Chromatographie sur colonne
Source : Laboratoire du Dr Jimmy Franco - Merrimack College
Chromatographie sur colonne est l’une des techniques plus utiles pour la purification de c…
1. le Gel de silice lisier
- Verser le gel de silice dans un erlenmeyer. Le poids de l’emballage doit être à peu près 50 fois celui de l’échantillon étant séparé. Si les composés séparés ont des valeurs de Rf très semblables, il peut exiger à l’aide d’une grande quantité de silice par échantillon, c’est le cas dans cet exemple.
- Placer 10 g de silice dans l’erlenmeyer, étant donné que 50 mg d’échantillon (45 mg de fluorénone et 5 mg de tétraphénylporphyrine) sont être isolé.
- Ajouter le système de solvant (hexane/dichlorométhane, 70 % : 30 %) dans l’erlenmeyer contenant le gel de silice. Ajouter suffisamment de solvant pour s’assurer que le gel de silice est bien solvaté. La silice se dissout pas, mais le mélange sera visuellement perceptible quand solvatés. Après avoir ajouté le solvant agiter l’erlenmeyer pour s’assurer que toute la silice est bien solvatés.
2. préparation de la colonne
- Sélectionnez la colonne de taille appropriée. Généralement, la colonne doit être remplie à mi-chemin avec du lisier de gel de silice. Plus l’échantillon étant purifiée, plus la colonne requis.
- Branchez le bas de la colonne avec un morceau de laine de verre. En utilisant une longue tige, assurez-vous que la laine soit solidement logée dans le bas de la colonne, juste au-dessus du robinet d’arrêt.
- Une fois que la laine est fermement en place, appliquer une mince couche de sable sur la laine de verre.
Remarque : Si la colonne est équipée de fritte de verre au-dessus du robinet d’arrêt, cette étape devrait être supprimée. - Fixer la colonne en position verticale à une position de l’anneau.
- À l’aide d’un entonnoir, verser doucement le coulis préparé de gel de silice dans la colonne. Vous devrez peut-être ajouter le solvant supplémentaire pour transférer la boue de l’erlenmeyer à la colonne. À l’aide d’une pipette, rincer tout gel de silice qui se colle aux parois de la colonne.
- Comme le gel de silice s’installe dans la colonne, tapoter délicatement les côtés de la colonne pour que le gel de silice emballe hermétiquement et exclut les bulles d’air.
- Ouvrir le robinet et laisser solvant s’écouler dans un erlenmeyer jusqu'à juste avant le gel de silice et le solvant avant de répondre. Le gel de silice ne devrait jamais aller sec jusqu'à ce que la procédure est terminée.
- Étalez une fine couche de sable sur le dessus du gel de silice (Figure 1). À l’aide d’une pipette, rincer tout sable qui peut avoir coincé aux côtés de la colonne.
- Drain de solvants supplémentaires jusqu'à ce que le sable est sec, mais pas jusqu'à la couche de gel de silice.
La figure 1. Le programme d’installation approprié pour une chromatographie sur colonne expérimenter avant l’addition de l’échantillon.
3. ajouter l’échantillon à la colonne
- Dissoudre l’échantillon dans la plus petite quantité de solvant possible (en utilisant le même solvant qui servait à fabriquer le lisier de gel de silice).
- À l’aide d’une pipette, ajouter doucement l’échantillon vers le haut de la colonne.
- Une fois que l’échantillon a été appliqué à la partie supérieure de la colonne, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la couche de sable mais pas la couche de gel de silice. Une très petite quantité de solvant permet d’arroser tout échantillon qui peut-être se sont accrochés aux parois de la colonne. Drainer ce solvant supplémentaire par le biais de la couche de sable aussi bien.
4. à élution de l’échantillon dans la colonne
- À l’aide d’une pipette, ajouter très doucement de 4 à 5 mL de solvant d’une façon qui ne perturbe pas la couche de sable.
- Placez un entonnoir au sommet de la colonne et très lentement et doucement remplir le reste de la colonne avec le solvant.
- Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la colonne.
- Commencer à percevoir la phase mobile, tel qu’il s’écoule de la colonne dans des éprouvettes.
- Tubes de test devraient être placés dans un tube à essai rack de manière séquentielle.
- Ajouter solvant supplémentaire vers le haut de la colonne si nécessaire jusqu'à ce que tous les composés désirés ont élué de la colonne.
5. récupérer les constituants
- Si les composés sont colorés, puis ils sont visuellement reconnaissables. Toutefois, si les composés sont incolores, ils devront être identifiés à l’aide d’ulta-visible (UV) ultra-violette (si les composés contiennent la conjugaison) ou avec la tache appropriée. La pureté des composés peut être vérifiée à l’aide de la chromatographie sur couche mince.
- Identifier les tubes qui contiennent les composés désirés.
- Fusionner toutes les fractions qui contiennent les composés isolés désiré dans un ballon (RB) préalablement pesé. Procéder ainsi pour chaque composé étant isolé.
- Laisser évaporer le solvant en plaçant le ballon RB sur l’évaporateur rotatif.
- Une fois la totalité du solvant a été supprimé, peser le RB avec produit séché et soustraire le poids initial de la RB pour obtenir un rendement.
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La chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalente utilisée pour séparer les composés dans une solution. Un mélange de solution est transporté par un solvant à travers une colonne contenant un solide adsorbant, appelée phase stationnaire. Le mélange combiné de solvant et d’échantillon est appelé phase mobile.
Les molécules de la phase mobile se déplacent à travers la colonne à des vitesses différentes en fonction de leurs propriétés chimiques et de leur affinité pour la phase stationnaire. Ainsi, chaque composé sort de la colonne à un moment différent. Une fois que les composés ont été séparés et purifiés, ils peuvent être traités ultérieurement ou sont prêts à être distribués. Cette vidéo présentera les bases de la chromatographie sur colonne, puis démontrera la technique avec la purification des composés organiques.
Dans la chromatographie sur colonne, les molécules s’adsorbent de manière réversible sur la phase stationnaire lorsqu’elles traversent la colonne, ralentissant ainsi leur progression. Les composés qui interagissent faiblement avec la phase stationnaire sortent plus rapidement de la colonne, ou élués. Les composés qui interagissent fortement avec la phase stationnaire sont plus lents à éluer. La phase stationnaire est une poudre ou un gel adsorbant tel que le gel de silice ou l’alumine. Le gel de silice et l’alumine sont hautement polaires, ils interagissent donc fortement avec les composés polaires et les solvants, et faiblement avec les molécules non polaires. La phase stationnaire est chargée dans la colonne sous forme de boue avec le solvant, puis est remplie par un solvant circulant à travers la phase stationnaire. Lorsqu’elle est correctement emballée, la phase stationnaire est homogène de haut en bas et ne contient pas de bulles d’air ni de zones sèches, car l’écoulement irrégulier causé par ces irrégularités interfère avec la séparation des composés. Le solvant, ou éluant, est généralement un solvant organique fourni à partir d’un réservoir. En général, les solvants non polaires n’éluent que les composés non polaires, tandis que les solvants polaires éluent les composés polaires et non polaires. Si un mélange contient des composés de polarités significativement différentes, une série de solvants de plus en plus polaires peut être utilisée pour éluer tous les composés d’intérêt. Le débit de phase mobile est généralement contrôlé par un robinet d’arrêt situé au bas de la colonne. Les pauses d’écoulement sont réduites au minimum pour éviter la diffusion des composés. La phase mobile sortant de la colonne, appelée éluat, est recueillie en fractions pour préserver la séparation des composés. Maintenant que vous comprenez les principes de la chromatographie sur colonne, passons en revue une procédure de purification d’un mélange de composés organiques.
