1.6: Tests pour identifier les aliments génétiquement modifiés

1. extraction de l’ADN d’échantillons de denrées alimentaires

1. Ajouter 500 µL de matrice de mélange acheté PCR à chacun des 2 tubes à bouchon vissé à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une micropipette µL de réglage du volume 200-1 000. Pipetter en haut et en bas avec la pipette entre chaque aliquote de mélanger uniformément la matrice de la PCR.
2. Tube avec bouchon à vis une étiquette « sans OGM » et l’autre « test ».
3. Peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et mettez-la dans le mortier.
4. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec un pilon pendant 2 min former une boue.
5. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer avec un pilon jusqu'à ce que le coulis devient assez lisse à la pipette.
6. Pipetter 50 µL de lisier au sol pour le tube avec bouchon à vis contenant 500 µL de prémélange PCR étiqueté « sans OGM » à l’aide de la marque 50 µL sur une pipette jaugée. Reboucher le tube.
7. Répétez les étapes 1,3 et 1,6 pour préparer l’échantillon alimentaire.
8. Pipetter 50 µL de sol test alimentaire boue pour le tube avec bouchon à vis marqué « test ». Reboucher le tube.
9. Vortex du non-OGM alimentaires et test PCR tubes pour tubes de 1 min et place au bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. Si aucun vortex n’est disponible, mettez le tube plusieurs fois à mélanger avant de mettre dans le bain d’eau.
10. Placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Une pastille solide devrait former au fond du tube. Si le pellet n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pendant 2 min d’intervalle jusqu’en formes de granulés.
11. Tubes peuvent être utilisés immédiatement pour PCR ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

2. mise en place des réactions de PCR

1. Numéro tubes PCR 1 – 6 et leur initiale. Les numéros doivent correspondre au contenu tube suivants énuméré au tableau 1.
2. Placer chaque tube PCR identifié dans un microtube porte caps ouverts.
3. Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 µL de l’apprêt indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR. Tubes de Cap.
4. Avec une pointe fraîche pour chaque tube, ajouter 20 µL de l’échantillon d’ADN indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR, en veillant à ne Pipeter qu’à partir du surnageant et évitant le culot solid au fond des tubes.
5. Après que chaque échantillon d’ADN est reversé dans le tube PCR correspondant, utilisez la pipette pour mélanger l’ADN et l’amorce de pipetage doucement de haut en bas ; Reboucher les tubes.
6. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et programmer le cycler pour :
   Dénaturation initiale : 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min.
   Amplification : 40 cycles à 94 ° C pendant 1 min (dénaturer), 59 ° C pendant 1 min (recuit) et 72 ° C pendant 2 min (extension).
   Dernière Extension : 1 cycle à 72 ° C pendant 10 min.
   Tenez : 4 ° C indéfiniment.

3. préparation du Gel d’Agarose à 3 %

1. À l’aide de laboratoire ou ruban adhésif, solidement ruban l’extrémité ouverte du bac gel. S’assurer que le ruban est scellé sur les bords du plateau pour empêcher la fuite d’agarose fondu.
2. Peser avec 3 g d’agarose dans un erlenmeyer de 250 mL ou plu.
3. Ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 (acheté ou préparé à partir de concentré).
4. Utiliser une plaque magnétique avec une barre de remuer, chauffer le bol jusqu'à ce que le gel d’agarose est complètement dissous dans la mémoire tampon et la solution est en ébullition et se transforme en claire. Alternativement, un four à micro-ondes permet de placer le bécher au four et chauffage pour les intervalles de 30 s, en utilisant une tige d’agitation à mélanger toutes les 10 s, répéter jusqu'à ce que le mélange est en ébullition et tours clairs.
5. Inverser une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL dans l’ouverture du flacon 250 mL d’agir comme un reflux, empêchant d’agarose solution de s’évaporer.
6. Permettre d’agarose solution refroidir jusqu'à 60 ° C et verser de 30 à 50 mL dans chaque bac gel collées.
7. Placer un peigne de gel dans la première paire des encoches pour créer les puits du gel.
8. Laisser refroidir complètement avant d’enlever le ruban adhésif et un peigne. Gel va se solidifier et le tourner de clair à nuageux, quand prêt, environ 10-20 min.

