Analyse de la courbe de croissance bactérienne et ses applications environnementales

La mesure du taux de croissance des bactéries est une technique microbiologique fondamentale qui est largement utilisée dans la recherche fondamentale ainsi que dans les applications agricoles et industrielles.

Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondantes sur Terre, étant présentes dans tous les écosystèmes, y compris le corps humain. Certaines espèces bactériennes sont également génétiquement très maniables et ont été exploitées comme modèles de recherche ou pour produire des produits naturels ou synthétiques à l’échelle industrielle. Cependant, toutes les espèces bactériennes ne peuvent pas être cultivées en laboratoire. Pour ceux qui le peuvent, une caractéristique importante est le taux de multiplication, ou « cinétique de croissance ».

La mesure du taux de croissance d’une culture bactérienne peut informer les scientifiques sur ses fonctions physiologiques et métaboliques, et est également utile pour obtenir un nombre précis de cellules de la bactérie pour les applications en aval.

Cette vidéo présentera les principes qui sous-tendent l’analyse du taux de croissance bactérienne, démontrera un protocole pour caractériser le taux de croissance à l’aide d’une « courbe de croissance » et, enfin, explorera plusieurs applications des sciences de l’environnement pour mesurer la cinétique de croissance bactérienne.

Les bactéries se reproduisent généralement de manière asexuée, se multipliant par simple fission binaire où une cellule parentale se divise en deux cellules filles identiques. Dans des conditions de croissance favorables, où les nutriments sont disponibles en abondance et où les paramètres environnementaux tels que la température sont tous propices à la croissance, le taux de multiplication dépasse de loin le taux de mortalité. Il en résulte une croissance exponentielle.

En mesurant la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps, on peut obtenir une courbe de croissance. La croissance de bactéries dans une culture liquide dans des conditions optimales produit une courbe de croissance avec une forme caractéristique qui peut être divisée en différentes phases. La courbe commence par une « phase de latence », lorsque la croissance est lente pendant que les bactéries s’acclimatent aux conditions de culture. Vient ensuite la « phase logarithmique » ou « exponentielle », lorsque les bactéries connaissent une croissance exponentielle. La croissance finit par s’arrêter lorsque les nutriments s’épuisent et que les déchets s’accumulent, ce qui entraîne une « phase stationnaire ». Enfin, une fois que le taux de multiplication est dépassé par le taux de mort cellulaire, la culture entre dans la « phase de mort ».

Pour construire une courbe de croissance, le nombre de bactéries dans un flacon de culture liquide est compté à différents moments sur une certaine période de culture. Le nombre de bactéries peut être obtenu par un certain nombre de méthodes différentes. Une approche courante consiste à mesurer la densité optique - ou « OD » - 600, qui est l’absorbance de la lumière par la solution bactérienne à une longueur d’onde de 600 nm.

Une autre méthode consiste à déterminer les « UFC », ou unités formant colonie, par millilitre de culture. En raison de la nature clonale de la croissance bactérienne, une bactérie dans une culture peut théoriquement se développer en une colonie observable sur une plaque de gélose. En plaquant une série de dilutions d’une culture bactérienne pour atteindre une concentration bactérienne où des colonies individuelles et discrètes peuvent être observées, une méthode appelée « placage par dilution en série », le nombre de colonies peut être utilisé pour recalculer la concentration bactérienne en termes d’UFC par ml.

Maintenant que vous comprenez comment la croissance bactérienne peut être analysée, passons en revue un protocole pour effectuer une analyse de la courbe de croissance sur des cultures pures d’un modèle bactérien bien établi, Escherichia coli, en utilisant la méthode de placage de dilution en série.

Un jour avant le prélèvement de points temporels, inoculer 20 mL de bouillon de soya trypticase pré-stérilisé dans une fiole de 50 mL avec une seule colonie d’E. coli.

Incuber la culture pendant la nuit à 37 ? C avec agitation. Dans le cas d’E. coli, cela se traduirait par une population en phase stationnaire d’environ 109 UFC/mL.

Le lendemain, inoculez 100 ? L de la culture de nuit dans 250 mL de BST dans une fiole de 500 mL. Mélanger. Cela produit une culture diluée d’environ 4 x 105 UFC/mL. Conservez 5 ml de cette culture diluée dans un tube de culture. Il s’agit de l’aliquote du point temporel 0, ou T0. Réfrigérer immédiatement à 4 ?C.

Incuber le volume restant de la culture à 37 ? C avec agitation. Toutes les heures par la suite, pendant une période pouvant aller jusqu’à 8 h, prélever 5 mL d’aliquotes de la culture. Désignez ces échantillons T1 à T8, et stockez-les tous à 4 ? C jusqu’à l’utilisation.

Le jour de l’expérience, retirez les aliquotes temporelles d’E. coli du réfrigérateur et conservez-les sur de la glace. Utiliser des tubes microfuges stériles, chacun avec 900 ? L de solution saline stérile, pour mettre en place une série de dilution pour chaque aliquote selon le tableau suivant.

Bien mélanger la culture T0 en tourbillonnant doucement, puis ajouter 100 ? L au tube A de sa série de dilution, ce qui fait une dilution de 1 sur 10 ou 10-1. Tube vortex A pour mélanger, et à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, ajouter 100 ? L du tube A au tube B, ce qui fait la dilution de 1 sur 100 ou 10-2.

Répéter le processus pour chaque aliquote de culture et effectuer la série de dilution appropriée conformément au tableau 2. Une fois que la série de dilution pour tous les échantillons de points temporels a été faite, avoir le nombre approprié de plaques de gélose de soja trypticase stériles préparées pour le placage bactérien.

