Analyse d'ARN d'échantillons environnementaux à l'aide de la RT-PCR

La réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse, ou RT-PCR, permet de détecter les virus à ARN et l’expression des gènes microbiens dans l’environnement.

Contrairement aux organismes cellulaires, de l’homme aux bactéries, qui utilisent l’ADN comme matériel génétique, certains virus ont des génomes faits d’ARN, y compris de nombreux virus pathogènes tels que la grippe, Ebola et le VIH. Bien que certains virus puissent être détectés en observant le phénotype pathogène qui se développe lorsqu’ils sont utilisés pour infecter des cellules en culture cellulaire, la majorité d’entre eux n’ont pas de méthode de caractérisation basée sur la culture. La RT-PCR peut être utilisée pour détecter la présence de ces virus dans l’environnement avec une sensibilité élevée.

Dans le même temps, les organismes dotés de génomes basés sur l’ADN « expriment » l’information génétique codée dans leurs génomes d’ADN en les « transcrivant » en ARN messager ou « m », qui peuvent ensuite être « traduits » en protéines pour remplir une fonction enzymatique ou structurelle dans les cellules. Comme les microbes réagissent et s’adaptent aux changements de l’environnement en activant ou en désactivant diverses voies génétiques, la RT-PCR peut être utilisée pour surveiller ces altérations de l’expression des gènes afin de servir d’évaluateurs potentiels de l’écosystème.

Cette vidéo passera en revue les principes qui sous-tendent la RT-PCR, décrira une procédure généralisée pour effectuer cette technique et, enfin, examinera certaines des façons dont cette méthode est appliquée en microbiologie environnementale aujourd’hui.

Cette procédure comporte deux parties clés : l’extraction de l’ARN à partir d’échantillons biologiques, suivie de sa transcription inverse en ADN.

L’isolement de l’ARN consiste à lyser les cellules de l’échantillon en ajoutant un détergent qui décompose les lipides et les protéines, suivi d’une perturbation mécanique. L’extraction de l’ARN des virus nécessite généralement l’ajout de protéinases, qui sont des enzymes de digestion des protéines, pour décomposer les capsides des virus - les enveloppes protéiques dures qui forment la particule virale. D’autre part, lors de l’obtention d’ARN à partir d’organismes cellulaires, le lysat peut devoir être traité avec des enzymes dégradant l’ADN, ou ADNAS, pour éviter que les résultats en aval ne soient faussés par la présence d’ADN chimiquement similaire.

L’ARN peut ensuite être purifié à partir des lysats de l’une des deux manières suivantes. Dans une méthode, connue sous le nom d’extraction acide au guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme, le lysat est mélangé à un mélange organique-aqueux qui est ensuite centrifugé pour séparer les phases. Les protéines seront réparties dans la phase organique, les débris cellulaires lysés dans l’interphase trouble et les acides nucléiques dans la phase aqueuse. La phase aqueuse supérieure peut ensuite être collectée, et l’ARN est précipité par l’ajout d’alcool tel que l’isopropanol, qui diminue la solubilité de l’acide nucléique dans l’eau.

Dans l’isolement de l’ARN sur colonne, le lysat est mélangé à de l’alcool, puis passé à travers une colonne de filtration sur gel avec une résine chargée négativement, telle que la silice. Le lysat est préparé de manière à ce que les ions chargés positivement dans le tampon forment des « ponts salins » qui permettent au squelette phosphate chargé négativement des acides nucléiques de se lier à la résine. Tous les autres contaminants sont ensuite emportés. Les acides nucléiques sont « élués » de la colonne à l’aide d’un tampon à faible teneur en sel ou d’eau. Étant donné que l’ARN simple brin a moins de charges négatives que l’ADN double brin, il peut être élué préférentiellement à l’aide de tampons de concentrations spécifiques.

Une fois isolé, l’ARN est transformé en ADN chimiquement plus stable. Les scientifiques ont exploité une enzyme naturellement codée par des rétrovirus comme le VIH. Cette enzyme est connue sous le nom de transcriptase inverse, ou « RT ».

La RT synthétise de l’ADN complémentaire ou « c » à partir d’une courte portion de nucléotides appelée amorce. Cette amorce peut avoir différentes séquences, en fonction de l’objectif de l’expérience. Par exemple, l’amorce peut être conçue pour avoir une séquence spécifique, afin de détecter des gènes ou des organismes spécifiques. Une fois synthétisé, cet ADNc « premier brin » peut être amplifié par PCR régulière.

Maintenant que nous comprenons les principes de la RT-PCR, examinons un protocole permettant d’effectuer cette technique sur des échantillons d’ARN prélevés dans l’environnement.

Pour commencer la procédure, trouvez un lieu de prélèvement d’échantillons à l’aide des coordonnées GPS ou de la vue. Choisissez des points aléatoires dans une zone pour obtenir une étude générale des habitats microbiens.

Pour recueillir l’échantillon solide, enfoncez et tournez une tarière à main dans le sol jusqu’à la profondeur prédéterminée. Lorsque la tarière est soulevée, la terre se trouve dans la tige creuse de la tarière.

Ce sol est gratté directement dans un sac de collecte de terre et le sac est étiqueté avec l’emplacement, le nom, la date, l’heure de la collecte et toute autre information nécessaire.

Transférez le sol au laboratoire et passez-le dans un tamis de 2 mm pour enlever le gravier et la roche. Analysez un échantillon du sol pour déterminer la teneur en humidité, ce qui peut être informatif sur le niveau d’activité microbienne dans le sol. Pour ce faire, reportez-vous à la vidéo de cette collection « Détermination de la teneur en humidité du sol ».