4. électrophorèse des produits PCR

1. Placer un gel d’agarose pré-faites de 3 % sur un plateau de gel ou utiliser un plateau de gel qui a été utilisé pour monter un gel d’agarose coulé de 3 %.
2. Glisser le plateau de gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode (noir).
3. Versez 1 tampon de x TAE dans la chambre, assez d’avoir 2 mm de tampon au-dessus de la barre d’État gel.
4. Obtenir les tubes PCR du thermocycleur et dans porte-microtube.
5. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 µL d’acheté Orange G colorant (LD) pour chaque échantillon de chargement et bien mélanger.
6. Charge 20 µl de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel dans l’ordre indiquent (tableau 2).
7. Électrophorèse en exécution pendant 30 min à 100 V.
8. Retirer bac gel gel chambre et faites-le glisser pour retirer du plateau. Placer le gel dans un bac de coloration.
9. Immerger le gel dans la tache de gel ADN acheté pendant 5 min, secouant délicatement plateau pour aider à distribuer la tache dans le gel.
10. Transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec de l’eau du robinet (40-55 ° C) pendant environ 10 s.
11. Décolorer en lavant x 3 dans l’eau chaude du robinet pendant 6 min chaque avec agitant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.

Le tableau 1. Liste des numéros de tube approprié, amorces et des échantillons d’ADN.

Le tableau 2. L’ordre approprié pour charger 20 µL de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel.

Les aliments génétiquement modifiés sont des produits qui contiennent un ou plusieurs ingrédients dont l’ADN a été spécifiquement modifié. La présence de ces modifications peut être détectée à l’aide d’une technique appelée réaction en chaîne par polymérase.

La modification génétique des aliments a été une question controversée en raison de préoccupations débattues concernant la santé et la sécurité environnementale. La capacité de détecter de l’ADN génétiquement modifié dans des échantillons d’aliments d’intérêt permet de prendre des décisions éclairées sur la sécurité et les dangers potentiels de l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés, ou OGM, dans les approvisionnements alimentaires.

La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est utilisée pour amplifier l’ADN alimentaire afin de déterminer la présence ou l’absence de séquences génétiquement modifiées. L’électrophorèse sur gel tire ensuite l’ADN amplifié à travers une matrice de gel d’agarose et sépare les bandes d’ADN de différentes tailles qui correspondent à des marqueurs modifiés ou non modifiés. Ceux-ci sont ensuite comparés à des bandes de contrôle d’aliments connus pour contenir des OGM ou connus pour être sans modification.

Cette vidéo illustrera les principes qui sous-tendent la détection de l’ADN génétiquement modifié à partir d’échantillons alimentaires, comment extraire l’ADN et amplifier les marqueurs utilisés dans le processus de modification génétique, et comment la présence ou l’absence d’OGM dans les échantillons alimentaires peut être établie.

L’amplification en chaîne par polymérase identifie les séquences d’ADN qui ont été insérées dans l’aliment génétiquement modifié. L’ADN est une molécule relativement stable, de sorte que des fragments d’ADN viables adaptés à l’amplification peuvent être isolés même à partir de produits hautement transformés, comme les chips de maïs ou les hamburgers aux légumes. Un petit nombre de séquences d’ADN régulatrices sont utilisées pour contrôler l’expression des gènes insérés, de sorte que ces séquences sont présentes dans la majorité des cultures génétiquement modifiées. Cette procédure permet d’identifier deux des plus couramment utilisés, le gène promoteur 35S et le gène terminateur de la nopaline synthase. La séquence 35S est un puissant promoteur et, lorsqu’elle est attachée à un gène inséré, elle entraîne des niveaux d’expression constants et élevés. Le terminateur de la nopaline synthase est inclus pour arrêter la transcription du gène inséré au point final souhaité.

La PCR implique des cycles de chauffage et de refroidissement répétitifs dans un thermocycleur, une machine qui contrôle étroitement la température des tubes de réaction PCR. Chauffer l’échantillon à 94 ? C provoque la dénaturation et la séparation des brins d’ADN. Refroidissement rapide entre 45 et 65 ? C permet aux amorces de se recuire sur les brins d’ADN séparés. Enfin, réchauffer à 72 ? C permet à l’enzyme polymérase Taq d’étendre les amorces et de dupliquer complètement la région cible.

