Isolement des bactéries fécales à partir des échantillons d'eau par filtration

1. prélèvement d’échantillons et de traitement de l’eau

1. Recueillir plusieurs échantillons de 1 L eau de la source d’eau de test (p. ex. les fontaines d’eau, piscines, réservoirs, systèmes de distribution d’eau, des eaux usées brutes ou traitées) et le transport sur la glace au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Stériliser ou désinfecter l’ensemble collecteur de filtration membranaire avant utilisation par autoclavage, l’exposition à l’inflammation de rayonnement (2 min) ou éthanol-flamme UV.
3. Lors du refroidissement de toutes les parties, brancher correctement le collecteur à un flacon pompe à vide et le vide de déchets par des filtration, contenant l’eau de Javel.
4. Éthanol-flamme stériliser une paire de pinces et avec eux, retirer un filtre à membrane stérile, quadrillées de son emballage. Membranes de 47 mm de diamètre avec une taille de pores de 0,45 µm sont généralement utilisés. Toutefois, autres diamètres et la taille des pores peut être utilisée sous réserve que la taille des pores peut piéger suffisamment les microorganismes de la cible, et au moins 70 % de la zone de filtre se compose de l’espace poral.
5. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité et le fixer en place.
6. Mesurer le volume d’eau désiré (par exemple 100 mL) et l’ajouter à l’entonnoir (une marque de 100 mL est visible sur l’entonnoir).
7. Appliquer un vide partiel [pression différentielle de 34 à 51 kPa (kiloPascals)] afin d’en tirer l’échantillon d’essai à travers le filtre. Total des matières solides en suspension, y compris les bactéries et la décomposition de la matière organique, plus grande que le filtre moyenne taille des pores de 0,45 µm sont pris au piège sur le filtre. Les particules plus petites y compris les virus et solides tels que de petites quantités de matière organique et sels dissous va passer à travers la membrane et dans la fiole à vide poubelle contenant l’eau de Javel.
8. La suite complète passage de l’échantillon à travers le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec deux ou trois volumes de 20 à 30 mL d’eau stérile.
9. L’aspirateur hors tension et retirez l’entonnoir de la tubulure après la fermeture du rinçage final.
10. Avec une pince stérile éthanol-flamme, retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil et le placer rapidement sur le milieu approprié d’agarose pour le microorganisme cible (le tableau 1 répertorie les conditions de médias et d’incubation de croissance recommandées pour chacun).
11. Appliquer le filtre de membrane à la surface d’agarose par un mouvement de type à rouleau pour assurer le contact complet de la membrane avec le milieu de croissance et pour éviter le piégeage de bulles d’air.
12. Remplacer l’entonnoir de filtration utilisé avec une unité stérile entre le traitement de chaque échantillon et éthanol-assainissez le collecteur en acier inoxydable afin de prévenir la contamination croisée.

2. colonie Enumeration

1. Après la période d’incubation, enlever les plaques de croissance de l’incubateur pour l’énumération.
2. Idéalement, effectuer les comptages de colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière froide, blanche.
3. Coliformes totaux
   1. Des colonies de coliformes totales sont généralement roses à rouge foncé en couleur avec une surface métallique brillant. L’éclat lui-même peut partiellement ou complètement couvrir la colonie. Morphologies atypiques colonies de coliformes totales peuvent être rouge sombre, mucoïde ou nucléée sans reflet.
   2. Les colonies qui sont rose, bleu, blanc ou incolore tout en manquant de brillance sont considérés comme non-coliformes.
4. Les coliformes fécaux
   1. Les colonies de coliformes les apparaissent dans plusieurs nuances de bleu.
   2. Les colonies de coliformes fécales sont gris à la crème de couleur.
5. Entérocoques fécaux
   1. Gamme de colonies les entérocoques fécaux du rose au rouge foncé en couleur.

3. colonie vérification

1. Coliformes totaux
   1. Pour une vérification de la présence-absence, tamponner la membrane toute en utilisant une boucle inoculation stérile. Pour les colonies, il est préférable de vérifier au moins cinq chacun des morphologies typiques et atypiques.
   2. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon lauryl tryptose avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 35±0.5 ° C pendant 48 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme.
2. Les coliformes fécaux
   1. Transférer des colonies de couleur bleues aseptiquement dans les récipients en verre contenant stérile milieu EC avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 44,5 ± 0,2 ° C pendant 24 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme fécal.
3. Entérocoques fécaux
   1. Grève des colonies caractérisant la morphologie les entérocoques fécaux pour isolement aseptiquement sur cerveau-cœur Infusion Agar (BHIA) et incuber à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 à 48 h.
   2. Transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre préalablement nettoyé.
   3. Ajouter deux à trois gouttes d’eau oxygénée à 3 % de frottis préparés sur les diapositives. L’apparition rapide de bulles indique un résultat de « catalase positive » et l’isolat n’est pas une bactérie streptocoque fécal.
   4. Effectuer une coloration de Gram pour les isolats essais comme « catalase négative » (pas de bulles observées). Les entérocoques fécaux sont Gram-positif, ovoïdes et apparaissent surtout en paires ou en courtes chaînes.

Indicateur bactérienne fécale	Les médias recommandées (Température d’incubation, temps) 1
Coliformes totaux	LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24h) Milieu M-Endo (35 ± 5 ° C, 24h)
Les coliformes fécaux	m-FC moyenne (44,5 ± 0,2 ° C, 24h)
Entérocoques fécaux	m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Le tableau 1. Milieux de culture culture couramment utilisés pour la détection des indicateurs bactériens les dans les échantillons environnementaux
¹ tel que recommandé par les Méthodes Standard pour l’examen de l’eau et des eaux usées (American Public Health Association et l’American Water Works Association, 22^ème édition, 2012)