2.11: Isolement des bactéries fécales à partir des échantillons d'eau par filtration

1. prélèvement d’échantillons et de traitement de l’eau

1. Recueillir plusieurs échantillons de 1 L eau de la source d’eau de test (p. ex. les fontaines d’eau, piscines, réservoirs, systèmes de distribution d’eau, des eaux usées brutes ou traitées) et le transport sur la glace au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Stériliser ou désinfecter l’ensemble collecteur de filtration membranaire avant utilisation par autoclavage, l’exposition à l’inflammation de rayonnement (2 min) ou éthanol-flamme UV.
3. Lors du refroidissement de toutes les parties, brancher correctement le collecteur à un flacon pompe à vide et le vide de déchets par des filtration, contenant l’eau de Javel.
4. Éthanol-flamme stériliser une paire de pinces et avec eux, retirer un filtre à membrane stérile, quadrillées de son emballage. Membranes de 47 mm de diamètre avec une taille de pores de 0,45 µm sont généralement utilisés. Toutefois, autres diamètres et la taille des pores peut être utilisée sous réserve que la taille des pores peut piéger suffisamment les microorganismes de la cible, et au moins 70 % de la zone de filtre se compose de l’espace poral.
5. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité et le fixer en place.
6. Mesurer le volume d’eau désiré (par exemple 100 mL) et l’ajouter à l’entonnoir (une marque de 100 mL est visible sur l’entonnoir).
7. Appliquer un vide partiel [pression différentielle de 34 à 51 kPa (kiloPascals)] afin d’en tirer l’échantillon d’essai à travers le filtre. Total des matières solides en suspension, y compris les bactéries et la décomposition de la matière organique, plus grande que le filtre moyenne taille des pores de 0,45 µm sont pris au piège sur le filtre. Les particules plus petites y compris les virus et solides tels que de petites quantités de matière organique et sels dissous va passer à travers la membrane et dans la fiole à vide poubelle contenant l’eau de Javel.
8. La suite complète passage de l’échantillon à travers le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec deux ou trois volumes de 20 à 30 mL d’eau stérile.
9. L’aspirateur hors tension et retirez l’entonnoir de la tubulure après la fermeture du rinçage final.
10. Avec une pince stérile éthanol-flamme, retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil et le placer rapidement sur le milieu approprié d’agarose pour le microorganisme cible (le tableau 1 répertorie les conditions de médias et d’incubation de croissance recommandées pour chacun).
11. Appliquer le filtre de membrane à la surface d’agarose par un mouvement de type à rouleau pour assurer le contact complet de la membrane avec le milieu de croissance et pour éviter le piégeage de bulles d’air.
12. Remplacer l’entonnoir de filtration utilisé avec une unité stérile entre le traitement de chaque échantillon et éthanol-assainissez le collecteur en acier inoxydable afin de prévenir la contamination croisée.

2. colonie Enumeration

1. Après la période d’incubation, enlever les plaques de croissance de l’incubateur pour l’énumération.
2. Idéalement, effectuer les comptages de colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière froide, blanche.
3. Coliformes totaux
   1. Des colonies de coliformes totales sont généralement roses à rouge foncé en couleur avec une surface métallique brillant. L’éclat lui-même peut partiellement ou complètement couvrir la colonie. Morphologies atypiques colonies de coliformes totales peuvent être rouge sombre, mucoïde ou nucléée sans reflet.
   2. Les colonies qui sont rose, bleu, blanc ou incolore tout en manquant de brillance sont considérés comme non-coliformes.
4. Les coliformes fécaux
   1. Les colonies de coliformes les apparaissent dans plusieurs nuances de bleu.
   2. Les colonies de coliformes fécales sont gris à la crème de couleur.
5. Entérocoques fécaux
   1. Gamme de colonies les entérocoques fécaux du rose au rouge foncé en couleur.

3. colonie vérification

1. Coliformes totaux
   1. Pour une vérification de la présence-absence, tamponner la membrane toute en utilisant une boucle inoculation stérile. Pour les colonies, il est préférable de vérifier au moins cinq chacun des morphologies typiques et atypiques.
   2. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon lauryl tryptose avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 35±0.5 ° C pendant 48 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme.
2. Les coliformes fécaux
   1. Transférer des colonies de couleur bleues aseptiquement dans les récipients en verre contenant stérile milieu EC avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 44,5 ± 0,2 ° C pendant 24 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme fécal.
3. Entérocoques fécaux
   1. Grève des colonies caractérisant la morphologie les entérocoques fécaux pour isolement aseptiquement sur cerveau-cœur Infusion Agar (BHIA) et incuber à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 à 48 h.
   2. Transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre préalablement nettoyé.
   3. Ajouter deux à trois gouttes d’eau oxygénée à 3 % de frottis préparés sur les diapositives. L’apparition rapide de bulles indique un résultat de « catalase positive » et l’isolat n’est pas une bactérie streptocoque fécal.
   4. Effectuer une coloration de Gram pour les isolats essais comme « catalase négative » (pas de bulles observées). Les entérocoques fécaux sont Gram-positif, ovoïdes et apparaissent surtout en paires ou en courtes chaînes.