L’amorce végétale achetée est ajoutée à chaque échantillon et s’amplifiera dans les échantillons contenant de l’ADN végétal. Des modèles positifs pour les OGM pour 35S et NOS sont utilisés pour fournir un contrôle positif pour les OGM. Un produit certifié sans OGM est utilisé comme contrôle négatif. Si l’une de ces réactions de contrôle présente des bandes inattendues, les résultats des échantillons d’essai ne sont pas fiables.

L’ADN amplifié est passé à travers un gel d’agarose par électrophorèse. Les produits PCR sont mélangés à un colorant et chargés dans des puits. L’ADN est chargé négativement et, lorsqu’il est chargé dans le gel à l’extrémité cathodique de la chambre, il se déplace vers l’extrémité de l’anode lorsqu’un courant est appliqué. Les fragments d’ADN plus gros ne peuvent pas se déplacer aussi facilement à travers la matrice de gel et restent donc plus proches de la cathode, tandis que les séquences plus petites se déplacent vers l’extrémité de l’anode, ce qui entraîne la séparation d’ADN de tailles différentes en bandes distinctes.

Après l’électrophorèse, la coloration sur gel aide à visualiser les bandes d’ADN séparées.

Maintenant que nous connaissons les principes de la détection des OGM et de l’utilisation de la PCR et de l’électrophorèse pour l’identification des OGM, voyons comment cela peut être réalisé en laboratoire.

Une fois que les produits alimentaires d’intérêt ont été identifiés, l’analyse peut commencer. Pour extraire l’ADN, prenez deux tubes à bouchon à vis propres, et dans chacun d’eux transférez 500 ? L du réactif d’isolement de l’ADN acheté, en veillant à pipeter le mélange de haut en bas entre les aliquotes pour mélanger uniformément le réactif. Étiquetez l’un des tubes « sans OGM », et l’autre « Test ».

Ensuite, pesez 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et placez-les dans un mortier propre. Ajouter 2,5 ml d’eau distillée et broyer avec le pilon pendant 2 minutes pour former une bouillie. Ajoutez encore 2,5 ml d’eau distillée et continuez à broyer la boue jusqu’à ce qu’elle devienne suffisamment lisse pour être pipetée.

Pipette 50 ? L de la suspension connue sans OGM vers le tube à bouchon à vis étiqueté « sans OGM » contenant le réactif d’isolement de l’ADN. Ajoutez maintenant 50 ? L de la suspension de l’échantillon d’aliment d’essai dans le tube à bouchon à vis marqué « Test ». Vortex les deux tubes contenant les échantillons de nourriture et le réactif d’ADN pendant 1 min. Ensuite, placez les tubes dans un bain-marie à 95 ? C pendant 5 min. Enfin, placez les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Après examen, une pastille solide doit se former au fond du tube. Si une pastille ne se forme pas après 5 min, centrifugez à nouveau pendant 2 minutes d’intervalle jusqu’à ce qu’une pastille se forme. Les échantillons peuvent désormais être utilisés immédiatement pour la PCR ou conservés au réfrigérateur jusqu’à 1 semaine.

Tout d’abord, les tubes PCR numéro six. Ces numéros correspondront au contenu du tube indiqué dans le tableau. Placez chacun des tubes PCR étiquetés dans un support de microtubes avec les bouchons ouverts.

À l’aide d’une nouvelle douille pour chaque ajout, ajoutez 20 ? L indiquée dans le tableau de chaque tube PCR. Ensuite, ajoutez 20 ? L des échantillons d’ADN indiqués dans le tableau à chaque tube de PCR. Pipeter de haut en bas pour mélanger. Pour les échantillons en granulés, assurez-vous de ne pipeter qu’à partir du surnageant et évitez la pastille solide au fond des tubes. Enfin, placez les tubes PCR dans un thermocycleur et programmez-le pour qu’il passe par les étapes de chauffage et de refroidissement indiquées dans le tableau.

Placez un gel d’agarose à 3 % dans la chambre d’électrophorèse avec les puits les plus proches de l’extrémité de la cathode. Ajoutez un tampon TAE dans la chambre pour couvrir 2 mm au-dessus du plateau de gel. Récupérez les tubes PCR du thermocycleur et placez-les dans un support de microtubes. À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette à chaque fois, ajoutez 10 ? L de colorant de chargement d’ADN acheté à chaque échantillon et bien mélanger.

