Analyse de la courbe de croissance bactérienne et ses applications environnementales

1. collecte des aliquotes de Culture bactérienne

1. Un jour avant la collection de points de croissance de temps, inoculer 20 mL de milieu de bouillon (BST) trypticase soja dans un ballon jaugé de 50 mL à e. coli.
2. Incuber pendant la nuit à 27 ° C. Cette période d’incubation relativement longue se traduit par une population de phase stationnaire de type sauvage e. coli d’environ 10⁹ UFC/mL.
3. Le jour suivant, utilisez 100 µL de la culture préparée pour inoculer 250 mL du BST (dans un ballon jaugé de 500 mL). Mélanger soigneusement.  Supprimer une partie aliquote de 5 mL et réfrigérer immédiatement à 4 ° C. Il s’agit de T = 0 ou₀ le moment T et devrait contenir environ 4 x 10⁵ UFC/mL.
4. Placer le ballon de l' autres e. coli (245 mL) dans un 37 ° C, secouant l’incubateur. Retirer les aliquotes de 5 mL de la culture toutes les heures, jusqu'à 8 h. stocker chaque aliquote à 4 ° C. Désigner ces parties aliquotes T₁ à T₈.

2. les dilutions

1. Retirer les aliquotes d’e. coli du réfrigérateur et la place sur la glace pour le transport. Garder toutes les cultures sur la glace jusqu'à l’utilisation.
2. Mettre en place une série de tubes de dilution pour obtenir diverses dilutions de chaque culture d’e. coli (Figure 3). Microtubes sont commodes pour cette fonction. Chaque tube de dilution doit avoir 900 µL de liquide de dilution (physiologique). Une série de dilution est nécessaire pour chaque culture d’e. coli (T₀ à T₈) ; Etiqueter chaque tube selon le tableau 2.
   
   La figure 3. Schéma montrant la procédure pour l’électrodéposition d’e. coli.
3. Commencer les dilutions en ajoutant 100 µL d’e. coli du tube étiqueté T₀ (la première culture d’e. coli ) au tube A, qui correspond à la dilution 10^-1 T₀. Vortex le tube pendant 5 s.
4. Par la suite, ajouter 100 µL de Tube A au prochain tube de sérum physiologique, Tube B, qui correspond à la dilution de 10^-2 T₀. Continuer la série de dilution nécessaire pour chaque aliquote de point de temps. N’oubliez pas de vortex chaque avant de tube de transfert. Il est également important d’utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque transfert.

Culture d’e. coli	Dilutions nécessaires et Tube #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Le tableau 2. Série de dilution requise pour chaque culture d’e. coli .

3. placage

1. Trois dilutions pour chaque aliquote point d’e. coli culture temps vont être plaquées, selon le tableau 3. Étiquette des assiettes avec le point dans le temps (T₁ à T₈), le facteur de dilution et le volume à ajouter. Utiliser des plaques en triple pour chaque dilution.
2. Ajouter 100 µL de chaque dilution à la plaque en pipettant également, le montant au centre de la gélose (Figure 3). Répandre immédiatement l’aliquote en utilisant une flamme stérilisés « L » en forme de baguette de verre. Si l’aliquote ne se transmet pas immédiatement, il s’absorbe in situ sur la plaque, ce qui entraîne la prolifération bactérienne à l’endroit d’inoculation initiale.
3. Répétez l’électrodéposition pour chaque série de dilution pour temps points T₁ à T₈. N’oubliez pas de stériliser la tige entre les plaques et surtout entre les différentes dilutions.
4. Une fois que les plaques ont séché pendant quelques minutes, retournez et placer dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Inversant les plaques empêche la condensation de tomber sur la gélose. Après incubation pendant la nuit, des plaques doivent être conservés au réfrigérateur.

E. coli culture	Dilutions à être plaqué
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^* Les dilutions inférieures tiennent compte des populations inférieures à cause de phase de mort.

Tableau 3. Bordé de protocole pour les cultures d’e. coli .

4. comptage de Colonies et en calculant la durée d’une génération moyenne

1. Examiner les plaques pour l’uniformité des colonies et l’absence de contamination.
2. Pour chaque point du temps (T₀ à T₈), choisir une dilution qui contient entre 30 et 300 colonies et plaques en triple de numération.
3. En utilisant le facteur de dilution, dos-calculer le nombre de cellules / mL de culture d’origine à la fois points T₀ à T₈. Par exemple, si le nombre de colonies résultant d’une dilution de 10^-4 est de 30, 28 et 32 :
   Nombre moyen de colonies = 30 colonies
   Ceux-ci résultent de 0,1 mL d’une dilution de 10^-4
   Nombre de colonies par mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Tracer le journal₁₀ UFC/mL par rapport au temps (en heures).
5. Sur le graphique, d’identifier la phase exponentielle de croissance. À l’aide de 2 points dans le temps dans la phase de croissance exponentielle et le nombre de cellules correspondant à chaque époque, calculer la durée d’une génération moyenne.