Quantification des micro-organismes et des virus environnementaux à l'aide de la qPCR

L’avènement de la réaction en chaîne par polymérase quantitative, ou qPCR, a permis de déterminer quantitativement la quantité de tout micro-organisme dans un échantillon environnemental.

Comme la PCR standard, la qPCR identifie les micro-organismes en détectant la présence ou l’absence de séquences d’ADN spécifiques aux organismes d’intérêt. Cela permet de détecter des microbes qui ne peuvent pas être cultivés en laboratoire, ce qui permet d’analyser un éventail beaucoup plus large d’organismes environnementaux. De plus, la qPCR permet d’évaluer quantitativement la quantité d’ADN. Mais dans le même temps, les méthodologies PCR détectent l’ADN de tous les organismes morts ou vivants, ce qui limite la capacité de rechercher uniquement des microbes en croissance active dans l’échantillon.

Cette vidéo passera en revue les innovations chimiques qui distinguent la qPCR de la PCR régulière, expliquera comment la qPCR peut être utilisée pour mesurer quantitativement l’ADN, démontrera un protocole d’utilisation de la qPCR pour détecter un virus à ARN à partir d’échantillons de sol et, enfin, montrera comment la qPCR est appliquée à la microbiologie environnementale aujourd’hui.

Les principes de base de la qPCR sont les mêmes que ceux de la PCR classique : cycles répétés de recuit de l’amorce à la matrice, d’allongement du produit de la PCR et de dénaturation du produit à partir de la matrice, conduisant à l’amplification exponentielle d’une séquence cible d’intérêt, connue sous le nom d’amplicon, à partir d’un pool de matériau de départ.

L’innovation de la qPCR réside dans l’ajout de produits chimiques fluorescents dans la réaction, ce qui permet de visualiser directement en « temps réel » la synthèse du produit de la PCR à chaque cycle par des thermocycleurs spécialisés, ce qui permet de quantifier la quantité de séquence de matrice dans l’échantillon d’origine. La quantité est généralement mesurée en termes de cycle de seuil, abrégé Ct, également connu sous le nom de cycle de quantification ou Cq, qui est le cycle PCR auquel la quantité de produits fluorescents dépasse le niveau de fond.

La quantification peut être relative, où la valeur Ct d’une séquence est comparée à celle d’un autre étalon ou d’une séquence témoin ; la quantité relative est égale à deux augmentée à la puissance de la différence en Ct. Alternativement, si une série d’ADN de quantité connue est analysée à côté des échantillons dans la réaction, une courbe standard comparant la valeur de fluorescence à la quantité d’ADN peut être produite, et permet de quantifier l’ADN de l’échantillon de manière absolue.

Il existe deux grands types de molécules fluorescentes utilisées dans la qPCR. Dans un cas, des colorants fluorescents qui se lient spécifiquement à l’ADN double brin sont inclus dans la réaction. Le colorant n’est fluorescent que lorsqu’il est lié à l’ADN, ce qui permet de quantifier la quantité de produit d’ADN double brin.

Dans l’autre méthode, un court segment d’ADN, connu sous le nom de sonde, est conçu contre une séquence cible d’intérêt spécifique. La sonde est chimiquement attachée à un colorant fluorescent ainsi qu’à une molécule de « trempe » qui supprime le signal de fluorescence du colorant lorsqu’il se trouve à proximité. L’enzyme polymérase, qui synthétise le produit de l’ADN, a une activité de dégradation de l’ADN qui provoquerait la « libération » de la molécule fluorescente de la sonde, séparant ainsi le colorant de l’extincteur et permettant de détecter le signal de fluorescence

Maintenant que vous comprenez les principes de la qPCR, examinons un protocole permettant d’utiliser cette technique pour identifier un virus à ARN qui infecte les plantes, le virus de la marbrure légère du poivron, à partir d’échantillons de sol.

Dans cette démonstration, un échantillon sera prélevé dans la rhizosphère, la zone du sol située à environ 7 mm autour des racines des plantes qui est influencée par les racines et leurs micro-organismes symbiotiques.

Pour collecter le sol de la rhizosphère, extrayez d’abord soigneusement la plante d’intérêt du sol et frappez-la pour enlever autant d’excès de terre en vrac que possible. Emballez la plante pour un traitement ultérieur en laboratoire.

Après avoir ramené les échantillons au laboratoire, utilisez une spatule stérile pour racler le sol souhaité dans un récipient de collecte. Ensuite, récupérez le virus dans le sol et extrayez l’ARN.

Une fois que l’ARN est prélevé dans l’échantillon, convertissez-le en ADNc complémentaire ou en ADNc par transcription inverse. Veuillez vous référer à la vidéo JoVE SciEd sur la transcription inverse-PCR pour plus de détails sur cette procédure.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer la qPCR, décongelez les réactifs congelés à température ambiante à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire dédiée, et placez-les sur de la glace une fois décongelés. Les composants du réactif contenant l’enzyme ADN polymérase doivent toujours être conservés sur de la glace.

