L'isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

Résumé

Cette vidéo montre comment les micro-dissection du sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région à partir d'embryons et l'utilisation de cytométrie en flux à trier les cellules souches hématopoïétiques.

Résumé

Dans l'embryon de souris, l'hématopoïèse début se produit simultanément dans plusieurs organes, dont le sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région. Ces régions sont cruciaux dans l'établissement du système du sang dans les embryons et conduit au mouvement éventuel de cellules souches dans le foie fœtal et ensuite le développement des cellules souches adultes dans le bonemarrow. Au début les cellules souches hématopoïétiques peuvent être isolées à partir de ces organes par microdissection de l'embryon suivie d'un tri par cytométrie en flux pour obtenir une population plus pur. On ignore encore comment ces populations de cellules souches de contribuer à la piscine de cellules souches foetales et adultes. En outre, notre laboratoire étudie comment les cellules souches début fonctionnellement différentes de foetales et adultes de cellules souches hématopoïétiques. En outre, notre laboratoire de sortes différentes populations de cellules souches hématopoïétiques et de tester leur rôle fonctionnel dans le contexte d'une variété de modèles génétiques. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de dissection micro-nous couramment utiliser et montrent également les résultats d'une plotfter typiques FACS isoler ces populations rares, il est possible d'effectuer une variété de tests fonctionnels, notamment: tests colonie et greffes de moelle osseuse.

Protocole

Dissection et isolement des premières cellules souches hématopoïétiques de souris sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région

1. Avant de commencer, il est important d'avoir tous les réactifs et les outils nécessaires à la procédure:
   
   • Ciseaux
   • Pince, taille 4, et de qualité chirurgicale plié pointe des pinces, taille 5 / 45 (en option)
   • Aiguilles de calibre 30 avec une seringue
   • 35mm et 100mm boîtes de Pétri
   • PBS avec 10% et 20% sérum de veau fœtal
   • et enfin, la collagénase
2. Pour commencer la dissection, nous avons besoin de récolter les cornes utérines d'une femme enceinte à 10,5 jours après la conception.
3. Les animaux sont euthanasiés conformément aux procédures approuvées. Nous utilisons l'asphyxie de dioxyde de carbone, suivie par dislocation cervicale.
4. Abdomen de la femelle est mouillée avec de l'éthanol et la peau est ouverte avec des ciseaux.
5. En tenant la peau avec des pinces, des réductions supplémentaires sont faites pour ouvrir le péritoine.
6. L'abdomen est ouvert et les cornes utérines peuvent être visualisées. En utilisant des pinces pour tenir les cornes utérines, couper chaque extrémité distale et le centre d'accise deux cornes.
7. Cornes utérines sont ensuite placés dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid avec 10% de FBS pour enlever les tissus utérins.
8. En utilisant la taille 4 forceps et travaillant sous le microscope, retirez délicatement le tissu de l'endomètre à partir autour de chaque conceptus embryon, en faisant attention à ne pas percer le placenta.
9. Une fois retirés, les embryons sont placés dans un plat frais avec du PBS froid et 10% de FBS.
10. Retirez délicatement le tissu placentaire de révéler l'embryon enfermé dans le sac vitellin en utilisant la pince pour couper l'embryon, enrobé de vitellus loin du placenta à leur jonction. Le sac vitellin vitelline contenant les artères, et une partie du cordon ombilical, peuvent être légèrement taquiné loin de l'embryon et mis de côté sur la glace pour la dissociation.
11. L'embryon est transféré dans un petit plat de Pétri avec des niveaux minimaux de PBS avec 10% de FBS - juste assez pour mouiller l'embryon, mais pas trop. Les taux optimaux garder l'embryon stationnaire tandis que la plaque est agitée lentement, en gardant l'embryon solidement en place lors de la dissection.
12. Passez à l'aiguille de calibre 30, qui sont utilisés pour enlever les parties supérieure et inférieure de l'embryon en coupant au-dessus des pattes avant et en dessous des pattes arrières. Se familiariser avec l'utilisation des aiguilles comme des instruments de coupe peut prendre un peu de pratique. Une méthode d'utilisation répétée de petites coupures en traversant les aiguilles vont disséquer le tissu, avec l'aiguille dans la main dominante pour agir comme un guide de coupe pour l'aiguille qui se tient dans la main non dominante.
13. Retirez la partie dorsale de l'embryon. C'est le tissu qui contient les somites. Délicatement couper les tissus dorsale plus tout en restant à une distance suffisante de l'aorte (ligne rouge) pour éviter tout Knicks. Découpage de l'aorte se traduirait par une perte de sang et de l'incapacité de visualiser facilement son emplacement. Encore une fois, faire de petites coupures avec les aiguilles est vital pour le maintien d'un emplacement de coupe précis.
14. Poussez le tissu supplémentaire loin hors de vue et tourner autour de l'embryon pour couper le tissu ventral, encore une fois la coupe aussi près que possible de l'aorte, sans qu'il knicking. Les coupes effectuées trop loin de l'emplacement optimal se traduirait dans les tissus abdominaux étant présente, qui peut être retiré une fois l'AGA est isolé.
15. Position de l'embryon avec sa face dorsale vers le bas ou le dos contre la plaque. Splay doucement l'embryon ouverte en poussant sur les côtés vers le bas et visualiser l'emplacement des crêtes génitales. Ils sont situés légèrement excentré que le tube-comme les structures de chaque côté de l'aorte.
16. Remplissez la dissection en enlevant l'excès des tissus secondaires en utilisant les techniques de coupe comme avant. Une fois le tissu côté de l'embryon est enlevée, puis l'embryon est renversé pour enlever le tissu côté restant.
17. À ce stade, l'AGA est inspecté pour toute l'excès de tissu qui peut être enlevé facilement avec les aiguilles, sans préjudice à l'aorte ou gonades. Suppression de l'excès autant que possible dans les résultats une meilleure isolation de la population de cellules souches car nous comptons sur seulement quelques marqueurs de surface cellulaire pour la purification.
18. Utilisation de la pince recourbée à pointe, doucement, puis ramasser chaque AGA et les placer dans du PBS froid avec du FBS à 10% avant d'être prêt pour la dissociation.