Le tableau 1. Milieux de culture culture couramment utilisés pour la détection des indicateurs bactériens les dans les échantillons environnementaux
¹ tel que recommandé par les Méthodes Standard pour l’examen de l’eau et des eaux usées (American Public Health Association et l’American Water Works Association, 22^ème édition, 2012)

La filtration membranaire et la culture subséquente des bactéries recueillies sont une technique utile pour évaluer la qualité et la propreté d’une source d’eau.

La qualité de l’eau destinée à l’agriculture, aux loisirs ou à la maison est d’une grande importance, en raison du risque d’épidémies de maladies d’origine hydrique. Si l’eau est contaminée par des matières fécales provenant d’animaux ou d’humains, des parasites, des bactéries ou des virus pathogènes peuvent se propager à de nouveaux hôtes lors de leur ingestion. La surveillance des sources d’eau pour ces organismes pathogènes est donc essentielle pour assurer la santé publique.

Le grand nombre et la variété d’agents pathogènes fécaux-oraux qui peuvent être présents dans une source d’eau rendent difficile l’analyse de chacun d’entre eux indépendamment et sur une base régulière. Au lieu de cela, les tests microbiologiques courants pour la qualité de l’eau utilisent des bactéries indicatrices coliformes. Pour plus d’informations sur ce processus, voir la vidéo de cette collection sur les organismes indicateurs.

Cette vidéo illustrera le processus de filtration membranaire sur un échantillon d’eau environnementale, montrera comment cultiver plusieurs types de bactéries indicatrices fécales, y compris les coliformes totaux, les coliformes fécaux et les entérocoques fécaux, et décrira comment vérifier la présence de contamination fécale.

La technique de filtration membranaire utilise la pression négative pour prélever des échantillons d’eau à travers un filtre et piéger les bactéries. Le filtre est une membrane spécialisée avec une taille moyenne minimale de pores de 0,45 μm qui permet de capturer les bactéries, qui ont généralement une taille d’environ 1 μm. Après filtration, la membrane est appliquée sur un milieu de croissance d’agarose et incubée dans des conditions appropriées pour la culture des micro-organismes cibles.

Cette technique est idéale pour les sources de faible turbidité telles que l’eau potable, les piscines ou les lacs et les réservoirs. Une eau riche en particules peut entraîner l’encrassement ou l’obstruction du filtre, limitant ainsi le volume pouvant être traité. De plus, la filtration membranaire n’est pas pratique pour les sources d’eau contenant un grand nombre de bactéries de fond ou de bactéries non coliformes, comme les eaux usées brutes, car cela peut augmenter la difficulté de dénombrer les coliformes cibles lors de la culture et de l’incubation.

Une fois que les échantillons bactériens ont été piégés dans le filtre, ils peuvent être transférés sur des plaques de croissance pour déterminer les types de bactéries indicatrices présentes dans les échantillons d’eau. Le placage sur différents types de milieux sélectionne différents types de bactéries et peut permettre une identification rapide.

Après la croissance sur des plaques spécifiques à la culture, il est possible de confirmer davantage l’identité des bactéries indicatrices à l’aide de techniques telles que le prélèvement des colonies dans un milieu liquide et l’utilisation de tubes Durham pour capturer les gaz, qui ne doivent être produits qu’en présence de coliformes fécaux ou de coliformes totaux. De plus, les entérocoques fécaux suspectés peuvent être confirmés par une combinaison d’une coloration de Gram positive et d’un test négatif au peroxyde d’hydrogène-catalase.

Maintenant que nous connaissons les principes de la filtration membranaire des échantillons d’eau, voyons comment cette procédure est réalisée.

Pour commencer la procédure, prélevez d’abord des échantillons d’eau à partir de sources d’eau d’essai d’intérêt. S’assurer que les échantillons sont prélevés dans des bouteilles stériles de 1 L. Une fois la collecte terminée, placez les échantillons sur de la glace et transportez-les au laboratoire pour une analyse microbienne.

Pour commencer l’analyse, stérilisez d’abord un collecteur de filtration membranaire. Ensuite, connectez le collecteur à une pompe à vide et à une fiole de filtration contenant de l’eau de Javel.

Stérilisez à la flamme à l’éthanol les pinces et retirez une membrane grillagée stérile de l’emballage. Placez le filtre au centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et appliquez un entonnoir de filtre stérile sur l’unité, puis fixez-le en place.

Mesurez le volume d’eau d’essai souhaité dans l’entonnoir. Appliquez un vide partiel pour aspirer l’échantillon de test à travers le filtre. Les matières solides en suspension, y compris les bactéries et autres matières organiques, supérieures à 0,45 μm seront piégées sur ou à l’intérieur du filtre, tandis que les particules plus petites, les virus et les solides dissous passeront dans la fiole à déchets contenant de l’eau de Javel.

