2.3: Coloration de Gram des bactéries provenant de sources environnementales

1. le prélèvement

1. Recueillir des échantillons de sol et le transport au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Dans le laboratoire, peser un échantillon de 10 g à l’aide d’une balance analytique.
3. Diluer l’échantillon 01:10 dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (10 pièces sol équivaut à 5 parties liquide aqueux) et vortex de mélanger (Figure 2, étape 1).
4. Effectuer ultérieures 01:10 sur le sol des dilutions jusqu'à au moins 10^-5 g / mL, et plaque de propagation sélectionné dilutions dans réplicats de deux ou trois sur un milieu gélose nutritive faible (p. ex., R2A) (Figure 2, les étapes 2 - 3).
5. Incuber les boîtes pendant une semaine à température ambiante (Figure 2, étape 4).
6. Sélectionnez une ou deux colonies pour l’isolement et ensemencer sur plaques de gélose fraîche (Figure 3, les étapes 1-3).
7. Incuber les boîtes de strie pendant deux ou trois jours à température ambiante (Figure 3, étape 4).

2. préparation des frottis bactériennes

1. Observer les plaques strie des colonies isolées.
2. Pour préparer chaque préparation de frottis, trempez une boucle inoculer dans l’éthanol, flamme-les stériliser et placer 1 à 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de lames de verre préalablement nettoyé.
3. Stérilisez la boucle inoculer à nouveau comme décrit précédemment. Une fois refroidi, prélever une petite quantité de la culture d’une seule colonie isolée et mélangez-le avec les gouttelettes d’eau sur la lame (le frottis doit ressembler à du lait écrémé dilué). La boucle à inoculation doit être refroidie avant l’isolement de la colonie. Une boucle qui est trop chaude qui entraîne la colonie et/ou moyen pour éviter les éclaboussures, qui peut conduire à l’aérosolisation de bactéries. En règle générale, lorsque la boucle est trop chaude pour une utilisation, un « sifflement » sera entendu lorsque appliqué à la gélose ou colonie. Un refroidissement de la boucle peut entraîner également au transfert de la culture-pour-slide moins efficace et les distorsions de la morphologie cellulaire.
4. Etaler le frottis sur la surface de la lame mesure environ 2,5 cm x 2,5 cm et laisser sécher à l’air. Il est important pour l’air de séchage pour se produire dans des conditions d’écoulement laminaire. Diapositives pas devraient être soufflés sec de manière à ne pas perturber le frottis. En outre, diapositives ne doivent pas être séchées flamme, afin de maintenir la morphologie cellulaire.
5. Après séchage, chaleur fixer le frottis en passant les glissent rapidement dans une flamme 2-3 x. La diapositive ne devrait pas être tenue stationnaire dans la flamme, pour éviter des distorsions de la morphologie cellulaire et/ou de dommages à la lame de verre.

3. coloration de gram

1. Fixez la lame à une extrémité à l’aide d’une pince à linge propre.
2. Recouvrir le frottis avec cristal violet (colorant primaire) et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 min.
3. Laver soigneusement la lame avec de l’eau distillée. Le jet d’eau ne devrait pas être dirigé contre le frottis afin d’éviter des dommages et/ou au décollement de la lame de verre.
4. Recouvrir le frottis à l’iode de Gram et maintenez pendant 2 min, puis rincer doucement la lame avec de l’eau.
5. Décolorer le frottis à l’aide d’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus de la lame (cela prend généralement pas plus de 20 s selon l’épaisseur du frottis), puis rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Cette étape est essentielle pour éviter une décoloration de la diapositive, qui peut conduire à une fausse gramme tache désignation (c.-à-d., Gram variable).
6. Ajouter le contre-colorant (safranine) pour le frottis et maintenez-le enfoncé pendant 30 s. Puis rincer doucement la lame avec de l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant.

4. microscopique Observation de diapositives

1. Observer les diapositives à l’aide de basse (par exemple, 4 X ou 10 X), haute-sèche (par exemple, 40 X), mais les objectifs à immersion (100 X) d’huile. Pour immersion dans l’huile, ajouter l’huile directement sur le frottis.
2. Pour obtenir des résultats représentatifs de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, voir Figures 4 et 5.

Figure 2. Dilution et Technique de propagation-Plating. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Isolement de colonie en utilisant la Technique de plaque Streak.

Figure 4. Bactérie Gram-positive de sol Staphylococcus aureus .

Figure 5. Bactérie Gram-négative de sol Escherichia coli.

La coloration de Gram permet une visualisation rapide de la morphologie bactérienne et une large distinction cellulaire à partir d’un large éventail d’échantillons environnementaux. Pour tacher les bactéries, une tache uniforme est appliquée sur une face en verre et laissée sécher. Après la fixation thermique du frottis, du violet cristallin est appliqué.

Un agent décolorant rince le violet cristallin des cellules à Gram négatif, mais pas des cellules à Gram positif. Un deuxième colorant, généralement de la safranine, est utilisé comme colorant de fond pour visualiser les cellules à Gram négatif. Une fois colorées, les cellules peuvent être évaluées pour la morphologie, la taille et la disposition des cellules, telles que les chaînes ou les grappes.

Cette vidéo montrera comment préparer un échantillon environnemental, isoler les espèces bactériennes qui s’y trouvent et effectuer une coloration de Gram sur les colonies isolées

La coloration de Gram permet de catégoriser la plupart des bactéries en deux grandes classes structurelles : Gram-positif et Gram-négatif. Bien que les deux classes aient une membrane plasmique phospholipidique sous-jacente, la structure de la paroi cellulaire varie considérablement. La paroi cellulaire à Gram positif est principalement composée d’une épaisse couche de peptidoglycane, qui est un polymère composé de sucres et d’acides aminés. Les parois cellulaires à Gram négatif ont une couche plus mince de peptidoglycane, prise en sandwich entre une deuxième membrane lipidique. Cette membrane externe contient généralement des lipopolysaccharides.

Le violet cristallin chargé positivement se lie faiblement à la paroi cellulaire bactérienne chargée négativement. L’iode de Gram forme un complexe insoluble avec le colorant violet cristallin, le fixant ainsi dans la paroi cellulaire.

Au cours de l’étape de décoloration, le peptidoglycane dans les cellules à Gram positif est déshydraté, ce qui le fait se contracter et piéger les complexes cristallins violet-iode. Dans les cellules à Gram négatif, l’agent décolorant compromet la membrane externe, augmentant ainsi sa porosité. Cela permet aux complexes cristallins violet-iode d’être éliminés.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la coloration de Gram des bactéries du sol, voyons le processus effectué sur les bactéries du sol en laboratoire.

Après avoir prélevé un échantillon de sol sur le terrain, apportez-le au laboratoire pour analyse. Affinez l’échantillon à l’aide d’un tamis et pesez 10 g de sol tamisé à l’aide d’une balance analytique.

Diluer l’échantillon dans 95 mL de solution saline tamponnée au phosphate et de vortex pour mélanger. Effectuez 1 à 10 dilutions supplémentaires, en tourbillonnant entre chaque dilution. Transvaser des aliquotes d’au moins 3 dilutions successives sur des plaques d’agarose à faible teneur en nutriments.

Après la stérilisation à la flamme d’éthanol et le refroidissement d’une tige de verre pliée en tapotant sur le support, étalez l’échantillon sur la surface des plaques. Incuber les plaques à température ambiante. Après une incubation de 3 à 5 jours, sélectionnez la dilution la plus élevée avec 30 à 300 colonies distinctes. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, sélectionnez les colonies d’intérêt pour l’isolement.

Étalez la colonie sur une section d’une assiette fraîche. En stérilisant la boucle entre les stries, faites des stries successives en zigzag sur chaque section de la plaque pour permettre l’isolement ultérieur de colonies uniques discrètes. Incuber les plaques pendant 1 à 2 jours à température ambiante.

