Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l'endothélium microvasculaire

Ce vidéo montre une analyse par chambre d'écoulement à plaques parallèles permettant d'étudier les facteurs déclenchant le roulement des leucocytes sur les surfaces des cellules endothéliales. Des monocouches de cellules endothéliales sont stimulées avec l'interleukine-1 bêta, une cytokine pro-inflammatoire, afin d'augmenter l'expression du S-sélectine. La chambre d'écoulement à plaques parallèles est ensuite placée au-dessus des cellules endothéliales et des leucocytes positifs pour le S-sélectine sont perfusés sur la monocouche.

Les interactions cellulaires dans la chambre sont ainsi soumises à un cisaillement comparable à celui observé lors de l'adhésion des leucocytes dans les post-capillaires. Les événements de roulement sont capturés et dénombrés à l'aide de NIS elements et d'un test d'indépendance vis-à-vis de l'E-sélectine. Bonjour, je suis George Weis, dans le laboratoire du Dr. Charles de Nitro, au Département de Dermatologie de l'Hôpital Brigman pour femmes, Harvard Medical School.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'analyser le rôle de l'E-sélectine et des ligands de l'E-sélectine dans l'adhésion des leucocytes humains à des cellules endothéliales de moelle osseuse humaine dans des conditions d'écoulement sanguin physiologiques. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le rôle des molécules de surface cellulaire qui initient l'adhésion des globules blancs ou des cellules cancéreuses métastatiques aux cellules endothéliales, qui tapissent la surface interne des vaisseaux sanguins. Cet événement d'adhésion se caractérise par un comportement de roulement, semblable à une boule de bowling roulant sur une piste.

Commençons. La première étape de cette procédure consiste à préparer les cellules endothéliales qui tapisseront la chambre d'écoulement. Ce protocole utilise des cellules H-B-M-E-C 60 provenant de la moelle osseuse humaine.

Les boîtes de culture de microvasculature doivent être prérecouvertes avec de la fibronectine pour préparer celles-ci : incuber des boîtes de culture tissulaire de 35 millilitres avec du PBS contenant 20 microgrammes par millilitre de fibronectine. L'incubation peut être effectuée toute la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Suspendre les cellules H-B-M-E-C 60 dans le milieu 1 99 et les ensemencer à raison de 10 puissance cinq cellules par boîte ; faire croître les cultures jusqu'à une confluence supérieure à 90 %.

Cela prendra environ deux jours pour augmenter la sélection et l'expression. Aspirez le milieu de croissance et ajoutez un milieu frais contenant 50 nanogrammes par millilitre d'IL-1β. Incubez pendant quatre à six heures. Les monocouches cellulaires sont désormais prêtes pour le test en chambre d'écoulement. Des plaques supplémentaires de cellules H-B-M-E-C 60 peuvent être stimulées avec l'IL-1β et traitées avec un anticorps neutralisant anti-e-sélectine humaine à 20 microgrammes par millilitre pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Cela permettra de contrôler l'expression fonctionnelle de l'E-sélectine. Ensuite, préparez les leucocytes positifs pour l'E-sélectine. Il s'agit des cellules KG1a, des cellules progénitrices hématopoïétiques humaines.

Elles sont cultivées en suspension jusqu'à confluence ou jusqu'à atteindre six cellules par millilitre dans du RPMI 1640. Les cellules KG1a peuvent être prélevées directement à partir de la culture et comptées au cytomètre sanguin. Resuspendre les cellules à une concentration de 10⁶ cellules par millilitre dans du HBSS contenant 10 millimolaire de Hepes ou de tampon HH, et 2 millimolaire de chlorure de calcium.

Conserver les cellules sur de la glace jusqu'à ce qu'elles soient utilisées pour le test. Les étapes suivantes consistent à préparer le microscope, la chambre d'écoulement à plaques parallèles et la pompe à seringue. Pour le test, allumer le microscope et la pompe à seringue.

Sélectionnez l'objectif 10 x sur le microscope. Placez un tube conique de 50 millilitres dans le support et remplissez-le avec du tampon HH contenant deux millimolaires de chlorure de calcium. Ensuite, placez des tubes à essai en plastique de cinq millilitres dans le support situé en dessous.

Ensuite, insérez une seringue de 60 millilitres dans la pompe à seringue. Assurez-vous que le piston et le corps de la seringue sont bien fixés. Fixez un robinet en té à l'extrémité de la seringue de 60 ml, puis une seringue de 5 ml au robinet en té.

