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Les virus sont des particules biologiques infectieuses responsables de nombreuses maladies, du rhume et de la grippe à l’hépatite et au VIH.
Les virus sont des particules biologiques constituées d’un génome d’ADN ou d’ARN, enveloppées dans une enveloppe protéique appelée capside, parfois avec une enveloppe lipidique supplémentaire. Les virus n’ont aucune capacité métabolique ou reproductive par eux-mêmes, et doivent envahir les cellules vivantes et détourner leur machinerie cellulaire afin de faire plus de copies d’eux-mêmes.
Les cellules procaryotes, telles que les bactéries, et les cellules eucaryotes, telles que celles des humains, peuvent être infectées par des classes spécifiques de virus. Plus précisément, les bactériophages sont des virus qui infectent les bactéries. Par exemple, les coliphages sont les phages qui infectent E. coli, une bactérie intestinale courante, dont certaines souches peuvent provoquer une intoxication alimentaire, et qui est une indication de contamination fécale de l’approvisionnement en eau.
Bien que les phages eux-mêmes ne soient généralement pas connus pour être pathogènes chez l’homme, il existe des preuves qu’ils sont des indicateurs de substitution fiables pour les entérovirus pathogènes qui sont également transmis par les matières fécales mais difficiles à analyser. L’existence de méthodes relativement rapides et peu coûteuses pour dénombrer les bactériophages en fait un outil intéressant pour l’évaluation de la contamination fécale dans les échantillons environnementaux.
Cette vidéo présentera les principes qui sous-tendent le dénombrement des phages ; faire la démonstration d’un protocole de quantification des phages, connu sous le nom de dosage des plaques ; Enfin, explorer plusieurs applications des sciences de l’environnement pour la détection et le comptage des phages et d’autres virus.
Les bactériophages, comme tous les virus, doivent parasiter les cellules vivantes, en l’occurrence les bactéries, pour se reproduire.
Pour ce faire, les phages atterrissent et se fixent à la surface de la cellule bactérienne et injectent leur matériel génétique dans la cellule. Une fois à l’intérieur de la cellule, le génome viral est répliqué et les composants protéiques de la capside virale sont produits, tous deux à l’aide de la machinerie biochimique de la cellule hôte. Une fois que les particules de phage sont assemblées, elles sont libérées par la bactérie, souvent en lysant l’hôte et en éclatant, tuant ainsi la cellule hôte.
Une méthode largement utilisée pour déterminer la concentration de phages dans un échantillon tire parti de cette activité lytique. Dans cette technique, le phage de l’échantillon est mélangé à des bactéries et à de la gélose molle. Ce mélange est versé sur des boîtes de Pétri avec de la gélose ordinaire comme substrat, et la couche supérieure forme une superposition.
Les bactéries sont à une concentration si élevée qu’elles forment une pelouse continue. Les bactéries doivent être obtenues à partir d’une culture qui est en phase logarithmique de croissance, pour s’assurer que chaque bactérie infectée par les phages est vivante et permet au phage de produire une descendance.
Lorsqu’une particule de phage infecte et lyse une bactérie, la descendance du phage se propage aux cellules bactériennes voisines et poursuit l’infection. La gélose molle limite la diffusion des particules de phages. Finalement, une zone de dégagement, connue sous le nom de plaque, se formera.
Si le phage est dilué à une concentration suffisamment faible, des plaques individuelles discrètes peuvent être observées sur la pelouse bactérienne. Ceux-ci peuvent être comptés et utilisés pour calculer le nombre d’unités formant des plaques (PFU) de phage par mL de l’échantillon d’origine.
Maintenant que vous comprenez comment les phages infectent les bactéries et comment cette activité peut être utilisée pour mesurer la concentration des phages, passons en revue un protocole d’utilisation d’un test de plaque pour dénombrer les phages dans les échantillons d’eau environnementale.
La veille, avant d’effectuer l’essai, inoculer une colonie de la souche ATCC 15597 d’E. coli dans 100 mL de bouillon de soya trypticase dans un erlenmeyer de 250 mL. Incuber en secouant à 35 ? C pendant la nuit.
3 h avant le test, inoculer 1 mL de la culture d’E. coli pendant la nuit dans 100 mL de bouillon frais. Placez cette nouvelle culture dans un bain d’eau agitée à une température comprise entre 35 et 37 °C. Cela permet de s’assurer que les bactéries sont en phase logarithmique de croissance au début du test.
