Tests pour identifier les aliments génétiquement modifiés

1. extraction de l’ADN d’échantillons de denrées alimentaires

1. Ajouter 500 µL de matrice de mélange acheté PCR à chacun des 2 tubes à bouchon vissé à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une micropipette µL de réglage du volume 200-1 000. Pipetter en haut et en bas avec la pipette entre chaque aliquote de mélanger uniformément la matrice de la PCR.
2. Tube avec bouchon à vis une étiquette « sans OGM » et l’autre « test ».
3. Peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et mettez-la dans le mortier.
4. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec un pilon pendant 2 min former une boue.
5. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer avec un pilon jusqu'à ce que le coulis devient assez lisse à la pipette.
6. Pipetter 50 µL de lisier au sol pour le tube avec bouchon à vis contenant 500 µL de prémélange PCR étiqueté « sans OGM » à l’aide de la marque 50 µL sur une pipette jaugée. Reboucher le tube.
7. Répétez les étapes 1,3 et 1,6 pour préparer l’échantillon alimentaire.
8. Pipetter 50 µL de sol test alimentaire boue pour le tube avec bouchon à vis marqué « test ». Reboucher le tube.
9. Vortex du non-OGM alimentaires et test PCR tubes pour tubes de 1 min et place au bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. Si aucun vortex n’est disponible, mettez le tube plusieurs fois à mélanger avant de mettre dans le bain d’eau.
10. Placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Une pastille solide devrait former au fond du tube. Si le pellet n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pendant 2 min d’intervalle jusqu’en formes de granulés.
11. Tubes peuvent être utilisés immédiatement pour PCR ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

2. mise en place des réactions de PCR

1. Numéro tubes PCR 1 – 6 et leur initiale. Les numéros doivent correspondre au contenu tube suivants énuméré au tableau 1.
2. Placer chaque tube PCR identifié dans un microtube porte caps ouverts.
3. Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 µL de l’apprêt indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR. Tubes de Cap.
4. Avec une pointe fraîche pour chaque tube, ajouter 20 µL de l’échantillon d’ADN indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR, en veillant à ne Pipeter qu’à partir du surnageant et évitant le culot solid au fond des tubes.
5. Après que chaque échantillon d’ADN est reversé dans le tube PCR correspondant, utilisez la pipette pour mélanger l’ADN et l’amorce de pipetage doucement de haut en bas ; Reboucher les tubes.
6. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et programmer le cycler pour :
   Dénaturation initiale : 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min.
   Amplification : 40 cycles à 94 ° C pendant 1 min (dénaturer), 59 ° C pendant 1 min (recuit) et 72 ° C pendant 2 min (extension).
   Dernière Extension : 1 cycle à 72 ° C pendant 10 min.
   Tenez : 4 ° C indéfiniment.

3. préparation du Gel d’Agarose à 3 %

1. À l’aide de laboratoire ou ruban adhésif, solidement ruban l’extrémité ouverte du bac gel. S’assurer que le ruban est scellé sur les bords du plateau pour empêcher la fuite d’agarose fondu.
2. Peser avec 3 g d’agarose dans un erlenmeyer de 250 mL ou plu.
3. Ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 (acheté ou préparé à partir de concentré).
4. Utiliser une plaque magnétique avec une barre de remuer, chauffer le bol jusqu'à ce que le gel d’agarose est complètement dissous dans la mémoire tampon et la solution est en ébullition et se transforme en claire. Alternativement, un four à micro-ondes permet de placer le bécher au four et chauffage pour les intervalles de 30 s, en utilisant une tige d’agitation à mélanger toutes les 10 s, répéter jusqu'à ce que le mélange est en ébullition et tours clairs.
5. Inverser une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL dans l’ouverture du flacon 250 mL d’agir comme un reflux, empêchant d’agarose solution de s’évaporer.
6. Permettre d’agarose solution refroidir jusqu'à 60 ° C et verser de 30 à 50 mL dans chaque bac gel collées.
7. Placer un peigne de gel dans la première paire des encoches pour créer les puits du gel.
8. Laisser refroidir complètement avant d’enlever le ruban adhésif et un peigne. Gel va se solidifier et le tourner de clair à nuageux, quand prêt, environ 10-20 min.

4. électrophorèse des produits PCR

1. Placer un gel d’agarose pré-faites de 3 % sur un plateau de gel ou utiliser un plateau de gel qui a été utilisé pour monter un gel d’agarose coulé de 3 %.
2. Glisser le plateau de gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode (noir).
3. Versez 1 tampon de x TAE dans la chambre, assez d’avoir 2 mm de tampon au-dessus de la barre d’État gel.
4. Obtenir les tubes PCR du thermocycleur et dans porte-microtube.
5. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 µL d’acheté Orange G colorant (LD) pour chaque échantillon de chargement et bien mélanger.
6. Charge 20 µl de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel dans l’ordre indiquent (tableau 2).
7. Électrophorèse en exécution pendant 30 min à 100 V.
8. Retirer bac gel gel chambre et faites-le glisser pour retirer du plateau. Placer le gel dans un bac de coloration.
9. Immerger le gel dans la tache de gel ADN acheté pendant 5 min, secouant délicatement plateau pour aider à distribuer la tache dans le gel.
10. Transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec de l’eau du robinet (40-55 ° C) pendant environ 10 s.
11. Décolorer en lavant x 3 dans l’eau chaude du robinet pendant 6 min chaque avec agitant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.

Nombre de tube	Apprêt	Échantillon d’ADN
1	Apprêt de plante 20 µL (vert)	Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
2	Apprêt de 20 µL OGM (rouge)	Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
3	Apprêt de plante 20 µL (vert)	Alimentaire de 20 µL test ADN
4	Apprêt de 20 µL OGM (rouge)	Alimentaire de 20 µL test ADN
5	Apprêt de plante 20 µL (vert)	Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL
6	Apprêt de 20 µL OGM (rouge)	Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL

Le tableau 1. Liste des numéros de tube approprié, amorces et des échantillons d’ADN.

Puits 1	1 contrôle des aliments Non-OGM végétaux amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 2	2 contrôle des aliments Non-OGM par OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 3	3 l’alimentation Test usine amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 4	4 aliments Test OGM amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 5	5 OGM ADN positif avec plante amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 6	6 OGM ADN positif avec OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Eh bien 7	Poids moléculaire de la PCR règle 20 µL.
Puits 8	Laissez vide.

Le tableau 2. L’ordre approprié pour charger 20 µL de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel.