Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l'endothélium microvasculaire

Cette vidéo montre l’analyse parallèle de la chambre d’écoulement des plaques pour examiner les facteurs qui déclenchent le roulement des leucocytes sur les surfaces des cellules endothéliales. Les monocouches de cellules endothéliales sont stimulées par la cytokine pro-inflammatoire IL one bêta pour réguler à la hausse l’expression de la sélectine S. La chambre d’écoulement à plaques parallèles est ensuite placée sur les cellules endothéliales et des leucocytes positifs à la sélectine S sont perfusés sur la monocouche.

Les interactions cellulaires dans la chambre sont ainsi transmises avec un stress pur qui est similaire à celui de l’adhésion post-capillaire des leucocytes. Les événements glissants sont capturés et énumérés à l’aide d’éléments NIS et d’un test pour l’indépendance de la sélection E. Bonjour, je suis George Weis dans le laboratoire du Dr Charles de Nitro au département de dermatologie du Brigman Women’s Hospital, Harvard Medical School.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’analyse du rôle de la sélectine e, des ligands de la sélectine E dans l’adhésion des leucocytes humains aux cellules endothéliales de la moelle osseuse humaine dans des conditions de flux sanguin physiologiques. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le rôle des molécules de surface cellulaire qui initient l’adhésion des globules blancs ou des cellules cancéreuses métastatiques aux cellules endothéliales, qui tapissent la surface interne des vaisseaux sanguins. Cet événement adhésif se caractérise par un comportement de roulement comme une boule de bowling roulant sur une piste.

Alors commençons. La première étape de cette procédure consiste à préparer les cellules endothéliales qui tapisseront la chambre d’écoulement. Ce protocole utilise des cellules H-B-M-E-C 60 dérivées de la moelle osseuse humaine.

boîtes de culture microvasculaire doivent être pré-enrobées de fibronectine pour préparer ces boîtes de culture tissulaire incubées de 35 millilitres avec PBS contenant 20 microgrammes par mil de fibronectine. Ceux-ci peuvent être incubés pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Suspendre H-B-M-E-C 60 cellules dans le milieu 1 99 et semer à 10 à la cinquième cellules par boîte, faire croître les cultures à plus de 90 % de confluence.

Cela prendra environ deux jours pour réguler à la hausse e sélectionner et exprimer le milieu de croissance et ajouter un milieu frais avec 50 nanogrammes par mil d’IL un bêta incuber pendant quatre à six heures. Les monocouches cellulaires sont maintenant prêtes pour le test en chambre d’écoulement. Des plaques supplémentaires de cellules H-B-M-E-C 60 peuvent être stimulées avec IL one bêta et traitées avec un anticorps neutralisant anti-sélectine e humaine à 20 microgrammes par mil pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Cela contrôlera l’expression fonctionnelle de e selectin. Ensuite, préparez les leucocytes positifs à la sélectine. Il s’agit de KG l’une des cellules progénitrices hématopoïétiques humaines.

Ceux-ci sont cultivés en suspension jusqu’à la confluence ou tendent vers les six cellules par mil dans RPMI 1640. Les cellules KG one A peuvent être pipetées directement à partir de la culture et comptées sur un hémocytomètre. Resus suspend les cellules à 10 à six cellules par mil dans HBSS avec un tampon hep ou HH de 10 millimolaires contenant deux millimolaires de chlorure de calcium.

Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient dosées. Les étapes suivantes consistent à préparer le microscope, la chambre d’écoulement à plaques parallèles et le pousse-seringue. Pour le dosage, allumez le microscope et le pousse-seringue.

Sélectionnez l’objectif 10 x sur le microscope. Placez un tube conique de 50 millilitres dans le support et remplissez-le d’un tampon HH avec deux millimolaires de chlorure de calcium. Placez ensuite des tubes à essai en plastique de cinq millilitres dans le support ci-dessous.

Ensuite, mettez une seringue de 60 millilitres dans le pousse-seringue. Assurez-vous que le piston et le corps de la seringue sont bien fixés. Fixez un robinet d’arrêt à trois voies à l’extrémité de la seringue de 60 mil, puis une seringue de cinq mil au robinet d’arrêt à trois voies.

Placez l’appareil à chambre d’écoulement parallèle sur la platine du microscope avec le tube d’entrée à droite, le tube de sortie à gauche et le tube à vide à l’arrière. Une fois le tube connecté au vide, ouvrez la soupape d’air pour permettre à l’appareil à plaques parallèles d’adhérer à la platine. Cela permettra de vérifier si la jupe à vide de la chambre d’écoulement est étanche à l’air.

Lorsque le sceau est confirmé, fermez la vanne d’air. Fixez maintenant la conduite de sortie de la tubulure au robinet d’arrêt à trois voies déjà connecté à la seringue. L’appareil est maintenant prêt à être placé sur les cellules H-B-M-E-C 60.

Allumez l’aspirateur, abaissez doucement l’appareil à chambre d’écoulement sur la plaque et laissez l’appareil aspirer vers le bas. Il ne devrait y avoir aucun bruit d’air s’échappant et à ce stade, vous devrez peut-être appliquer une pression sur la chambre pour comprimer le joint en caoutchouc. Une fois le vide établi, placez le tube d’entrée dans le tube conique de 50 millilitres.

Ouvrez le robinet d’arrêt à trois voies de la seringue de 60 mil et placez la pompe en mode pompe pour évacuer l’air des conduites sans soulever les cellules de la plaque. Utilisez la pompe à seringue réglée à deux mils par minute pour remplir le tube d’admission. Ensuite, réglez rapidement à 0,5 mils par minute.

Juste avant que le fluide n’atteigne l’appareil, il est essentiel d’amorcer soigneusement la configuration et d’éviter les bulles d’air, qui soulèveront la monocouche de la plaque. Une fois que le fluide se déplace dans la seringue de 60 mil, la chambre d’écoulement et la pompe à seringue sont amorcées. Maintenant, fixez le flux dans la chambre à la platine avec un morceau de ruban adhésif sur chacune des lignes d’entrée, de sortie et de vide.

Cela garantit que le champ de vision reste constant lors de la visualisation et de la collecte des données. La chambre d’écoulement est maintenant prête à l’emploi. Ces étapes doivent être répétées pour chaque passage d’entrée de cellule et pour chaque nouvelle plaque.

Pour capturer les événements de propagation du site Lucas, ouvrez les éléments NIS sur le bureau, appuyez sur l’icône de lecture pour obtenir une image en direct. L’exposition automatique vous permettra de voir la plaque et de faire la mise au point sur l’image. Assurez-vous que le microscope est correctement mis au point sur la monocouche cellulaire en ajustant manuellement la mise au point sur le microscope.

Une fois l’image nette, réinitialisez l’exposition à une image par seconde et ajustez la lumière sur le microscope. L’image doit apparaître sur l’ordinateur et ne doit plus être visible au microscope. L’histogramme de la lumière peut ensuite être ajusté Pour supprimer l’exposition de l’arrière-plan ou améliorer la clarté des cellules, cliquez sur la corbeille deux par deux ou la corbeille dynamique pour obtenir une image idéale pour la capture vidéo.

Cliquez sur macro dans la barre de menu et sélectionnez à droite pour sélectionner le port, sélectionnez le port com trois et ouvrez. Cela ouvre le port pour se coordonner avec le pousse-seringue. La chambre d’écoulement est maintenant prête à être infusée avec KG : une pipette à cellules A, un mil de KG et une suspension A S dans le tube à essai de cinq mil près de la ligne de tube d’entrée.

Placez ensuite la ligne d’entrée au fond du tube à essai. Allez dans la barre de menu et cliquez sur capture et acquisition en accéléré. Sélectionnez le protocole d’une durée de 210 secondes.

Il s’agit de la durée du programme de roulage sur cellules H-B-M-E-C 60. Chaque phase est programmée pour prendre une photo toutes les secondes pendant la durée du protocole de pompe. Il est également configuré pour envoyer une commande via le port comm trois pour démarrer la pompe.

Réglez la pompe à seringue en mode programme, ce qui permet de programmer manuellement des débits spécifiques. Cela déterminera les niveaux de contrainte à l’intérieur de la chambre et dictera les interactions des cellules KG un A sur les cellules H-B-M-E-C 60. Les paramètres de ces interactions sont de 4,2 dinés par centimètre carré pendant 45 secondes.

Le point de trois dines par centimètre carré pendant 60 secondes et les écarts augmentent toutes les 15 secondes jusqu’à un maximum de 4,2 dines par centimètre carré. Le microscope et l’ordinateur sont maintenant prêts à capturer des photographies en accéléré. Appuyez sur start run sur l’ordinateur pour commencer à acquérir des données tout en exécutant le programme.

Assurez-vous d’ajouter du fluide dans le tube contenant KG une cellule A afin de maintenir le tube d’entrée et de sortie plein de fluide et d’empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le système. Si le laps de temps est interrompu, la pompe ne s’arrêtera pas d’elle-même et doit être réinitialisée. Appuyez sur annuler pour revenir à l’image en direct.

Une monocouche de cellules endothéliales non stimulées sert de contrôle négatif pour cette expérience. Pour ce faire, perfuser des leucocytes KG un A dans la chambre d’écoulement sur des cellules H-B-M-E-C 60 non traitées pour contrôler l’indépendance de la sélection e, stimuler la monocouche de cellules endothéliales avec IL un bêta et infuser les leucocytes sur ces cellules pour contrôler davantage l’indépendance eect. Traiter les cellules H-B-M-E-C 60 avec IL un bêta puis avec l’anticorps sélectine anti-humain S.

Analysez ensuite les événements de roulement leucocytaire sur ces cellules. Le roulement cellulaire n’est pas seulement déterminé par la sélectine S, mais aussi par les résidus d’acide slique à la surface des cellules leucocytaires. Pour montrer cela, digérez les cellules KG un A avec 0,1 unité par mil de neuraminidase pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Analysez ensuite les événements de roulement sur les cellules H-B-M-E-C 60 stimulées. Les glycoprotéines à la surface des leucocytes sont également importantes pour le roulement cellulaire. Cela peut être démontré en traitant les cellules KG un A avec 0,2 unité par mil broma lane pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis en les infusant dans la chambre d’écoulement.

Une fois la séquence temporelle acquise, les données sont prêtes pour l’analyse. Enregistrez les données et allez dans l’onglet Mesure de la barre de menu et sélectionnez le seuil défini. Déplacez les barres pour que les cellules souhaitées soient colorées en rouge, sélectionnez toutes les images, puis d’accord, toute la séquence time-lapse doit maintenant être modifiée avec des cellules rouges visibles qui défilent.

Allez dans mesurer et sélectionnez restrictions. Cela permet à l’utilisateur d’exclure les objets de seuil qui ne représentent pas des cellules glissantes. Il s’agit principalement d’un arrière-plan créé par la zone de sélection monocouche H-B-M-E-C 60 et de valeurs minimales et maximales d’entrée, qui sont idéales pour les leucocytes roulants.

Répétez cette étape pour l’allongement et la circularité : sélectionnez Mesurer, puis sélectionnez Créer un fichier binaire à l’aide de restrictions. Les mêmes valeurs de restriction, qui ont été définies à l’étape précédente, seront maintenant utilisées pour optimiser le logiciel NIS elements pour reconnaître les leucocytes roulants sur la monocouche de cellules endothéliales. Revenez à la mesure, sélectionnez les données de champ, puis sélectionnez Réinitialiser les données.

Fermez le menu, revenez à la mesure et sélectionnez Champ de balayage, ouvrez les données du champ de mesure et sélectionnez le nombre ou les objets. Sélectionnez ensuite tous les champs et exportez les données vers Microsoft Excel. Enfin, sélectionnez Effacer les données.

NIS elements est maintenant prêt pour une plus grande collecte de données. Ces données représentatives montrent comment les interactions entre les cellules endothéliales leucocytaires réagissent au stress physiologique pur, en testant spécifiquement le rôle du ligand adhésif. E selectin.

Le roulement leucocytaire robuste se produit lorsque les cellules endothéliales sont préstimulées avec IL un bêta. En comparant ce résultat avec le contrôle non stimulé, il est clair que le roulement cellulaire dépend de la stimulation par les cytokines. En traitant les cellules H-B-M-E-C 60 avec IL un bêta puis avec l’anticorps anti-sélectine E humain, il devient clair que le roulement cellulaire dépend spécifiquement de la sélectine e.

Ce test peut également être utilisé pour tester d’autres paramètres. Par exemple, lorsque les cellules stimulées sont prétraitées avec un sase ou avec de la broline, les résultats sont moins robustes. Ces données mettent en évidence l’importance des résidus d’acide slique terminal ainsi que des glycoprotéines de surface cellulaire.

Pour l’activité du ligand S selectin, nous venons de vous montrer comment analyser les interactions adhésives basées sur la sélectine entre les leucocytes et les cellules endothéliales dans des conditions qui imitent les forces présentes dans un vénal post-capillaire, la région du système circulatoire où les leucocytes quittent le sang et pénètrent dans les tissus. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser l’anticorps bloquant approprié ou le contrôle du traitement enzymatique pour valider la nécessité de la sélectine respective et de son ligand dans ce système de test. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.