Détection de bactériophages dans des échantillons environnementaux

1. Obtenir un échantillon d’eaux usées ou de l’eau contenant les coliphages.
2. Diluer l’échantillon 01:10 et 1/100 à l’aide d’un tampon Tris. Ce faire transférer 1,0 mL de la culture dans 9 mL de tampon Tris et puis faire une deuxième facteur 10 dilution.
3. Faire fondre les trois tubes de gélose molle (0,7 % Gélose nutritive ou gélose trypticase-soja par tube de 3 mL) en les plaçant dans un bain de vapeur ou autoclave.
4. Placer l’agar dans un bain d’eau à 45-48 ° C pendant 15 minutes pour permettre à la température de l’agar pour s’adapter à 45 ° C.
5. Dans le premier tube, ajouter 1 mL d’un bouillon de culture phase de journal d’e. coli¹ et 1 mL d’échantillon non dilué.
6. Retirer le tube du bain-marie et doucement rock entre les mains de mélanger la suspension pendant 2-3 s.
7. L’eau du tube avec une serviette en papier avec un chiffon et versez l’agar sur une boîte de Pétri préalablement préparée contenant des géloses de fond (Gélose nutritive ordinaire ou gélose trypticase-soja).
8. Rapidement, faire pivoter la plaque pour répandre l’agar en haut de la page. Veillez à ce que l’agar couvre toute la surface.
9. Répétez les étapes 5 à 8 avec les deux autres tubes de gélose molle, en utilisant 1 mL de bactéries et 1 mL de chaque dilution de l’échantillon (Figure 2).
10. Après que l’agar a solidifié, inverser les boîtes de Pétri et incuber à 37 ° C pendant 48 h. frapper toute trace d’humidité sur le couvercle de la boîte de Pétri. Si une goutte d’eau tombe sur une plaque, il causera le virus de se propager sur toute la surface de la gélose.
11. Après l’incubation, compter le nombre de plaques sur chaque dilution (Figure 3) et calculer la concentration du bactériophage dans l’échantillon original. Enregistrer des différences majeures dans la taille ou l’apparence des plaques.

La figure 2. Procédure pour la préparation d’une pelouse bactérienne utilisant agar supérieur pour le dénombrement de coliphages.

La figure 3. Plaques de phage sur une pelouse bactérienne.

¹ La souche e. coli ATCC 15597 généralement produira le plus grand nombre de plaques d’échantillons d’eaux usées. Il doit être cultivé pendant la nuit dans un erlenmeyer de 250 mL contenant 100 mL de nutriment ou trypticase soja bouillon et couvés sous agitation conditions à 35 ° C. 3 h avant le dosage du phage ensemencer un mL de cette culture dans un douce flacon contenant 100 mL de bouillon de soja nutriment ou trypticase et le placer dans un bain d’eau secouer à 35-37 ° C. Cela garantira que les bactéries sont dans la phase logarithmique de croissance.