Pour commencer la préparation des frottis bactériens, fixez une pince à une lame de verre pré-nettoyée pour faciliter la manipulation. Pour chaque frottis bactérien, nettoyez et stérilisez à la flamme une boucle d’inoculation. Placez 2 boucles d’eau distillée stérile au centre de la lame.

Après avoir stérilisé à nouveau l’anse, prélevez une petite quantité de culture d’une colonie isolée et mélangez-la à l’eau sur la lame. Il est important de refroidir la boucle avant de toucher la culture en tapotant plusieurs fois une portion non inoculée de gélose. Le frottis doit ressembler à du lait dilué. Laissez la lame sécher à température ambiante. Après séchage, fixez la chaleur en la faisant passer rapidement à travers une flamme.

Une fois sec, pipetez le violet cristallin sur le frottis et laissez reposer pendant 2 à 3 minutes. Rincez soigneusement la lame à l’eau distillée en orientant le flux direct vers le haut de la lame, permettant à l’eau de s’écouler doucement vers le bas. Ne dirigez pas le débit d’eau directement vers le frottis.

Couvrez la diapositive avec de l’iode de Gram. Au bout de 2 min, rincer délicatement à l’eau distillée. Décolorez la lame avec de l’éthanol à 95 % jusqu’à ce que la tache ne disparaisse plus. Rincer immédiatement à l’eau distillée. Cela limitera la décoloration excessive du frottis.

Ajouter la safranine comme contre-coloration au frottis pendant 30 s. Cela tachera toutes les cellules à Gram négatif présentes. Rincez doucement à l’eau distillée et séchez avec du papier absorbant. Observez la lame résultante avec un microscope. Utilisez d’abord un objectif de faible puissance pour effectuer des réglages grossiers et trouver une partie idéale du frottis avant de passer au champ de vision plus petit des grossissements les plus élevés.

Après une imagerie plus poussée et un ajustement du frottis avec un objectif de puissance moyenne, ajoutez de l’huile d’immersion directement sur le frottis. L’huile est nécessaire pour les objectifs de haute puissance qui fourniront les meilleures micrographies. Les bactéries à Gram positif apparaîtront de couleur bleue ou violette, tandis que les cellules à Gram négatif seront rouges ou roses. En plus de la structure de la paroi cellulaire, la forme et la disposition sont élucidées à partir des micrographies résultantes.

La capacité de la coloration de Gram à étudier qualitativement les bactéries est importante dans un large éventail de domaines scientifiques.

Le sol n’est qu’une des sources environnementales à partir desquelles les bactéries peuvent être isolées et analysées. Pour l’eau potable, la préparation des échantillons doit être modifiée. Des échantillons d’eau du robinet peuvent être prélevés à partir d’un robinet et placés sur un milieu de croissance qui facilite la croissance de diverses colonies bactériennes hétérotrophes. Lors du placage sur un milieu tel que le R2A, le processus est presque identique à la procédure au sol.

Pour certaines techniques d’identification bactérienne, les paramètres dépendent du type de paroi cellulaire de la bactérie d’intérêt. Dans cet exemple, le sang d’un patient septique a été analysé et s’est avéré être porteur de bactéries à Gram positif.

Grâce à ces informations, des sondes d’acide nucléique peptidique spécifiques à l’espèce ont été choisies qui se lieraient à l’ARNr des cellules. Ces sondes étaient liées à des colorants fluorescents qui servaient à identifier les espèces présentes.

En raison des différences fondamentales dans la structure cellulaire à Gram positif et négatif, les bactéries ont des réponses uniques à d’autres composés que le violet cristallin. Cette expérience visait à isoler Clostridium difficile, une bactérie à Gram positif, à partir d’échantillons fécaux. De la cyclosérine, qui inhibe la croissance des cellules à Gram négatif, a été ajoutée à la plaque de gélose. Les cellules à Gram positif qui se sont développées sur la plaque ont été isolées par d’autres méthodes.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la coloration de Gram pour les études environnementales. Vous devez maintenant comprendre les avantages du processus et comment effectuer la technique et utiliser les résultats. Merci d’avoir regardé !