2.4: Visualisation des micro-organismes du sol grâce aux lames de contact et à la microscopie

1. sol microcosme préparation

1. Recueillir le sol de jardin de la surface (0-6 "profondeur), et peser 150 g de sol dans deux tasses distinctes.
   1. Si le sol a haute densité de la matière organique, peser 100 g.
2. Une tasse de l’étiquette « traitement » et l’autre « contrôle. »
3. Calculer la quantité d’eau nécessaire pour modifier la teneur en humidité.
   1. Teneur en eau est souvent à proximité de la capacité au champ.
      
4. Quantité de mesure d’eau distillée avec une éprouvette graduée.
5. Versez la quantité d’eau distillée dans deux flacons.
6. Étiquette un flacon « Traitement » et l’autre « contrôle. »
7. Modifier l’eau dans le flacon de « Traitement » avec suffisamment de glucose pour une concentration de glucose sol finale de 1 %, selon une base de poids sec dans le sol de « Traitement ».
8. Ajouter 200 mg NH₄NO₃ dans le flacon de « Traitement » et remuez pour dissoudre les modifications. Le nitrate sert de source d’azote de nutriments pour les microbes du sol.
9. Modifier pas le flacon de « Contrôle ».
10. Dans de petites parties aliquotes d’environ 50 mg, mélanger le contenu de la fiole de « Traitement » dans la tasse de « Traitement ». Remuez avec une spatule après chaque addition aliquote.
11. Dans de petites parties aliquotes, mélanger le contenu de la fiole de « Contrôle » dans la tasse de « Contrôle ». Remuez avec une spatule après chaque addition aliquote.
12. Étiquette de quatre lames de microscope propre : deux « traitement » et deux lames de « Contrôler ».
13. Insérez les deux glissières de « Traitement » dans la coupe de sol « Traitement » et insérer les deux glissières de « Contrôle » dans la coupe de sol « Control ». Laisser 2 cm de chaque diapositive projetant au-dessus de la surface du sol et n’oubliez pas de laisser un espace entre les deux glissières.
14. Couvrir les coupes d’une pellicule plastique et le fixer avec un élastique.
15. Perforer l’enveloppe plusieurs fois pour permettre à l’air, mais toujours éviter une évaporation excessive.
16. Noter le poids de deux tasses.
17. Incuber les tasses remplies de sol à température ambiante dans une zone désignée/incubateur pendant 7 jours.

2. faire glisser la coloration et la microscopie

1. Noter le poids de deux tasses.
2. Calculer l’humidité du sol au moment de l’enlèvement de la diapositive.
3. Retirez les deux glissières de chaque tasse en appuyant sur chaque diapositive pour une position inclinée et en retirant donc la face supérieure de la lame n’est pas perturbée.
4. Identifier et marquer le côté de la diapositive à être colorés et observés.
5. Tapotez doucement les diapositives sur le dessus de banc pour éliminer les saletés importantes.
6. À l’aide d’un essuie-tout humide, nettoyer la face inférieure des diapositives. Sécher les lames à température ambiante.
7. Portant des lunettes de protection et tenant chaque diapositive avec une pince, plonger les lames dans 40 % (v/v) d’acide acétique pendant 1-3 min sous une hotte aspirante.
8. Nettoyez l’excès d’acide sous un léger courant d’eau.
9. À l’aide d’un compte-gouttes, couvrir la surface des lames avec phénoliques Rose Bengale. Soutenir la diapositive sur une coloration grille au-dessus d’un récipient pour attraper la tache d’excès. Attention, ne pas laver avec une force qui peut supprimer les micro-organismes de la surface des lames.
10. Tache les diapositives pour 5-10 min. ne laissez pas la diapositive devenir sec. Ajouter une tache plus que nécessaire.
11. Laver délicatement les lames pour enlever tache excédentaire.
12. Laissez que les lames sécher à température ambiante.
13. À l’aide de l’objectif à immersion d’huile, observer la diapositive à l’aide d’un microscope (Figure 1).

La figure 1. Une lame sous un microscope.

Les relations entre les différents organismes et les composants inorganiques du sol sont essentielles pour comprendre les changements du sol et les stress environnementaux, mais ne peuvent être élucidées sans visualisation directe.

