Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

Résumé

Ici, nous décrivons les procédures pour l'étude des changements dans la phagocytose induite par l'expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur utilisant le système à double GloTM Luciferase Assay de Promega.

Résumé

Pour étudier la coordination des différentes voies de synthèse des lipides au cours biogenèse membranaire, il est utile de travailler avec un système expérimental, où la biogenèse membranaire survient rapidement et de façon inductible. Nous avons trouvé que la phagocytose de billes de latex est pratique à ces fins que les cellules rapidement synthétiser les lipides des membranes pour reconstituer les piscines membrane perdue matériau d'emballage au cours engloutissement de particules. Ici, nous décrivons les procédures pour l'étude des changements dans la phagocytose induite par l'expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur en utilisant le système Dual-Glo Luciferase Assay de Promega.

Protocole

Culture de cellules

1. Cultures stock de rein embryonnaire humain 293 (HEK293) les cellules sont cultivées dans 10 cm de boîtes de culture en «milieu A ', composé de milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) supplémenté avec un cocktail d'antibiotiques (100 unités par ml de pénicilline et 100 pg par ml de sulfate de streptomycine) et 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
2. Pour mettre en place des cellules d'une expérience, le milieu est aspiré et les cellules sont lavées deux fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS).
3. Le PBS est ensuite retiré et remplacé par 0,6 ml d'une solution contenant 0,25% de trypsine.
4. Le plat est incubé à 37 ˚ C pendant environ 2 min jusqu'à ce que les cellules ont commencé à se détacher.
5. 5,5 ml de milieu A est ajouté pour neutraliser la trypsine et les cellules sont comptées avec un hémocytomètre.
6. Les cellules sont diluées à 320.000 cellules par ml et distribués à 0,1 ml par puits dans une polylysine enduits plaque de 96 puits de culture.
7. Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures.

Transfections

1. En se préparant pour les transfections, il devrait être considéré comme le nombre de répétitions sont à effectuer par les conditions expérimentales et quelles quantités de plasmide sera transfectées. Nous faisons régulièrement effectuer toutes les conditions en triple exemplaire et transfecter un total de 50 à 100 ng d'ADN plasmidique par puits. Mélange plasmidique devrait comprendre au moins un journaliste construction exprimant la luciférase de luciole et un contrôle luciférase Renilla plasmidique exprimant à partir d'un promoteur constitutif.
2. Solutions de plasmide sont pipetés dans des microtubes de 1,5 ml et complété avec 10 pi par échantillon de sérum et sans antibiotique DMEM. Par exemple, si 20 puits sont chacun à être transfectées avec 50 ug d'ADN, ajouter 200 pl de DMEM à 1 ug d'ADN.
3. Pour la solution de DMEM / ADN ajouter 3 ul 'Transit 293 réactifs »(Mirus) par ug d'ADN. Mélanger à la pipette up & down et laissez les échantillons reposer à température ambiante pendant au moins 10 min.
4. Durant cette période, retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de le remplacer par 90 ul de milieu frais A.
5. Pour chaque bien ajouter 10 ul de la DMEM / DNA / Transit 293 mélange.
6. Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures.

Phagocytose

1. Préparer les suspensions contenant le milieu B (un mélange 1:1 de DMEM et Ham F12, plus des antibiotiques et 10% de FBS) majoré de 0,75 um de billes de latex à zéro à 1 mg par ml.
2. Retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de la remplacer par 0,1 ml de suspensions de billes dans le milieu B.
3. Faites tourner la plaque pendant 2 min à 1000 x g.
4. Les cellules sont ensuite cultivées à 37 ˚ C pendant 6 à 16 heures. Selon les conditions et le promoteur utilisé pour piloter la luciférase, une expression accrue du gène rapporteur peut être détectée après 1 à 3 heures.
5. Dans ce cas même il peut être nécessaire d'incuber les cellules avec des billes de 30 à 60 min, puis faire deux lavages avec du PBS pour éliminer des billes non constituée en société, et d'ajouter des milieux frais avant d'incuber les cellules pour des périodes supplémentaires de temps.

Double-GloTM Luciferase Assay

1. Remarque: notre protocole pour l'utilisation de ce kit diffère à certains égards de celle recommandée par le fabricant. Il a été modifié pour réduire la quantité de réactifs nécessaires par échantillon.
2. Préparer une solution de 1 M de DTT, la diviser en plusieurs petites portions et les conserver à -20 ˚ C.
3. Préparer un tampon de lyse contenant 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glycérol, et de 0,5% (v / v) de Triton X-100. Avant utilisation, une partie aliquote montant nécessaire pour l'expérience et ajouter 1 l par ml de 1 M de DTT, plus un cocktail inhibiteur de la protéase à une concentration finale de 0,5 à 1x. Ne pas réutiliser les restes de la solution la TNT.
4. Lorsque vous utilisez le kit Dual-GloTM pour la première fois, de préparer le réactif (Firefly) luciférase en transférant l'intégralité du contenu d'une bouteille de tampon luciférase Dual-GloTM (fourni avec le kit) pour une bouteille de substrat luciférase Dual-GloTM (à condition avec le kit). Répartissez les réactifs non utilisés luciférase dans des aliquotes de 10 ml et conserver à -20 ˚ C.
5. Retirer la plaque de 96 puits de la incubateur de culture tissulaire et le placer sur la glace. Retirez le support par aspiration, ajouter 40 ul par puits de tampon de lyse, puis laisser la plaque sur la glace pendant 30 min.
6. Dans un blanc, opaque plaque de 96 puits (OptiplateTM-96, Perkin Elmer numéro de catalogue 6005290) aliquot 15 ul par puits de réactif luciférase, puis ajouter 15 ul de lysat cellulaire.
7. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 min puis lisez la luminescence dans un lecteur de microplaques.
8. Immédiatement avant utilisation, préparer une quantité appropriée de solution de substrat Renilla luciférase en ajoutant 1 partie double GloTM Stop & Glo ®; Réactif (fourni avec le kit) pour 100 parties Dual-Stop & Glo GloTM ® Tampon (fourni avec le kit).
9. Pour chaque puits ajouter 15 ul par puits de la solution de substrat luciférase Renilla, incuber à température ambiante pendant 10 min, puis de mesurer la luminescence de nouveau.