Application d'une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Résumé

Cette vidéo montre comment utiliser C. elegans afin d'évaluer la neurodégénérescence neurone dopaminergique comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Par ailleurs, cribles génétiques sont utilisés pour identifier les facteurs qui accentuent la dégénérescence ou sont neuroprotecteurs.

Résumé

Les améliorations apportées au diagnostic et au traitement de la maladie de Parkinson (MP) sont tributaires des connaissances sur les facteurs qui rendent la susceptibilité des populations à risque. Dans le processus de tenter d'identifier de nouveaux facteurs génétiques associés à la DP, les scientifiques ont généré de nombreuses listes de gènes candidats, les polymorphismes, et les protéines qui représentent des avancées importantes, mais ces pistes restent mécanistiquement indéfini. Notre travail vise vers un rétrécissement de manière significative ces listes en exploitant les avantages d'un système de modèle animal simple. Bien que les humains ont des milliards de neurones, le nématode Caenorhabditis elegans microscopiques a précisément 302, dont huit seulement de produire la dopamine (DA) dans hemaphrodites. Expression d'un gène humain codant pour la protéine PD-associé, l'alpha-synucléine, dans C. elegans résultats neurones DA de la dose et âge-dépendante neurodégénérescence.

Worms exprimer humaine alpha-synucléine dans les neurones DA sont isogéniques et d'exprimer à la fois la GFP et l'alpha-synucléine humaine sous le promoteur du transporteur DA (EPEC-1). La présence de la GFP sert de marqueur pour suivre facilement visualisés neurodégénérescence DA chez ces animaux. Nous avons d'abord démontré que l'alpha-synucléine neurodégénérescence induite DA ont pu être sauvés dans ces animaux par torsinA, une protéine à activité chaperon moléculaire ^1. En outre, le candidat PD-liés gènes identifiés dans notre laboratoire au travers de grands efforts de dépistage ARNi en utilisant un dosage repliement alpha-synucléine ont ensuite été sur-exprimée dans les neurones DA C. elegans. Nous avons déterminé que cinq des sept gènes testés représenté modulateurs candidat significatif de PD comme ils sauvé l'alpha-synucléine induite DA neurodégénérescence ^2. Par ailleurs, le laboratoire de Lindquist (cette question de Jupiter) a effectué la levure écrans où l'alpha-synucléine-dépendant toxicité est utilisée comme une lecture des gènes qui peuvent augmenter ou supprimer la cytotoxicité. Nous avons ensuite examiné les gènes candidats de la levure dans notre test de C. elegans neurodégénérescence alpha-synucléine-induite et validé avec succès plusieurs de ces ^{trois cibles, 4.}

Notre méthodologie implique la génération d'un vecteur d'expression de C. elegans DA neurone-spécifique en utilisant le clonage par recombinaison des gènes candidats ADNc sous le contrôle du promoteur EPEC-1. Ces plasmides sont ensuite microinjectés de type sauvage (N2) vers, avec un marqueur de sélection pour la transformation réussie. Plusieurs lignées transgéniques stables produisant la protéine candidate dans les neurones DA sont obtenus indépendamment et ensuite franchi dans la souche alpha-synucléine dégénératives et évalués pour la neurodégénérescence, à la fois l'animal et le niveau des neurones individuels, au cours du vieillissement.

Protocole

A. Construction plasmide d'expression

Deux plasmides sont nécessaires: un pour l'expression tissu-spécifique du gène d'intérêt et un second en tant que marqueur sélectionnable de transformation (bien que le marqueur de plasmide est habituellement disponible au sein de la communauté de la recherche).

Experimental plasmidique

1. Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d'intérêt, dans ce cas, le transporteur DA (EPEC-1) promoteur est utilisé. Ce plasmide d'expression a été créé comme une passerelle Invitrogen système compatible vecteur de destination (pDEST-DAT-1) pour permettre l'insertion d'un gène d'intérêt en aval du promoteur par clonage par recombinaison ^1.
2. L'ADNc du gène d'intérêt est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L'ADNc amplifié est d'abord recombinés dans le vecteur pDONR201 des donateurs pour créer le vecteur d'entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l'ADN, le vecteur d'entrée est recombinée dans le pDEST-DAT-1 vecteurs de destination pour créer le plasmide d'expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. ^5.

Marqueurs de sélection plasmidique

Un marqueur transgénique plasmide est constitué d'un vecteur par un promoteur qui contrôlent l'expression d'une protéine fluorescente dans un tissu clair. Dans cette procédure particulière, le promoteur unc-54 entraîne l'expression des protéines dans le corps de cerises paroi musculaire (ponctua-54:: cerise).

B. Génération de C. elegans transgéniques via micro-injection

Voir l'article relatif JoVE: https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Analyse génétique des croix pour la neurodégénérescence DA

1. Worms sont cultivés en utilisant des procédures standard de ^6.
2. Placer 10 EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP mâles ^{1, 2} sur une plaque d'accouplement avec 3-4 L4 hermaphrodites transgéniques étape (exprimant EPEC-1: gène X et de ponctua-54:: cerise) . Cela devrait être effectué individuellement pour chacune des trois lignes séparées stables créés. Après deux jours, retirez les mâles.
3. Inspectez la génération F1; s'il ya plusieurs descendants mâles, l'accouplement a réussi.
4. Clone sur 5 hermaphrodites L4 animaux de chaque croix que présentent à la fois l'EPEC-1:: GFP marqueur fluorescent (hérité du parent mâle) et la ponctua-54:: cerise marqueur fluorescent muscles du corps mur (hérité du parent hermaphrodite). Les animaux clonés doivent être au stade L4 afin de s'assurer qu'ils n'ont pas encore accouplées avec des mâles présents sur le plateau. Permettez-leur de l'auto-cross et produire une descendance F2.
5. Animaux F2 produits à l'étape 3 sont clonées sur. Plus précisément, le transfert des animaux ~ 50-10 qui présentent deux marqueurs fluorescents pour leurs propres assiettes individuelles. Écran de la génération F3 pour les plaques d'où 100% de la GFP animaux expriment en DA neurones et certains des animaux sont d'exprimer cerise dans les cellules du corps muscle de la paroi. Ces animaux seront homozygotes pour l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1: gène de la GFP alors stablement transmission du transgène nouvellement créé (gène X).

D. Analyse dopaminergiques Neuron

1. Préparer une plaque de frais pour chacune des trois lignes créées ci-dessus, ainsi que l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP seule souche. Leur permettre de croître à l'âge adulte.
2. Transfert 30-40 adultes transgénique à partir de chaque ligne sur une plaque fraîche. Permettez-leur de jeter des embryons pendant 4 heures à 20 º C.
3. Retirez les adultes. Autoriser les embryons à développer pendant 3-4 jours à 20 º C jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4.
4. Choisissez ~ 100 transgénique L4 animaux à une plaque contenant 0,04 mg / ml de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR). Ce nucléotide de développement analogiques des blocs de la prochaine génération par inhibition de la synthèse de l'ADN, empêchant ainsi la descendance de l'animal de laboratoire écrasante ^7. Protéger les plaques FUDR de la lumière car il est sensible à la lumière.
5. Les animaux adultes seront analysés à plusieurs jours suivant la ponte. Les jours d'analyse appropriées sont déterminées empiriquement. Par exemple, nous avons déterminé que 77%, 87% et 90% de l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP animaux présentent dégénéré neurones DA aux jours 6, 7 et 10 de développement post, respectivement. Par conséquent, si nous prévoyons que le transgène d'intérêt pourrait renforcer la neurodégénérescence, nous allons analyser au jour 6 et / ou 7. De même, des transgènes qui pourrait supprimer la neurodégénérescence sera analysée au jour 7 et 10.
6. Faire 4 nouveaux pads agarose (contrairement à des plaquettes de gélose microinjection, elles sont utilisées fraîches et ne sont pas autorisés à sécher). Énoncer deux lames de microscope qui ont un morceau de ruban à travers eux; le ruban sert entretoise pour les plaquettes équivalente d'épaisseur. Lay tiersglisser entre eux sur le banc (ils sont positionnés sur trois au courant). Déposer une goutte de agarose fondu sur la lame du centre et rapidement mettre une autre lame sur le dessus de l'agarose, perpendiculaire à et à travers tous les trois diapositives. Faites plusieurs pads supplémentaires, laissant les deux diapositives ensemble jusqu'à ce que le pad est prêt à l'emploi.
7. Pour analyser le ver neurones DA, déposer une goutte 6 pi de 3 mM lévamisole (un anesthésique) sur un 22 x 30 mm couvercle en verre. Choisissez 40 animaux adultes (10 supplémentaires au-delà des 30 à être marqué) dans la goutte, puis inverser le couvercle en verre sur le tampon d'agarose. Répétez l'opération pour chacune des autres lignes.
8. Score 30 animaux par ligne pour la présence de chaque CEP et ADE neurone à l'aide d'un microscope composé avec épifluorescence et un cube de filtre qui permet la visualisation de FITC ou GFP. Nous utilisons un filtre à gagner à la GFP HyQ cube (technologie Chroma). Enregistrer les données sur la feuille de pointage ci-joint. Animaux de type sauvage conservera fluorescence de la GFP complète dans tous les CEP 4 et 2 neurones ADE. Les animaux individuels présentant une perte de neurones DA sont marqués comme non-WT ou "dégénérer". De même, la mesure de la dégénérescence peut être marqué par le comptage des neurones perdus au total dans chaque animal ainsi que la population.
9. Répétez l'analyse 2 fois plus (30 animaux plus par ligne et par essai). Le nombre total de vers de type sauvage présentant des neurones DA à partir des trois tours des analyses est de moyenne. L'analyse statistique pour la neuroprotection est ensuite effectuée à l'aide de l'étudiant t-test (p <0,05) pour comparer les vers de contrôle (EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP) par des souches qui les gènes candidats sur-expriment dans les neurones DA .

Discussion

La perte liée à l'âge des neurones à dopamine est une caractéristique clinique de la maladie de Parkinson et a été associée à l'accumulation ou mauvais repliement d'une protéine appelée alpha-synucléine. Ici, nous montrer comment l'étiquette, par l'intermédiaire d'un transgène fluorescentes, les neurones dopaminergiques de C. elegans et imiter la neurodégénérescence observée dans la maladie de Parkinson en coexprimant humaine alpha-synucléine dans ces cellules.

Cette vidéo illustre la méthodologie po...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Verrerie de couverture 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Lames de microscope	Planes, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Microscope stéréo avec fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Microscope stéréo	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645
Microscope épifluorescent	Microscope	Nikon Instruments	Modèle E-800
Cube de filtres, GFP HYQ	Bande passante Endow	Chroma Technology Corp.