Le sol, un système extrêmement complexe, est un habitat pour des millions d’organismes divers. La région du sol directement autour des racines des plantes en particulier, appelée rhizosphère, contient un éventail unique d’organismes qui sont directement influencés par les racines des plantes.

La composante abiotique, ou non biologique, de la rhizosphère comprend des particules inorganiques de taille et de forme variées qui contribuent à la texture du sol. La partie biotique ou biologique comprend les résidus végétaux, les racines, la matière organique et les micro-organismes.

Cette vidéo démontrera la visualisation directe des composantes biotiques et abiotiques du sol de la rhizosphère, afin de comprendre les facteurs affectant les changements du sol et de prédire les stress environnementaux.

Les organismes microscopiques ont tendance à résider dans l’eau située dans les pores du sol. Les bactéries sont parmi les organismes les plus simples et les plus abondants présents dans le sol et se trouvent dans de nombreuses morphologies, y compris des sphères appelées cocci, des bâtonnets appelés bacilles et des formes filamenteuses.

Les espèces fongiques, telles que les levures et les moisissures, sont les deuxièmes organismes les plus abondants dans le sol. Ils travaillent à décomposer et à recycler les matières organiques mortes. Les champignons filamenteux microscopiques diffèrent visuellement des autres micro-organismes, car ils possèdent de longs hyphes ramifiés qui libèrent des spores.

L’observation directe des relations entre ces organismes est difficile, mais peut être réalisée à l’aide d’un test sur lame de contact. Cette méthode est réalisée en immergeant une lame de verre dans le sol pendant plusieurs jours et en laissant les organismes et les particules de sol s’adsorber sur la surface de la lame.

La glissière est ensuite retirée en biais pour éviter le maculage de la surface. Les microbes sont fixés avec de l’acide acétique et colorés avec une coloration Rose Bengal pour permettre la visualisation par microscopie optique.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la technique de dosage sur lames de contact, jetons un coup d’œil au processus en laboratoire.

Tout d’abord, récupérez la terre du jardin de surface et transférez-la dans le laboratoire. Pesez 150 g de terre dans les 2 récipients séparés. Un contenant doit être étiqueté comme l’échantillon de traitement, qui sera modifié avec des nutriments pour favoriser la prolifération rapide des organismes. Étiquetez l’autre comme contrôle, qui sera inchangé.

Calculez la teneur en eau du sol à l’aide de la technique illustrée dans la vidéo Détermination de la teneur en humidité du sol de cette collection. Sur la base de ce calcul, déterminez la quantité d’eau dans le sol en fonction du poids sec. Calculez maintenant la quantité d’eau à ajouter pour donner une teneur en humidité du sol de 15 %. Cela amène l’humidité à la capacité du champ, ce qui est optimal pour la croissance des micro-organismes.

Mesurez la quantité calculée d’eau distillée à l’aide d’un cylindre gradué. Versez le volume d’eau calculé dans chaque récipient. En fonction du poids sec du sol déterminé au préalable, calculez la quantité de glucose nécessaire pour atteindre une concentration finale de glucose dans le sol de 1 % en masse, en utilisant la base du poids sec. Pesez cette quantité de glucose et ajoutez-la uniquement dans le récipient de traitement.

Pesez 200 mg de nitrate d’ammonium, puis ajoutez-le dans le récipient de traitement uniquement. Le nitrate d’ammonium sert de source de nutriments azotés pour les microbes du sol. Mélangez le terre, le glucose et le mélange de nitrate d’ammonium dans le récipient.

Ensuite, étiquetez 4 lames de microscope propres : deux comme traitement et deux comme contrôle. Insérez les deux lames de traitement dans le récipient du sol de traitement. Laissez une section de chaque lame exposée au-dessus de la surface du sol et assurez-vous qu’il y a un espace entre les deux lames.

Insérez les deux glissières de contrôle dans le récipient de sol témoin de la même manière. Couvrez les gobelets d’une pellicule plastique et fixez-les avec un élastique. Percez la pellicule plastique plusieurs fois pour permettre le transfert d’air, tout en empêchant une évaporation excessive.

Enfin, pesez les deux tasses, notez leur poids et incubez-les dans un endroit désigné à température ambiante pendant sept jours.

Après l’incubation de sept jours, calculez la teneur en humidité du sol en pesant les godets de terre. Déterminez si du poids a été perdu en raison de l’évaporation de l’eau et remplacez l’eau si nécessaire.

Retirez la pellicule plastique du récipient et retirez les deux lames du sol en appuyant sur chaque lame en position inclinée et en la retirant de manière à ce que la face supérieure de la lame ne soit pas dérangée.

Tapotez doucement les lames pour éliminer les grosses particules de terre. À l’aide d’un essuie-tout humide, nettoyez la face inférieure des lames. Laissez-les sécher à température ambiante dans une hotte. Une fois sèche, prenez une lame à l’aide d’une pince et plongez-la dans de l’acide acétique pendant 1 à 3 min.

Rincez le haut de la lame avec un léger jet d’eau distillée pour éliminer l’excès d’acide. Répétez ces étapes pour toutes les diapositives. Laissez les lames sécher à l’air.

Placez la lame sur une grille de coloration au-dessus d’un récipient pour récupérer l’excès de colorant. À l’aide d’un compte-gouttes, recouvrez délicatement la surface de chaque lame d’un colorant phénolique Rose Bengal. Laissez les lames se tacher pendant 5 à 10 min, en prenant soin d’ajouter plus de colorant au besoin pour garder les lames humides. Rincez doucement les lames à l’eau pour éliminer l’excès de tache et laissez les lames sécher à température ambiante.

Examinez les lames au microscope optique, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile. Le sol traité aura plus de microbes du sol.

Les interactions spatiales entre les organismes fongiques et bactériens dans des échantillons de sol typiques peuvent être facilement visualisées. Les particules de sol présentent des formes irrégulières sombres.

Les organismes fongiques présentent des hyphes filamenteux épais, tandis que les actinomycètes présentent des hyphes filamenteux minces.

Les bactéries se trouvent sous forme de petits cocci ou de bâtonnets, généralement en touffes, sur les particules de sol ou sur la doublure des hyphes fongiques.

L’isolement direct des organismes du sol est important pour la compréhension des caractéristiques du sol et de l’environnement.

Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds microscopiques qui parasitent les insectes. Bien qu’ils ne soient pas visualisés dans l’essai sur lames de contact, ils peuvent être isolés à partir d’échantillons de sol prélevés, comme le montre cet exemple.

Tout d’abord, les nématodes ont été appâtés dans le sol à l’aide d’insectes identifiés par examen visuel. Les nématodes ont été isolés des appâts d’insectes morts, en plaçant les insectes morts dans un environnement humide et sombre et en permettant aux nématodes de migrer dans l’eau environnante. Les nématodes ont ensuite été prélevés dans l’eau et analysés.

Les champignons filamenteux sont essentiels à la santé des sols en raison de leur rôle dans le recyclage des nutriments. L’isolement et l’observation de champignons filamenteux dans le sol ont été réalisés dans cet exemple.

Des échantillons de sol ont été dilués avec de l’eau et ajoutés à des plaques de gélose stériles à streptomycine Rose Bengal. La streptomycine a empêché la croissance bactérienne et a permis la croissance fongique. Les colonies fongiques ont été comptées et montées sur une lame de verre à l’aide de ruban adhésif. Les champignons ont ensuite été imagés à l’aide d’un microscope optique.

Les micro-organismes du sol décomposent naturellement les composants du sol, tels que les plantes et les organismes morts. La biodégradation et la colonisation des pellicules de plastique biodégradables ont été examinées, comme le montre cet exemple.

Les champignons ont été isolés à partir de films plastiques enfouis dans le sol pendant plusieurs mois. Les champignons ont ensuite été testés individuellement pour leur croissance sur des films plastiques. Des films plastiques ont ensuite été incubés avec la souche fongique sélectionnée sans milieu de croissance, afin d’observer la dégradation directe du plastique par les champignons.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’essai de lames de contact pour l’imagerie qualitative des microbes du sol. Vous devriez maintenant comprendre comment préparer la lame de contact et visualiser les microbes du sol. Merci d’avoir regardé !