suivi de consigne PI, PID, MPC	Culture continue	Nécessite un échantillonnage robotisé ; délai entre mesure et actionnement	2, 3
Microscopie Mother-machine	Microfluidique à cellule unique	Microscopie en temps réel	Rétroaction à cellule unique / MPC	Perfusion continue	Nécessite une microfluidique et une microscopie spécialisées	4, 6, 7
Chi.Bio	Turbidostat miniaturisé	Capteurs intégrés d'OD/FL	Suivi de consigne PI	Culture continue	La plage dynamique du capteur intégré limite la performance du contrôle par fluorescence	5
Light Tube Array	Tubes de culture	OD externe / cytométrie en flux	En boucle ouverte uniquement	Culture lot agitée	Échantillonnage manuel ; lecture en ligne de la croissance limitée	10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diya	Dispositifs d'illumination multi-puits	Lecteur de plaques commercial	En boucle ouverte uniquement	Culture lot	Stimulation et lecture séparées ; automatisation limitée	12, 13, 14, 15
Lustro	Illumination de plaque 96-puits	Lecteur de plaques commercial	En boucle ouverte uniquement	Culture lot	Nécessite un transfert robotisé entre stimulation et lecture	8
RT-OGENE	Plateau compatible multi-puits/microfluidique	OD/FL basé sur caméra	Boucle fermée tentée ; limitée par la lecture	Culture lot statique	La lecture par caméra et la culture statique limitent la performance du contrôle	16
optoPlateReader	Lecteur/stimulateur personnalisé 96-puits	Photodiodes intégrées	Suivi de consigne bang-bang	Culture lot agitée	La dépendance au rapporteur/filtre et la sensibilité limitée en fluorescence limitent la flexibilité de lecture	11,17

Tableau 1 : Comparaison de LEMOS 2.0 avec les plates-formes optogénétiques existantes^{2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18}.

Figure supplémentaire 1 : Images du montage. (A) Bande LED courbée et bande moulée à l'intérieur du dispositif. (B) Nano BLE Sense Rev 2 soudée au convertisseur élévateur, lui-même soudé au module de charge de batterie. (C) Versions originale et modifiée du câble « JST PH 2-Pin – Connecteur femelle 100 mm ». (D) Interrupteur d'origine, interrupteur modifié, câble JST PH rouge soudé, et cavalier court soudé entre deux broches situées de chaque côté de la rangée inférieure. (E) Intégration de l'interrupteur dans l'assemblage du circuit et alimentation du circuit. (F) Vue latérale des LED et des bandes de LED positionnées avec de la colle chaude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Captures d'écran de la configuration de l'IDE Arduino. (A) Capture d'écran du Gestionnaire de cartes, montrant une recherche pour l'une des cartes requises. (B) Capture d'écran du Gestionnaire de bibliothèques, montrant deux des bibliothèques requises. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1. Schéma de câblage LEMOS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Protocole de configuration d'un agencement personnalisé de plaque pour LEMOS 2.0 dans Gen5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Captures d'écran des étapes du logiciel décrites dans le Fichier supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo de montage comprenant les étapes suivantes. Manipulation de la bande LED dans le cadre, fixation de la bande LED avec de la colle chaude, disposition des fils vers les bandes LED et entre celles-ci, et assemblage final avec la circuit électronique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole décrit la fabrication et l'utilisation de LEMOS 2.0, une microplaque de 32 puits intégrant des DEL destinée à des expériences de stimulation optogénétique et de contrôle avec rétroaction à l'intérieur d'un lecteur de microplaque standard. Des expériences représentatives démontrent que LEMOS 2.0 permet la croissance microbienne (Figure 2E) sans phototoxicité significative observée sous éclairage. De plus, LEMOS 2.0 réduit les fuites de lumière vers les puits voisins maintenus à l'obscurité (Figure 3D), améliorant ainsi la fiabilité des témoins à l'obscurité et des expériences de stimulation avec motifs spatiaux. En outre, LEMOS 2.0 permet une activation optogénétique basée sur le cycle de fonctionnement (Figure 3E) et met en œuvre un contrôle en boucle fermée de type PID de l'expression génique en cultures par lots (Figure 4B).

La photodégradation est un paramètre important à prendre en compte dans les expériences d'optogénétique, car le même dispositif optique est utilisé à la fois pour l'activation et pour la détection fluorescente²⁷. LEMOS 2.0 utilise des DEL RVB commerciales comprenant trois diodes dont les pics d'émission se situent à 620–630 nm (rouge), 515–525 nm (vert) et 465–475 nm (bleu)¹⁹. Par conséquent, le choix du capteur fluorescent et l'intensité de fonctionnement des DEL doivent être sélectionnés de manière à minimiser le recouvrement spectral entre les longueurs d'onde d'activation et le spectre d'excitation du capteur fluorescent, tout en maintenant une intensité lumineuse suffisante pour assurer une régulation optogénétique efficace. Dans ce protocole, le système CcaSR a été utilisé, dont les réponses à la lumière verte et rouge se situent dans les bandes larges d'activation et de désactivation décrites pour ce système²², et la fluorescence de sfGFP a été mesurée en utilisant une excitation à 485 nm. Étant donné que les longueurs d'onde d'activation verte et rouge utilisées pour le contrôle du système CcaSR sont distinctes de la longueur d'onde d'excitation de sfGFP, et que l'intensité de sortie des DEL a été réduite au minimum à une intensité PWM de 1 sur 255 tout en produisant une régulation optogénétique robuste, la photodégradation induite par les DEL devrait être limitée. Une certaine photodégradation peut néanmoins survenir lors d'expériences de suivi sur de longues périodes ; toutefois, dans les conditions utilisées ici, elle n'était pas suffisamment importante pour masquer l'induction optogénétique mesurée, la réponse en cycle de fonctionnement ou la dynamique de suivi en boucle fermée²⁰.

Plusieurs étapes sont cruciales pour un fonctionnement fiable. Lors de la fabrication, chaque DEL doit être alignée avec le micropuits correspondant afin de maintenir l'uniformité de la stimulation et de réduire les interférences optiques. Lors du montage du circuit, le convertisseur élévateur doit être configuré à 5 V avant de connecter le microcontrôleur et les bandes de DEL. Le moulage du PDMS nécessite également une attention particulière, car la présence de bulles, de poussière, de débris ou une réticulation incomplète peut modifier la transmission optique à travers le fond des micropuits et entraîner des valeurs de référence incohérentes d'OD₆₀₀ ou de fluorescence²⁸. Une mesure de référence avec un milieu stérile doit donc être effectuée avant les expériences biologiques. Si des écarts importants dans les mesures d'OD₆₀₀ sont observés entre les puits par rapport au reste de la plaque, les puits concernés doivent être inspectés afin de détecter les problèmes de fabrication mentionnés précédemment. Selon la gravité, ces micropuits doivent soit être exclus de l'analyse, soit être entièrement recoulés.

La configuration logicielle est une autre cause fréquente d'échecs expérimentaux. Le protocole actuel dépend du fonctionnement coordonné de la méthode du lecteur de plaques, de l'exportation des données Gen5, du script de contrôle Python et de la communication Bluetooth entre les cartes Arduino centrale et périphérique. Le chemin d'exportation et le format de fichier doivent correspondre à la structure attendue par le script Python, et la fenêtre Gen5 doit rester visible pendant l'exécution, car l'automatisation repose sur des interactions basées sur l'écran. Avant de commencer une expérience, l'appareil LEMOS doit être connecté à l'Arduino central, et une routine de test doit être exécutée pour vérifier que toutes les LED s'allument correctement ; toute LED non réactive doit être identifiée et corrigée avant de charger les cultures bactériennes, car des défaillances non détectées entraîneraient des conditions d'illumination non contrôlées durant l'expérience. Les utilisateurs adaptant ce protocole à un autre modèle de lecteur de plaques ou à un autre logiciel doivent conserver la même logique de synchronisation, de mesure, d'exportation et d'analyse, tout en modifiant la couche d'automatisation selon les besoins.