Une fois que l’échantillon est passé à travers le filtre, rincez 3 fois l’intérieur de l’entonnoir avec 25 ml d’eau stérile, en le laissant passer à travers le filtre. Une fois le rinçage final terminé, débranchez l’aspirateur et retirez l’entonnoir du collecteur.

Ensuite, stérilisez à la flamme à l’éthanol la pince et retirez immédiatement le filtre à membrane de l’unité. Placez-le sur la plaque de croissance appropriée pour le micro-organisme cible en utilisant un mouvement de roulement pour assurer un contact complet avec la surface et éviter de piéger les bulles d’air.

Pour le traitement de chaque échantillon supplémentaire, désinfectez le collecteur en acier inoxydable et utilisez un entonnoir stérile pour éviter la contamination croisée. Enfin, placez les plaques dans un incubateur pour la période d’incubation appropriée.

Après la période d’incubation, retirer les plaques de l’incubateur pour le dénombrement. Si possible, effectuez le comptage des colonies sous un faible grossissement à l’aide d’une source de lumière blanche froide. Pour déterminer le nombre total de coliformes, identifiez et comptez les colonies qui apparaissent de couleur rose à rouge foncé et dont la surface métallique est entièrement ou partiellement recouverte d’un éclat métallique. Les colonies de coliformes totaux atypiques peuvent apparaître rouge foncé, mucoïdes ou nucléées sans brillance.

Les colonies qui apparaissent bleues, blanches, incolores ou roses sans éclat sont considérées comme des non-coliformes et ne doivent pas être incluses dans le dénombrement total des coliformes.

Les colonies de coliformes fécaux apparaîtront sous la forme de différentes nuances de bleu, et celles-ci doivent être comptées comme une catégorie distincte. Les colonies de coliformes non fécaux sont généralement de couleur grise à crème et doivent également être enregistrées dans une catégorie individuelle. Enfin, les colonies d’entérocoques fécaux varieront du rose au rouge foncé et doivent être comptées séparément.

Pour vérifier la présence totale de colonies de coliformes, il faut appliquer une boucle d’inoculation stérilisée et refroidie à une seule colonie d’intérêt. Transférez la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon de lauryltryptose et un tube de Durham. Ensuite, placez les cultures dans un incubateur. La présence de turbidité et la production de gaz capturée par le tube de Durham permettent de confirmer que la colonie est un coliforme total.

Pour la vérification des coliformes fécaux, transférez aseptiquement les colonies de couleur bleue dans des récipients en verre contenant un milieu EC stérile et un tube Durham. Placez les tubes inoculés dans un incubateur. Après l’incubation, les inoculats troubles associés à la production de gaz confirment que la colonie est un coliforme fécal.

Pour confirmer les entérocoques fécaux, transférez aseptiquement les colonies suspectes avec la morphologie correcte sur des plaques de gélose de perfusion cerveau-cœur, puis incuberez. Ensuite, transférez la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre stériles.

Ajoutez 2-3 gouttes de peroxyde d’hydrogène à 3 % sur l’une des lames de verre. Une production rapide de gaz indique une bactérie positive à la catalase telle que Citrobacter. Les entérocoques fécaux sont négatifs à la catalase ; Par conséquent, aucun bouillonnement n’est observé. Pour les colonies négatives à la catalase qui ne présentent pas de bulles, effectuez une coloration de Gram. En tant qu’entérocoques fécaux, ceux-ci doivent apparaître à Gram positif, de forme ovoïde et être regroupés principalement en paires ou en chaînes courtes.

La présence de l’une de ces bactéries indicatrices dans une source d’eau indique la présence d’une contamination. Si plus de 5 % des échantillons sont contaminés sur une période d’un mois, la source peut être considérée comme impropre à la consommation humaine.

La filtration membranaire est couramment utilisée dans un certain nombre d’applications biologiques, et les organismes indicateurs fécaux peuvent également être détectés par d’autres procédures expérimentales. Certaines de ces applications sont explorées ici.

La filtration membranaire peut également être utilisée pour la capture de virus à partir d’échantillons d’eau. Comme les virus sont généralement présents à de très faibles concentrations, les échantillons d’eau doivent être concentrés afin de les capturer et de les analyser. Les virus capturés peuvent ensuite être libérés des filtres et identifiés à l’aide de techniques telles que les tests d’infectiosité des cultures cellulaires ou la PCR.

La filtration membranaire est également utilisée dans la production d’eau de haute pureté à usage industriel ou de laboratoire. De nombreuses industries ont besoin d’eau hautement purifiée pour leurs processus opérationnels, et la filtration membranaire peut servir à éliminer les contaminants, y compris les métaux dissous indésirables et les sels de l’eau. Il peut également être utilisé dans le dessalement de l’eau salée pour produire de l’eau potable.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’identification des organismes indicateurs dans l’eau par filtration membranaire. Vous devriez maintenant comprendre comment filtrer sur membrane des échantillons d’eau, comment cultiver plusieurs types de bactéries fécales indicatrices à partir de la membrane et comment confirmer qu’il s’agit d’organismes indicateurs. Merci d’avoir regardé !