Analyse d'ARN d'échantillons environnementaux à l'aide de la RT-PCR

1. prélèvement : Échantillon de sol

1. Trouvez un emplacement échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
2. Pour l’échantillonnage aléatoire, choisir des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un recensement général des habitats microbiens. Transect d’échantillonnage perçoit des points le long de la ligne droite, par exemple, adjacent à un lit. Grille échantillons proviennent systématiquement des points à intervalles réguliers et sont utiles pour les communautés microbiennes de cartographie dans une région inconnue ou variable.
3. Profondeur d’échantillonnage dans un 3-6 pouces (7,5 à 15 cm) permet d’accéder à l’activité microbienne plus abondante qui est proche, mais pas dans la rhizosphère (la région étroite du sol directement touché par les racines des plantes et les microorganismes associés).
4. Recueillir l’échantillon de sol, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée.
5. Soulevez la tarière. Le sol se trouve dans la tige creuse de la tarière.
6. Racler le sol au bas de la vis sans fin dans un sac de ramassage de sol. Être sûr de ne pas toucher ou contaminer le sol.
7. Le sac correctement avec l’emplacement, nom, date et heure de l’étiquette.
8. Au laboratoire, passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour éliminer tout gravier et la roche.
9. Analyser une partie du sol pour la teneur en humidité du sol. Pour plus de détails de cette étape, consultez JoVE Science Education vidéo sur l’humidité du sol.

2. prélèvement : Échantillon de l’eau

1. Recherchez l’emplacement de l’échantillon via GPS, coordonnées ou vue.
2. Recueillez l’eau dans un flacon. Noter le volume d’eau recueillie ; Si les microbes dans l’échantillon sont quantitativement analysés, puis la concentration microbienne peut être déterminée compte tenu du volume collecté.
3. Tester immédiatement l’eau pour tous les paramètres requis pour l’expérience (température, pH, conductivité, salinité, azote et phosphore contenu, etc) en utilisant les sondes électroniques appropriés.
4. Placer le flacon contenant l’échantillon d’eau dans une glacière avec de la glace. Transférer la glacière au laboratoire.

3. Extraction de l’ARN

1. Pour rassembler et concentrer les micro-organismes provenant de l’échantillon environnemental, veuillez vous reporter à la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
2. Extrait RNA virus à l’aide d’un kit d’extraction commerciale conformément aux instructions du fabricant.
3. En bref, tout d’abord mélanger les échantillons avec tampon de lyse complété avec de l’éthanol, puis ajoutez les échantillons dans les colonnes à centrifuger.
4. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g, redistribution de défausse. Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau.
5. Ajouter de l’eau exempte de RNase aux colonnes et centrifuger pendant 30 s à éluer l’ARN dans des tubes stériles microtubes de faible adhérence de 1,5 mL.

4. reverse Transcription - PCR

1. Récupérer les réactifs suivants du congélateur-20 ° C : dNTP, concentré (par exemple, x 10) inverser un tampon transcription amorces (dans cet exemple, amorces aléatoires). Décongeler celles-ci sur la glace ou à température ambiante à l’intérieur d’une hotte propre et gardez-les sur la glace après décongelé. Aussi récupérer la transcriptase inverse et l’inhibiteur de RNase et mettez-les sur la glace.
2. Calculer les volumes de réactifs nécessaires pour faire un « mix master » qui combine tous les réactifs constant entre chaque réaction (voir le tableau 1 pour une réaction de l’échantillon). Préparer suffisamment mélange principal pour chaque échantillon, comme un contrôle positif (à l’aide d’un modèle connu de transcription) et négatif (par exemple, sans la transcriptase inverse, avec seulement de l’eau comme modèle, etc.) des réactions de contrôle. Inclure une remise de 10 % en volume.
3. Assembler le mélange maître dans des microtubes 1,5 mL faible adhérence. Cela minimise la liaison de molécules de réactifs sur les parois des tubes en plastique.
4. Lorsque les réactifs sont décongelés, ajouter les volumes calculés pour le tube à centrifuger. Doucement de vortex et centrifuger chaque tube avant l’addition. Veillez à modifier les pointes de pipette entre l’ajout de chaque réactif pour empêcher la contamination.
5. Après tous les réactifs ont été ajoutées, vortex et centrifuger master mix pour assurer un mélange homogène. Remettre les réactifs en conservation à-20 ° C.
6. Préparer et étiqueter de 8 tubes PCR bandes, désignant un tube pour chaque réaction d’échantillon ou de contrôle.
7. Aliquote un volume égal de mélange maître dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA.
8. Placez le couvercle de la bande sur la bande de PCR et centrifuger dans un minicentrifuge avec un adaptateur de tube de bande pour assurer tout le liquide est recueilli au bas de chaque tube (Figure 2).
9. Bande de PCR place solidement dans le thermocycleur. Appuyez pour s’assurer que les tubes sont sécurisés.
10. Définissez le thermocycleur pour exécuter le programme approprié pour le RT utilisé (voir le tableau 2 pour un protocole d’échantillonnage). Lorsque le programme est terminé, les tubes contiendra cDNA produits, qui peuvent alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour plus de détails, veuillez consulter les vidéos de l’enseignement des sciences JoVE sur PCR et PCR quantitative. Stocker les ADNc à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

La figure 2. Plafonné à bande de 8-tube contenant l’extrait et mélange principal.

Réactif	Volume 1 (μL) de la réaction
mémoire tampon RT 10 x	2.0
25 x dNTPs	0,8
10 x amorce aléatoire	2.0
Multiscribe	1.0
Inhibiteur de RNase	1.0
Niveau moléculaire H2O	3.2
Volume total	10

Le tableau 1. Ingrédients de Mix Master RT.

Étape 1	Étape 2	Étape 3	Étape 4
25 ° C, 10 min	37 ° C, 120 min	85 ° C, 5 min	4 ° C, ∞

Le tableau 2. Programme RT réaction thermocycleur.