À l’aide d’une nouvelle pointe à chaque fois, chargez les puits du gel d’agarose avec 20 ? L de poids moléculaire règle dans un puits, et 20 ? L de chaque échantillon dans les puits subséquents, comme l’indique ce tableau. Réglez la chambre d’électrophorèse pour qu’elle fonctionne à 100 V pendant 30 min.

Une fois que le gel a fini de fonctionner, débranchez soigneusement la chambre de gel, retirez le plateau et glissez le gel dans un plateau de coloration. Plongez le gel dans la tache de gel 100x achetée pendant 5 minutes en secouant doucement le plateau pour répartir la tache. Une fois taché, transférez le gel dans un récipient de lavage et rincez à l’eau du robinet pendant environ 10 s. Décolorez en lavant trois fois à l’eau tiède du robinet pendant 3 minutes chacune, chacune en secouant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuez à décolorer à l’eau tiède jusqu’à ce que le contraste souhaité soit atteint.

La présence ou l’absence d’une bande de 200 pb dans le couloir 4 indique si l’aliment d’essai contient des OGM. Les amorces végétales déterminent si l’ADN de la plante a été extrait avec succès de l’échantillon. Le contrôle des aliments sans OGM est un indicateur de résultats faussement positifs, le cas échéant. Si le contrôle des aliments sans OGM s’avère positif, cela signifie que le PCR a été contaminé à un moment donné. Le contrôle des modèles positifs aux OGM est un indicateur de faux négatifs. Si le contrôle de la matrice GMO positif ne s’amplifie pas, il y a un problème avec la réaction PCR et un résultat GMO négatif de l’aliment testé n’est pas fiable.

Les gels peuvent être placés sur un papier blanc ou jaune pour fournir un arrière-plan contrasté afin de mettre en évidence les bandes d’ADN, ou un contraste accru peut être obtenu à l’aide d’une boîte à lumière UV.

La capacité d’analyser des denrées alimentaires ou des produits pour détecter la présence d’ingrédients génétiquement modifiés est pertinente pour un certain nombre d’applications scientifiques ou réglementaires.

Il existe des preuves que l’ADN transgénique des cultures génétiquement modifiées peut être introgressé dans les génomes des populations de cultures sauvages. Par exemple, les pollinisateurs peuvent faciliter ce transfert en fertilisant des plantes de type sauvage avec du pollen provenant d’une source génétiquement modifiée. Il s’agit d’une préoccupation, car les impacts de la propagation de ces gènes insérés sur l’ensemble des écosystèmes ne sont pas bien compris. Les tests PCR sur les populations sauvages peuvent fournir des données sur la propagation potentielle ou le confinement réussi des inserts génétiques.

L’absence d’étiquetage ou l’étiquetage incorrect des ingrédients génétiquement modifiés peut être une préoccupation pour les consommateurs. Cela peut être dû à la préférence du consommateur pour la consommation ou à l’introduction potentielle d’allergènes pendant le processus GM, bien que ce dernier soit controversé. Dans certains pays, les ingrédients génétiquement modifiés doivent être répertoriés sur les emballages alimentaires. Les organismes de réglementation de ces pays peuvent utiliser des tests PCR pour vérifier l’exactitude de l’étiquetage des aliments.

Lorsque la modification génétique introduite dans une culture confère une résistance aux pesticides, certaines études ont soulevé des inquiétudes quant à la production de « super-mauvaises herbes ». Essentiellement, il peut s’agir de toute plante qui n’est pas initialement ciblée pour la modification et qui obtient une résistance aux pesticides par des mécanismes tels que l’introgression ou l’hybridation. Ces plantes peuvent alors être en mesure de se propager avec plus de succès et être plus difficiles à contrôler que celles sans insert. Les tests PCR pour la modification génétique peuvent aider à mettre en évidence et à suivre ces populations potentielles afin de déterminer si cette propagation pourrait s’avérer problématique.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE aux tests pour les aliments OGM. Vous devriez maintenant comprendre les principes qui sous-tendent l’identification des aliments génétiquement modifiés à l’aide de la PCR, comment extraire et amplifier l’ADN des aliments et comment déterminer si votre échantillon d’aliment a été génétiquement modifié. Merci d’avoir regardé !