L'aide de pincettes laser pour la manipulation neurones isolés in vitro

Résumé

Cette vidéo décrit la manipulation des neurones cultivés en utilisant le laser pincettes in vitro.

Résumé

Dans ce papier et vidéo, nous décrivons les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour étudier les préférences de ciblage des processus régénérant cellulaire des neurones rétiniens adultes in vitro. Procédures pour préparer des cultures de cellules rétiniennes commencer par la dissection, la digestion et la trituration de la rétine, et se terminent avec le placage de cellules rétiniennes isolées sur des plats spécialement conçus pour une utilisation avec pinces optiques. Ces plats sont divisés en une demi adhésion cellulaire et demi répulsif cellule. Le côté adhésif cellule est recouverte d'une couche de Sal-1 anticorps, qui fournissent un substrat sur lequel les cellules de notre croissance. D'autres substrats adhésif pourrait être utilisé pour d'autres types cellulaires. Le côté répulsif cellule est recouverte d'une fine couche de poly-HEMA. Les cellules étalées sur le côté poly-HEMA du plat sont piégés avec la pince à épiler au laser, transporté et placé à proximité d'un cellulaire sur la Sal-1 côté pour créer une paire. Formation des groupes de cellules de n'importe quelle taille devrait être possible avec cette technique. «Laser-pincette contrôlée micromanipulation» signifie que le chercheur peut choisir lequel les cellules à se déplacer, et la distance souhaitée entre les cellules peuvent être standardisés. Parce que le faisceau laser passe à travers des surfaces transparentes de la boîte de culture, la sélection de cellules et de placement sont effectués dans un espace clos, environnement stérile. Les cellules peuvent être surveillés par vidéo time-lapse et utilisé avec n'importe quelle technique de biologie cellulaire nécessaires. Cette technique peut aider les enquêtes sur les interactions cellule-cellule.

Protocole

Pinces optiques permettant de manipuler des cellules isolées en culture

Les forces de piégeage des pinces optiques sont générées à partir de l'élan de la lumière (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Bien que ces forces facilement piéger les cellules en suspension, ils ne sont pas en mesure de déplacer des cellules qui adhèrent à une surface. Par conséquent, pour réduire l'adhérence de la boîte de culture à l'endroit où les cellules sont piégées, la lamelle est enduit avec de la poly-2-hydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), un composé non toxique aux cellules répulsif propriétés précédemment....

Discussion

La lumière a l'élan, et quand un rayon de lumière est réfractée lorsqu'elle passe à travers une cellule, une force est nécessaire pour changer la direction de l'élan. En raison de la loi de conservation de l'élan, une force dans la direction opposée doivent, à leur tour, réagissent à leur tour sur une cellule. Ashkin (1991) ont montré que la force générée par un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope se déplace d'une cellule vers le centre d'intérêt. Même si un faisceau laser ne génère qu'une picon.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disque de verre de couverture de 25 mm, n°1	VWR international	48380 080
Poly-2-hydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA)	Sigma-Aldrich	P-3932	Dissoudre dans de l'éthanol à 95 %
Anticorps IgG de chèvre anti-souris	Chemicon International	AP181	1 mg dans 1 ml, diluer 10 fois pour utilisation
Supernatant Sal-1 contenant un anticorps de souris anti-salamandre	fourni gracieusement par le Dr Peter MacLeish		Dr Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
Pipettes jetables pyrex de 5 ml, diamètre intérieur de 3 mm	Corning	7078A-5
Plaques de culture cellulaire de 35 mm × 10 mm	Corning	430165
Kit d'élastomère de silicone Sylgard 184	Dow Corning
Pincettes optiques-microoutil ou pincettes laser	Cell Robotics Inc.
Laser à diode continu de 1 W, longueur d'onde de 980 nm	Cell Robotics Inc.
Microscope inversé à lumière transmise Axiovert 100	Carl Zeiss, Inc.
Objectif à immersion huile 40x plan néofluor	Carl Zeiss, Inc.		Ouverture numérique (O.N. 1,3)
Caméra CCD noir et blanc	Sony Corporation
Ordinateur et manette avec logiciel	Cell Robotics Inc.		pour commander une platine motorisée