Pour le prélèvement d’échantillons d’eau, choisissez un site d’intérêt similaire à la collecte de sol et recueillez l’eau dans une bouteille en plastique stérile à paroi épaisse. Prenez note du volume d’eau recueilli. Testez immédiatement l’eau pour des paramètres tels que la température, le pH et la salinité, qui peuvent fournir des informations importantes sur les niveaux microbiens attendus dans l’échantillon. Ensuite, placez la bouteille dans la glacière et transférez-la au laboratoire.

Des micro-organismes tels que des virus sont collectés et concentrés à partir de l’échantillon environnemental.

L’ARN peut être extrait des virus collectés par la méthode de la colonne de spin à l’aide de kits d’extraction d’ARN commerciaux selon les instructions du fabricant. Le tampon de lyse, complété par de l’éthanol, est d’abord mélangé à l’échantillon. Placez le nombre approprié de colonnes de centrifugation dans les tubes de collecte, puis appliquez les échantillons sur la matrice de colonne. Centrifugez les colonnes à environ 12 000 x g pendant 1 à 2 minutes pour laisser les acides nucléiques se lier à la colonne, et jetez le liquide qui s’écoule.

Ajoutez du tampon de lavage dans les colonnes et centrifugez à nouveau. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes microfuges stériles à faible adhérence de 1,5 ml. Ensuite, ajoutez de l’eau exempte d’ARNases, qui sont des enzymes qui dégradent l’ARN, dans les colonnes et centrifugez pendant 30 secondes pour éluer l’ARN. L’ARN élué peut être stocké à -80 ? C jusqu’à l’utilisation.

Avant l’expérience, des amorces appropriées doivent être conçues afin de détecter les séquences d’intérêt, qui peuvent servir de marqueurs de la présence de micro-organismes spécifiques.

Retirer les réactifs RT stockés à -20 ? C, et décongeler les réactifs congelés sur de la glace (ou à température ambiante). Il s’agit notamment des nucléotides, du tampon de transcription inverse et des amorces. Une fois décongelés, conservez les réactifs sur de la glace ; l’enzyme transcriptase inverse et l’inhibiteur de la RNase doivent toujours être conservés sur la glace.

Pendant que les réactifs décongèlent, calculez les volumes et les concentrations des composants de la réaction. Une fois les réactifs décongelés, faites tourner doucement chaque tube pour vous assurer que le contenu est bien mélangé.

En travaillant dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination, assemblez les composants dans un mélange maître à ajouter à chaque tube PCR. Lors de l’assemblage du mélange maître dans un tube Eppendorf, assurez-vous de changer les pointes de pipette entre chaque réactif pour éviter toute contamination. Une fois que tous les réactifs ont été ajoutés dans le tube d’Eppendorf, agitez doucement et faites tourner le tube de mélange principal pour assurer un mélange homogène.

Étiquetez un ensemble de tubes PCR, en vous assurant d’inclure des contrôles. Aliquote un volume égal du mixage principal dans chaque tube. Ensuite, ajoutez des composants spécifiques à la réaction, tels que les extraits d’ARN ou l’eau pour le contrôle négatif.

Une fois tous les composants ajoutés, placez les tubes dans un thermocycleur et réglez le programme de transcription inverse pour qu’il fonctionne. L’ADNc peut ensuite être soumis à une amplification par PCR. Pour une description détaillée de cette étape, reportez-vous à la vidéo de cette collection sur la PCR.

Une fois la PCR terminée, une partie du produit de PCR peut être séparée et visualisée sur un gel d’agarose. Par exemple, une amorce spécifique au gène a été utilisée ici pour détecter la présence d’un virus à ARN. Des bandes de la taille attendue sont obtenues à partir de la réaction RT-PCR mais pas à partir des témoins négatifs, indiquant la présence de ce virus dans l’échantillon d’eau testé.

L’identification de micro-organismes à base d’ARN par RT-PCR permet d’analyser la santé écologique, les risques environnementaux et la conservation de la biodiversité.

L’utilisation de micro-organismes pour nettoyer les hydrocarbures et les solvants des sols et de l’eau pollués représente une alternative d’assainissement écodurable. La compréhension de l’expression des gènes microbiens natifs peut mettre en évidence des voies microbiennes spécifiques qui décomposent les contaminants dans ces conditions. La RT-PCR est souvent utilisée pour amplifier l’ARNm à partir de tels échantillons environnementaux.

Les mesures de santé publique exigent souvent une surveillance rapide des sources virales d’infection dans l’environnement. La grippe aviaire, par exemple, est très contagieuse et peut se propager rapidement à la volaille, au bétail et même aux humains. Dans cet exemple particulier, les chercheurs ont recherché la menace de la propagation de la grippe aviaire par les oiseaux sauvages.

À l’aide d’un dispositif et d’un appareil RT-PCR portables, ils ont examiné une gamme d’oiseaux sauvages, même dans des zones reculées, afin de détecter les infections à un stade précoce et de prévenir la transmission.

Enfin, la RT-PCR peut être utilisée pour caractériser les « biopesticides » en cours de développement pour cibler des ravageurs tels que le tireur d’élite à ailes vitreuses, Homalodisca vitripennis, l’hôte d’une maladie qui endommage gravement les vignes en Amérique du Nord. Un nouveau virus à ARN simple brin est en cours de développement comme agent pour infecter cet insecte. En utilisant une combinaison de culture cellulaire d’Homalodisca et de confirmation de la charge virale par RT-PCR, ces auteurs ont pu propager une forte concentration de virus pour l’utiliser comme agent de lutte biologique.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’analyse des organismes environnementaux à base d’ARN par RT-PCR. Vous devriez maintenant comprendre la théorie derrière le protocole, comment appliquer la technique à vos recherches et certaines des façons dont elle est utilisée sur le terrain aujourd’hui. Merci d’avoir regardé !