Placez l'appareil de chambre à écoulement parallèle sur la platine du microscope, avec le tube d'entrée à droite, le tube de sortie à gauche et le tube de vide à l'arrière. Une fois le raccordement des tubes au vide effectué, ouvrez la vanne d'air pour permettre à l'appareil à plaques parallèles de s'adhérer à la platine. Cela permettra de vérifier si la jupe d'étanchéité sous vide de la chambre d'écoulement est hermétique.

Lorsque le scellement est confirmé, fermez le robinet d'air. Reliez maintenant le tube de sortie au robinet en T déjà connecté à la seringue. L'appareil est désormais prêt à être placé au-dessus des cellules H-B-M-E-C 60.

Activez délicatement le vide, abaissez l'appareil de chambre d'écoulement sur la plaque et laissez l'appareil se fixer par aspiration. Aucun bruit de fuite d'air ne doit être audible ; à ce stade, vous devrez peut-être exercer une pression sur la chambre pour comprimer le joint en caoutchouc. Une fois le vide établi, placez le tube d'entrée dans le tube conique de 50 millilitres.

Ouvrez le robinet trois voies vers la seringue de 60 mil et placez la pompe en mode pompe pour éliminer l'air des lignes sans soulever les cellules sur la plaque. Utilisez la pompe à seringue réglée à deux mils par minute pour remplir le tube d'aspiration. Puis réglez rapidement à 0,5 mil par minute.

Juste avant que le fluide n'atteigne l'appareil, il est essentiel de purger soigneusement le dispositif et d'éviter les bulles d'air, qui pourraient soulever la monocouche depuis la plaque. Une fois que le fluide pénètre dans la seringue de 60 mil, la chambre d'écoulement et la pompe à seringue sont purgées. Fixez maintenant la chambre d'écoulement sur la platine à l'aide d'un morceau de ruban adhésif placé sur chacune des lignes d'entrée, de sortie et de vide.

Cela garantit que le champ de vision reste constant lors de la visualisation et de la collecte des données. La chambre d'écoulement est désormais prête à l'emploi. Ces étapes doivent être répétées pour chaque essai d'entrée cellulaire et pour chaque nouvelle plaque.

Pour capturer les événements de roulement sur le site Lucas, ouvrez NIS Elements sur le bureau, puis appuyez sur l'icône de lecture pour obtenir une image en direct. La mise au point automatique vous permettra de voir la plaque et de focaliser l'image. Assurez-vous que le microscope est correctement focalisé sur la monocouche cellulaire en ajustant manuellement la mise au point sur le microscope.

Une fois l'image au point, réinitialisez l'exposition à une image par seconde et ajustez la lumière du microscope. L'image doit apparaître sur l'ordinateur et ne doit plus être visible dans le microscope. L'histogramme de lumière peut ensuite être ajusté afin d'éliminer l'exposition de fond ou d'améliorer la clarté des cellules ; cliquez sur binning deux par deux ou binning en direct pour obtenir une image idéale pour l'acquisition de vidéos.

Cliquez sur macro dans la barre de menu et sélectionnez « droit vers port », choisissez le port com trois, puis ouvrez. Cela ouvre le port pour synchroniser avec la pompe à seringue. La chambre d'écoulement est désormais prête à être remplie avec les cellules KG1a : pipetez un millilitre de suspension de KG1a dans le tube à essai de cinq millilitres situé près de la ligne de tubulure d'entrée.

Ensuite, placez la ligne d'entrée au fond du tube à essai. Accédez à la barre de menu et cliquez sur « capture » et « acquisition en laps de temps ». Sélectionnez le protocole d'une durée de 210 secondes.

Il s'agit de la durée du programme pour le roulement sur les cellules H-B-M-E-C 60. Chaque phase est programmée pour prendre une image chaque seconde pendant toute la durée du protocole de pompe. Elle est également configurée pour envoyer une commande via le port comm trois afin de démarrer la pompe.

Régler la pompe à seringue en mode programmation, ce qui permet la programmation manuelle de débits spécifiques. Ceci déterminera les niveaux de contrainte de cisaillement dans la chambre et régulera les interactions entre les cellules KG1a et les cellules H-B-M-E-C 60. Les paramètres pour ces interactions sont de 4,2 dynes par centimètre carré pendant 45 secondes.

Point trois dines par centimètre carré pendant 60 secondes, puis augmentation progressive toutes les 15 secondes jusqu'à un maximum de 4,2 dines par centimètre carré. Le microscope et l'ordinateur sont désormais prêts à capturer la photographie en lapse de temps. Appuyez sur Démarrer l'exécution sur l'ordinateur pour commencer l'acquisition des données tout en exécutant le programme.

Veillez à ajouter du milieu dans le tube contenant les cellules KG une A afin de maintenir les tubulures d'entrée et de sortie remplies de milieu et d'empêcher les bulles d'air de pénétrer dans le système. Si l'intervalle de temps est interrompu, la pompe ne s'arrêtera pas automatiquement et devra être réinitialisée. Appuyez sur annuler pour revenir à l'image en direct.

Une monocouche de cellules endothéliales non stimulées sert de contrôle négatif pour cette expérience. Pour ce faire, perfuser des leucocytes KG1a dans la chambre d'écoulement au-dessus de cellules HBMEC-60 non traitées afin de contrôler l'indépendance par rapport à la sélectine E, stimuler la monocouche de cellules endothéliales avec l'IL-1β, puis perfuser les leucocytes au-dessus de ces cellules afin de renforcer le contrôle de l'indépendance vis-à-vis de l'effet. Traiter les cellules HBMEC-60 avec l'IL-1β, puis avec un anticorps anti-sélectine S humaine.

Ensuite, analyser les événements de roulement des leucocytes sur ces cellules. Le roulement cellulaire est déterminé non seulement par la sélectine S, mais aussi par les résidus d'acide sialique présents à la surface des cellules leucocytaires. Pour le démontrer, digérer les cellules KG1a avec 0,1 unité par millilitre de neuraminidase pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, analyser les événements de roulement sur les cellules H-B-M-E-C 60 stimulées. Les glycoprotéines présentes à la surface des leucocytes jouent également un rôle important dans le roulement cellulaire. Cela peut être démontré en traitant les cellules KG une A avec 0,2 unité par millilitre de broma-lane pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis en les infusant dans la chambre d'écoulement.

Une fois la séquence temporelle acquise, les données sont prêtes à être analysées. Enregistrez les données, allez dans l'onglet mesurer de la barre de menu et sélectionnez seuil défini. Déplacez les barres afin que les cellules souhaitées soient colorées en rouge, sélectionnez toutes les images, puis cliquez sur OK ; toute la séquence en laps de temps doit maintenant être modifiée, avec des cellules roulantes visibles en rouge.

Accédez à mesurer et sélectionnez les restrictions. Cela permet à l'utilisateur d'exclure les objets seuils qui ne représentent pas des cellules roulantes. Il s'agit principalement du fond créé par la monocouche H-B-M-E-C 60 ; sélectionnez la zone et saisissez les valeurs minimales et maximales, qui sont idéales pour les leucocytes roulants.

Répétez cette étape pour l'élongation et la circularité. Sélectionnez « Measure » puis choisissez « Create Binary » en utilisant les restrictions. Les mêmes valeurs de restriction, définies à l'étape précédente, seront désormais utilisées pour optimiser le logiciel NIS Elements afin de reconnaître les leucocytes roulants sur la monocouche de cellules endothéliales. Revenez à « Measure », sélectionnez « Field Data », puis choisissez « Reset Data ».

Fermez le menu, revenez à la mesure et sélectionnez le champ de numérisation, ouvrez les données du champ de mesure, puis sélectionnez le nombre ou les objets. Ensuite, sélectionnez tous les champs et exportez les données vers Microsoft Excel. Enfin, sélectionnez effacer les données.

Les éléments NIS sont désormais prêts pour une collecte supplémentaire de données. Ces données représentatives montrent comment les interactions entre les leucocytes et les cellules endothéliales réagissent au stress de cisaillement physiologique, en testant spécifiquement le rôle du ligand adhésif E-sélectine.

Un roulement robuste des leucocytes se produit lorsque les cellules endothéliales sont préalablement stimulées par l'IL-1β. En comparant ce résultat avec le témoin non stimulé, il est clair que le roulement cellulaire dépend de la stimulation par les cytokines. En traitant les cellules H-B-M-E-C 60 avec l'IL-1β, puis avec un anticorps anti-sélectine E humaine, il devient évident que le roulement cellulaire dépend spécifiquement de la sélectine E.

Cet essai peut également être utilisé pour tester d'autres paramètres. Par exemple, lorsque les cellules stimulées sont prétraitées avec une sase ou avec du brolin, les résultats sont moins robustes. Ces données soulignent l'importance des résidus d'acide slic terminal ainsi que des glycoprotéines de surface cellulaire.

Pour l'activité du ligand de la sélectine S, nous venons de vous montrer comment analyser les interactions adhésives médiées par la sélectine E entre les leucocytes et les cellules endothéliales dans des conditions qui imitent les forces présentes dans une veinule postcapillaire, la région du système circulatoire où les leucocytes quittent le sang pour pénétrer dans les tissus. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser un anticorps bloquant approprié ou un contrôle de traitement enzymatique afin de valider la nécessité de la sélectine respective et de son ligand dans ce système de dosage. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.