La dissociation et d'analyse FACS

1. Pour dissocier les tissus, d'abord sac vitellin place et assemblées générales dans des tubes séparés.
2. Spin brièvement tissus granulés et jetez PBS avec 10% de FBS.
3. Resuspendre tissus dans la collagénase 0,25% dans du PBS avec du FBS 20%, avec un volume suffisant pour couvrir adéquatement les tissus.
4. Incuber les tissus à 37 degrés. 25-30mins pour les assemblées générales et 35-40mins pour les sacs jaunes.
5. A la fin de l'incubation, délicatement la pipette tissus haut et bas pour une dissociation en suspensions cellulaires simples.
6. Laver les tissus avec un excès de PBS wie 10% de FBS, un culot de cellules et de remettre en suspension dans du PBS stérile fraîche avec 10% de FBS.
7. Pour une analyse FACS, les cellules sont colorées selon les recommandations du fabricant. Nous utilisons un FACSAria de BD Biosciences pour effectuer la cytométrie de flux. En raison de la taille et la fragilité des cellules embryonnaires, l'ouverture de tri est ajustée pour un diamètre plus grand que pour les adultes les cellules hématopoïétiques, qui nous étudions aussi dans le laboratoire. De même, la pression est ajustée à moins que les conditions requises par l'adulte les cellules hématopoïétiques. Par exemple, le tri sur le FACSAria, la taille de la buse serait de 100 microns et la pression de tri serait de 30 psi.
8. Pour les analyses de cellules souches, triple cellules positives exprimant l'CKIT marqueurs, CD34, CD41 et sont isolés et triés à partir du sac vitellin et positifs doubles (CKIT, CD34) sont isolés de l'AGA par FACS. Un tracé typique ressemblerait à ceci: CKIT cellules positifs sont analysés pour CD34 et CD41, simultanément ou individuellement. Habituellement cellules d'affichage une gradation de positivité pour chaque marqueur avec la population de cellules souches trouvé comme un sous-ensemble des populations positif. Ces parcelles nous montrent que nous avons atteint un rendement cellulaire bonnes 100-300 cellules par sac vitellin et par l'AGA.