LEMOS ferme la boucle en permettant une activation automatisée synchronisée avec les intervalles de mesure¹⁸. Ici, le dispositif LEMOS initial est mis à jour en doublant le nombre de puits afin d'augmenter le débit. De plus, une géométrie repensée des micropuits minimise les fuites de lumière entre puits, permettant ainsi de tester des circuits optogénétiques dans des conditions d'obscurité en parallèle avec des conditions éclairées au cours d'une même expérience. LEMOS 2.0 prend actuellement en charge les expériences en culture par lots. Étant donné que la vitesse de croissance, la disponibilité des ressources et la dynamique d'expression génique varient durant la culture par lots, des paramètres tels que l'intensité des LED, la plage de rapport cyclique, l'intervalle d'échantillonnage et les paramètres du contrôleur peuvent nécessiter un recalibrage pour d'autres souches, capteurs, systèmes optogénétiques ou conditions de croissance²⁰. Une comparaison détaillée de LEMOS 2.0 avec les plateformes précédemment développées pour réaliser des études optogénétiques est fournie dans Tableau 1. Les versions futures pourraient intégrer des canaux ou des réservoirs dans la plaque pour un échange et une dilution contrôlés du milieu, permettant des expériences plus longues tout en maintenant des conditions de croissance plus stables. D'autres conceptions pourraient également supporter des longueurs d'onde de LED alternatives ou réduire la dépendance à l'automatisation logicielle basée sur écran.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fil multibrin 22 AWG	Amazon	ASIN: B089CQ2N69	Fil peu coûteux pour relier le circuit électrique. Un fil rigide ou multibrin est acceptable.
Commutateur à bascule 8 broches, 3 positions, 2P3T DP3T, avec bouton latéral	Amazon	ASIN: B007Q9Y8YC	Le commutateur et les broches doivent être sur des côtés adjacents, et non opposés, comme c'est plus courant.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2	Arduino	ABX00071	Microcontrôleur – profil plat et fonctionnalité BLE adaptée aux besoins du dispositif périphérique.
Arduino Nano 33 IoT	Arduino	ABX00027	Microcontrôleur – utilisé comme dispositif central.
Lecteur de microplaque BioTek Synergy H1	Agilent (BioTek)	—	Ou lecteur de plaques compatible avec mode cinétique
Film d'étanchéité Breathe-Easy	USA Scientific	9123-6100	Film d'étanchéité médical ; film perméable aux gaz pour microplaque
Chloramphénicol (solution mère à 25 mg/mL dans l'éthanol)	Divers	—	Concentration de travail : 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200	Mann Release Technologies		Agent de démoulage
Scotch Kapton	Amazon	ASIN: B07F8TZZ4N
Plaques LB avec agar et antibiotiques appropriés	Interne	—	On suppose qu'ils sont déjà disponibles.
Batterie Li-ion 3,7 V, 3000 mAh (11,1 Wh), format 104060	Ufine	UFX0391-03	Doit être livrée avec câble JST PH à 2 broches mâle. Fabriquée par Liter Energy, vendue par divers détaillants.
Module de charge et décharge pour batterie Li-ion avec USB Type-C (5 V 1 A)	Amazon	ASIN: B0CTMJMRKZ	Rechercher « Remplace TP4056 » sur Amazon. Faire défiler les modules TP4056 standards. S'arrêter sur toute annonce affichant les modules noirs plus petits portant « Remplace TP4056 » dans le titre.
Câble JST PH Li-ion à 2 broches – Connecteur femelle 100 mm	Divers	ASIN: B07NWNPB77	Doit être compatible avec le connecteur JST de la batterie’.
Mini module boost 3,7 V à 5 V/8 V/9 V/12 V, carte de montée en tension avec indicateur LED	Amazon (Teyleten Robot)	ASIN: B0B4TB9QNY	[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Plaque Nunc OmniTray à une seule cavité	Thermo Scientific	242811	Carcasse extérieure
pNO286-3	Addgene	Plasmide n°107746	Encode une expression constitutive de CcaS
pSR58.6	Addgene	Plasmide n°63176	Encode une expression constitutive de CcaR et de sfGFP sous le promoteur PcpcG2
Poste à souder et soudure	Divers	—	Recommandations : embout fin, soudure à âme contenant de la colophane ou du flux.
Spectinomycine (solution mère à 50 mg/mL)	Divers	—	Concentration de travail : 50 µg/mL
Tubes de culture stériles (14 mL, fond rond)	Divers	—
Élastomère de silicone SYLGARD 184 (base + agent de durcissement)		SYLGARD 184	Durcisseur : base = 1:10 en masse
Câble USB-A vers Micro USB	Divers	—	Pour relier les cartes Arduino à l'ordinateur. Doit être un câble de transfert de données, et non simplement un câble de charge.
Câble de charge USB-A vers USB-C	Divers	—	À connecter au module de charge de batterie
Dessicateur sous vide et pompe	Divers	—	Pour dégazer le PDMS
Bande LED WS2812B IC SPI RVB, 100 LED/m, CC5V, IP30, noire	Amazon (BTF-LIGHTING)	ASIN: B088B8G8LD ; Référence BTF-LIGHTING : WS2812B1M100LB30	Bande LED à accès individuel. 100 LED/m. Tension : 5 V. IP30 indique la résistance à l'eau. Le noir est préférable au blanc pour réfléchir moins de lumière.