3 dilutions de chaque culture de point temporel seront plaquées en trois exemplaires selon le tableau suivant. Étiquetez les plaques en conséquence. Alors, pipette 100 ? L de chaque culture convenablement diluée sur le centre de la plaque de gélose respective. Stérilisez à la flamme une tige de verre en forme de « L », refroidissez-la en touchant la tige à la gélose loin de l’inoculum et étalez immédiatement le liquide sur la surface de la gélose. Veuillez noter qu’un retard dans la propagation pourrait entraîner une prolifération bactérienne à l’endroit de l’inoculation.

Continuez à plaquer chaque série de dilution pour les 9 cultures de points temporels, en stérilisant à la flamme la tige d’étalement de verre entre chaque série de dilution.

Une fois que les plaques ont été laissées sécher pendant quelques minutes, retournez-les et placez-les dans le 37 ? C pendant la nuit. Après cette période de croissance, les plaques peuvent être entreposées à 4 °C.

Après une nuit d’incubation des plaques de dilution, examinez-les pour détecter la contamination et l’uniformité des colonies. Pour chaque culture à points temporels, choisissez une dilution pour laquelle il y a entre 30 et 300 colonies par plaque. Comptez le nombre de colonies sur chacune des plaques triples pour cette dilution.

À l’aide du nombre moyen de colonies pour chaque dilution et du facteur de dilution, calculer la concentration de bactéries dans la culture originale à chaque point temporel en UFC/mL. Par exemple, s’il y a en moyenne 30 colonies à partir de l’ensemble de plaques triples obtenues à partir de 0,1 mL de dilution 10-4, soit 1 sur 10 000, alors il y aurait 30 colonies divisées par 0,1 mL multiplié par 10 000, soit 3 millions d’UFC/mL.

À l’aide de la concentration bactérienne calculée pour chaque point temporel, tracez un graphique du logarithme en base 10 des concentrations bactériennes, en UFC/mL, en fonction du temps en heures. À partir du graphique, identifiez la phase logarithmique de croissance de la culture bactérienne d’origine et choisissez deux des points temporels de la phase logarithmique, en désignant le premier de ces points temporels comme t = 0. Calculez le temps moyen d’une génération à l’aide de l’équation X est égal à 2 à la puissance n multiplié par X0 où X est la concentration bactérienne au temps t, X0 est la concentration initiale à t = 0 et n est le nombre de générations qui se sont écoulées entre les deux points temporels.

Par exemple, supposons que X0 est de 1 000 UFC/mL, et qu’à t = 6 h, la concentration est de 16 000 UFC/mL. En utilisant l’équation, nous obtenons que 4 générations se sont produites en 6 heures, ce qui donne une durée de génération de 6 divisée par 4 ou 1,5 heure par génération.

La mesure de la cinétique de croissance bactérienne est fondamentale pour de nombreuses applications à des fins de recherche, d’agriculture ou de bio-ingénierie.

L’une des utilisations de la connaissance du taux de croissance bactérienne est de permettre d’obtenir une quantité précise d’une culture bactérienne pour inoculer une autre culture ou un autre milieu. Par exemple, certaines cultures, telles que les légumineuses, doivent être cultivées avec des bactéries symbiotiques connues sous le nom de rhizobiums qui colonisent les racines des plantes pour former des nodules et « fixer » l’azote - convertissant l’azote atmosphérique en ammoniac qui peut être utilisé par la plante. Pour les applications agricoles, une quantité connue de rhizobiums est ajoutée à un milieu carboné à base de tourbe, qui est ensuite utilisé pour inoculer des graines de légumineuses afin d’établir la symbiose plante-bactérie.

L’analyse de la croissance peut également être utilisée pour identifier les espèces bactériennes qui peuvent dégrader les déchets industriels et éventuellement générer des sous-produits précieux. Dans cet exemple, les chercheurs ont examiné comment un milieu de croissance complété par de la liqueur noire, un déchet de la production de pâte à papier et de pâte à papier, affectait la croissance d’un isolat microbien environnemental.

Les bactéries ont non seulement démontré une croissance accrue avec la liqueur noire, mais ont également montré un modèle de croissance « diphasique », indiquant la présence de plus d’une source de carbone dans la liqueur noire que la bactérie peut métaboliser. Les composants individuels de la liqueur noire ont ensuite pu être extraits pour une analyse plus détaillée de la croissance.

Enfin, les mesures du taux de croissance sont également utiles pour caractériser les bactéries qui ont été modifiées à des fins industrielles particulières, par exemple pour l’assainissement de la pollution par les hydrocarbures. Ici, les scientifiques ont créé des souches bactériennes génétiquement modifiées qui contiennent des enzymes pour dégrader les composants hydrocarbonés du pétrole. Une analyse de croissance a été effectuée, par exemple, pour vérifier que les bactéries modifiées ont un taux de croissance plus élevé que les bactéries normales en présence d’hydrocarbures toxiques, indiquant une tolérance améliorée qui permettra aux bactéries modifiées d’effectuer leur fonction de nettoyage de la pollution.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’analyse des taux de croissance bactérienne avec des courbes de croissance. Vous devez maintenant comprendre les différentes phases de croissance des cultures bactériennes, comment réaliser une expérience pour obtenir une courbe de croissance en utilisant la collecte de points temporels et le placage de dilution en série, et comment l’analyse de croissance peut être appliquée à la recherche et à des fins industrielles. Comme toujours, merci d’avoir regardé !