Pour commencer le dosage sur plaque, effectuez des dilutions en série de 10 et 100 fois de l’échantillon d’eau, à l’aide de 9 mL de tampon Tris.
À l’aide d’un bain de vapeur, faites fondre trois tubes de 5 ml d’agar-gélose à 0,7 %, soit du soya trypticase ou de l’agar-nutritif. Une fois fondu, placez dans un bain-marie à 45 à 48 ? C pendant au moins 15 minutes pour que la température de la gélose descende à 45 °C.
Dans le premier tube de gélose molle, ajoutez 1 mL de la culture d’E. coli en phase logarithmique préalablement préparée et 1 mL de l’échantillon d’eau non diluée. Retirez le tube du bain-marie et balancez-le doucement entre vos mains pendant 2-3 secondes pour mélanger la suspension.
Versez la gélose molle sur une boîte de Pétri préalablement préparée avec du soja trypticase ou de l’agar-nutritif. Faites pivoter rapidement la plaque pour l’étaler, en vous assurant qu’elle couvre toute la surface.
Répéter l’inoculation et le placage pour les deux autres tubes, en utilisant 1 mL de chacun des échantillons dilués.
Une fois que la gélose supérieure s’est solidifiée, retournez les plats et incubez-les à 37 ? C pour 48 h.
Après l’incubation, comptez le nombre de plaies sur chaque plaque. À partir du comptage, calculez la concentration de phages dans l’échantillon d’origine
Par exemple, si 9 plaques ont été obtenues à partir de la plaque de dilution 10 fois, alors il y a 9 fois 10 divisé par 1 mL, ou 90 PFUs/mL de coliphage dans l’échantillon d’eau d’origine.
Maintenant que vous avez vu comment les tests de plaque de phage sont effectués, voyons comment les tests de plaque peuvent être utilisés pour dénombrer les phages et d’autres types de virus provenant de diverses sources.
Les méthodes basées sur le dosage des plaques peuvent être utilisées pour isoler les bactériophages à partir de différents échantillons environnementaux tels que le sol. Dans cet exemple, les chercheurs ont d’abord collecté des phages dans le sol par filtration. Le phage a ensuite été utilisé pour infecter la bactérie commune du sol Arthrobacter dans un test de plaque. Les phages ont été prélevés sur des plaques individuelles et striés sur de nouvelles plaques de gélose, puis recouverts de gélose supérieure contenant des bactéries. La concentration du phage diminue sur toute la longueur de la traînée, de sorte que des plaques discrètes, probablement formées par un seul type de phage, peuvent être obtenues. Ces plaques individuelles pourraient ensuite être choisies pour analyser plus en détail les phages qu’elles contiennent.
En plus des bactériophages, des tests de plaque peuvent également être effectués avec d’autres virus, y compris ceux, comme la grippe, qui infectent les mammifères. Pour ce faire, les cellules de mammifères sont d’abord cultivées sous forme de monocouches dans des boîtes de culture tissulaire. Des milieux contenant les virus sont ensuite ajoutés aux cellules pour permettre l’infection, avant que les cellules ne soient recouvertes d’un milieu immobilisateur tel que l’agarose gélatineuse. Après une période d’incubation pouvant durer jusqu’à deux semaines, les cellules infectées sont fixées et colorées pour permettre de visualiser et de compter les plaques.
Enfin, en plus des échantillons prélevés dans l’environnement, les tests sur plaque sont utiles pour détecter et dénombrer les virus dans les échantillons de tissus d’individus infectés. Ici, les chercheurs ont obtenu et homogénéisé des tissus pulmonaires de souris infectées par des gamma-herpèsvirus. Cet homogénat contenant le virus a ensuite été utilisé pour infecter la culture de cellules de mammifères. Le nombre de plaques a ensuite pu être compté pour fournir une estimation du titre viral dans les tissus pulmonaires infectés.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la détection des bactériophages dans les échantillons environnementaux. Vous devriez maintenant comprendre la biologie de base des phages, comment effectuer un test de plaque pour quantifier les phages dans un échantillon environnemental et comment les tests de plaque peuvent être utilisés pour étudier les phages et autres virus dans des échantillons environnementaux ou cliniques. Comme toujours, merci d’avoir regardé !
