Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.
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Article de méthode
Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cortex cérébelleux est une structure bien décrite qui fournit des occasions uniques pour l'étude des propriétés des neurones et 1,2 de développement. Parmi les types de neurones du cervelet (cellules granulaires, les cellules de Purkinje et les interneurones inhibiteurs), les neurones granulaires sont de loin les plus nombreux et sont le type le plus abondant de neurones dans le cerveau des mammifères. Chez les rongeurs, les neurones granulaires du cervelet sont générés au cours des deux premières semaines post-natale à partir de cellules progénitrices dans la couche la plus superficielle du cortex cérébelleux, la couche granulaire externe (EGL). Le protocole présenté ici décrit les techniques d'enrichir et de neurones granulaires de la culture et de leurs cellules progénitrices du cervelet de souris post-natale. Nous allons décrire les procédures pour obtenir des cultures de pureté croissante 3,4, ce qui peut être utilisé pour étudier la différenciation de la prolifération des cellules progénitrices dans les neurones granulaires 5,6. Une fois les cellules progénitrices se différencier, les cultures fournissent également une population homogène de neurones granulaires pour la manipulation expérimentale et la caractérisation des phénomènes tels que la synaptogenèse, la fonction des récepteurs du glutamate 7, interaction avec d'autres cellules purifiées cérébelleuse 8,9 ou 7 la mort cellulaire.
Protocole
Partie 1: Mise en place (1-2 jours avant la dissection) (non représenté sur la vidéo)
- PREPARATION DE SOLUTIONS DE CULTURE ET MÉDIAS:
- 4X CMF-PBS-EDTA (calcium et magnésium libre-tampon phosphate salin-EDTA pour des dilutions de Percoll): litre, ajouter 32 g de NaCl, 1,2 g de KCl, 8 g de glucose, 2 g de NaH 2 PO 4, 1 g de KH 2 PO 4, 8 ml de 2% de NaHCO 3 actions, 10 ml d'EDTA 1 M (pH 8,0) à l'eau distillée / désionisée. Réglez le volume à 1 litre et le pH à 7,4. Stériliser par filtration.
- HBSS-glucose: glycémie Ajouter (6 grammes / litre) pour le calcium et le magnésium Solution....
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Discussion
Ce protocole est basé sur les modifications de procédures qui ont été décrites dans le 3,7,11 passé. Il ya plusieurs points importants à noter que discuté ci-dessous.
Les neurones granulaires et les cellules progénitrices se conformer dans les 2 heures de placage. Les cellules saines ont une morphologie ronde sous le microscope de 4 à contraste de phase. Dans les 24 heures après l'étalement, les cellules saines seront réparties uniformément autour du lamelles en plastique ou le bien et feront processus. Au .......
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Remerciements
Nous remercions Barbara Carletti et Anna Marie Kenney pour des suggestions précieuses. HYL est soutenu par les subventions de formation «Hormones: Biochimie et Biologie Moléculaire", DK07328. Soutenu en partie par NIH NS16951 5R01 (CAM).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Filtre cellulaire avec pore de maille de 70μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Aiguille rachidienne | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 pouces |
| Poly-D-Lysine, masse moléculaire>300 000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Chaque nouveau lot de Poly-D-Lysine doit être testé. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Pénicilline-Streptomycine (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Doit être sans calcium ni magnésium. |
| Milieu Neurobasal A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Supplément Glutamax I | Invitrogen | 35050-061 | |
| Supplément sans sérum B-27 (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Coverslips circulaires de 12 mm | Carolina Biological | 63-3029 | Ces produits sont fabriqués en Allemagne par Deckglaser. |
| Coverslips circulaires de 25 mm | Carolina Biological | 63-3037 | Ces produits sont fabriqués en Allemagne par Deckglaser. |
| Système de dissociation à la papaine | Worthington Biochemical | LK 003150 | Le kit permet cinq isolations. |
| Ciseaux Permaset | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont n°5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| Plaque de culture à 4 puits | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Plaque de culture à 6 puits | Nalge Nunc international | 140685 |
Références
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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Réimpressions et autorisations