Décongelez l’échantillon d’ADNc et un ADN de contrôle positif, tel qu’un morceau d’ADN circulaire connu sous le nom de plasmide dans lequel l’amplicon d’intérêt est cloné.

Avant d’assembler les réactions dans une plaque de qPCR à 96 puits, préparez un modèle de tableau de 96 cellules sur papier et étiquetez chaque cellule avec la réaction qui sera chargée dans la plaque. Incluez les réactions pour chaque échantillon et étalon en trois exemplaires, ainsi que pour le témoin positif et le témoin négatif, comme une réaction sans ADN.

Calculez les volumes de réactifs nécessaires pour un « mélange maître » de réaction, qui comprend tous les réactifs qui sont constants parmi les réactions. Préparez suffisamment de mélange maître pour des réactions triples pour tous les échantillons plus les témoins, et 10 % supplémentaires pour tenir compte de l’erreur de pipetage.

Une fois les réactifs décongelés, assemblez le mélange principal dans un tube de microfuge à faible adsorption de 1,5 ml. Pour ce faire, vortex brièvement chaque réactif pour bien mélanger, récupérez tout liquide sur le côté des tubes à l’aide d’une mini-centrifugeuse et pipetez le réactif dans le tube de microfuge. Assurez-vous d’utiliser des pointes de pipette neuves pour chaque composant de la réaction. Une fois que tous les réactifs ont été ajoutés, agitez le vortex pour mélanger et centrifuger. Ensuite, aliquote la quantité appropriée de mélange maître dans les puits désignés sur la plaque PCR.

Ensuite, vortex et centrifugez chaque tube avec l’échantillon et l’ADN de contrôle, et pipetez la quantité appropriée dans les puits respectifs de la plaque PCR. Une fois les échantillons ajoutés, scellez la plaque avec une feuille d’étanchéité et utilisez l’outil de scellage pour aplatir complètement le joint et expulser les bulles d’air. Déchirez soigneusement les languettes non adhésives des extrémités du joint.

Pour recueillir complètement le mélange réactionnel au fond des puits, placez la plaque de réaction dans une centrifugeuse avec un porte-plaque et équilibrez correctement le rotor avec une plaque de contrepoids. Centrifugez la plaque jusqu’à 1 000 tr/min, puis laissez la centrifugeuse s’arrêter lentement sans freins.

Placez la plaque de réaction dans la machine qPCR. Réglez le programme PCR selon les spécifications du fabricant, en réglant la température de fusion en fonction de la paire d’amorces utilisée. Réglez le programme de réaction pour qu’il s’exécute.

Une fois le programme de qPCR terminé, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du témoin positif pour calculer la quantité d’ADNc dans chaque réaction. La quantité de virus dans l’échantillon d’origine peut ensuite être calculée.

Une fois le programme de qPCR terminé, le logiciel sera en mesure d’utiliser les concentrations connues du témoin positif pour calculer la quantité d’ADNc dans chaque réaction.

Avec les résultats de la qPCR, le volume transféré dans les puits, l’extraction du sol et le facteur de la transcription inverse, le nombre de virus dans l’échantillon de sol initial peut être calculé.

Maintenant que vous savez comment la qPCR est effectuée, voyons comment elle peut être utilisée pour analyser différents échantillons environnementaux.

La qPCR peut être utilisée pour quantifier la quantité de virus récupérés à partir de nombreux types d’échantillons différents. Dans cette application, deux types différents d’adénovirus ont été concentrés à partir d’échantillons d’eau par un certain nombre de méthodes différentes. L’ADN des virus a ensuite été extrait et soumis à une qPCR, afin d’évaluer l’efficacité relative des méthodes de concentration.

Une autre application du dénombrement microbien basé sur la qPCR est la quantification du contenu bactérien dans les échantillons alimentaires et agricoles - dans cet exemple, les échantillons de matières fécales et de litière provenant d’élevages de poulets. Plutôt que de cibler des espèces individuelles, les scientifiques ont effectué une qPCR à l’aide d’amorces contre un gène hautement conservé présent dans toutes les bactéries et ont quantifié la communauté bactérienne totale trouvée dans les échantillons.

Enfin, comme mentionné précédemment, l’un des inconvénients de la méthodologie traditionnelle de qPCR est qu’il est impossible de distinguer les microbes vivants et morts. Cependant, en ajoutant un produit chimique connu sous le nom de monoazide de propidium, ou PMA, qui ne peut pénétrer dans les cellules mortes où il se lie à l’ADN pour inhiber les réactions enzymatiques ultérieures telles que la PCR, les chercheurs ont pu faire la distinction entre les cultures vivantes et mortes d’E. coli O157 :H7, une souche pathogène commune trouvée dans les aliments et l’eau contaminés.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la quantification des micro-organismes et des virus environnementaux à l’aide de la qPCR. Vous devriez maintenant comprendre comment fonctionne la qPCR, comment l’utiliser pour mesurer la quantité d’un microbe dans un échantillon environnemental, et quelques applications de cette technique. Merci d’avoir regardé !