Pour commencer la procédure, procurez-vous l’équipement indiqué dans le texte. Peser une fiole à fond rond pour chaque composé à isoler et noter la masse. Ensuite, pesez l’échantillon et dissolvez-le dans le volume minimum de solvant nécessaire. Le solvant approprié doit être prédéterminé à l’aide de la chromatographie sur couche mince. La valeur Rf doit être comprise entre 0,2 et 0,3. Ensuite, déterminez la quantité de gel de silice nécessaire pour la phase stationnaire en fonction du poids sec de l’échantillon et de la différence de distance de migration des composés d’intérêt sur la base du pré-criblage CCM. Versez la quantité appropriée de gel de silice dans un erlenmeyer. Ajouter le solvant au gel de silice jusqu’à ce que la boue soit translucide et se déplace librement lorsque le ballon est agité. Ensuite, sélectionnez une colonne suffisamment grande pour que le gel de silice la remplisse à moitié. Si la colonne n’a pas de fritte de verre, placez de la laine de verre dans la colonne et appuyez fermement sur le fond avec une longue tige. Recouvrez la laine de verre d’environ 2 cm de sable pour éviter que la silice ne passe à travers la laine de verre. Dans une hotte, fixez la colonne à un support annulaire, en laissant suffisamment d’espace en dessous pour accueillir les tubes à essai.
Placez un entonnoir dans la colonne et assurez-vous que le robinet d’arrêt est fermé. Versez la boue dans la colonne, en tapotant doucement les côtés pendant que la boue se dépose pour exclure les bulles d’air. Rincez l’entonnoir, le ballon et les parois de la colonne avec un solvant pour transférer tout le gel dans la colonne.
Placez un erlenmeyer sous la colonne. Ouvrez le robinet et laissez le solvant s’écouler dans le ballon jusqu’à ce que le niveau de solvant soit juste au-dessus du gel de silice, puis fermez le robinet d’arrêt. Versez environ 2 cm de sable sur le gel. Rincez doucement le sable collé sur les côtés de la colonne avec un solvant. Égouttez le solvant au besoin afin que le sable soit presque sec, mais que la silice reste complètement recouverte.
Pour commencer la séparation, ajoutez l’échantillon à la colonne sans déranger le sable. Utilisez de petites portions de solvant pour rincer tout échantillon adhérant aux parois de la colonne et pour rincer le récipient de l’échantillon. Égouttez soigneusement le solvant jusqu’à ce que le niveau soit juste au-dessus de la silice. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez doucement 4 à 5 mL de solvant sans perturber la couche de sable. Placez un entonnoir dans la colonne et remplissez-le lentement de solvant. Retirez le ballon et remplacez-le par un tube à essai étiqueté. Une fois le premier tube à essai en place, ouvrez le robinet d’arrêt et recueillez l’éluat jusqu’à ce que le tube à essai soit presque plein.
Continuez à collecter les fractions jusqu’à ce que tous les composés souhaités aient été élués, en procédant séquentiellement à travers les tubes à essai marqués. Lorsque vous avez terminé, fermez le robinet d’arrêt.
Pour chaque composé isolé, combinez les fractions pures dans une fiole à fond rond pré-pesée. Retirer le solvant du ballon sur un évaporateur rotatif, puis peser le ballon à fond rond contenant le composé sec. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur l’évaporation rotative.
Cet échantillon contenait un mélange de tétraphénylporphyrine, ou TPP, et de fluorénone. Le TPP rouge-violet foncé a été élué en premier, suivi de la fluorénone jaune. La pureté de chaque composé isolé a été confirmée par spectroscopie RMN.
La chromatographie sur colonne est utilisée dans la purification et l’analyse dans une variété de domaines scientifiques.
La chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une forme de chromatographie sur colonne qui offre une excellente séparation entre les composés et peut intégrer des détecteurs spécialisés tels qu’un détecteur de rayonnement pour les molécules radiomarquées. En utilisant la HPLC, un phospholipide radiomarqué peut facilement être isolé d’un mélange de nombreux autres, même s’il ne représente qu’un petit pourcentage du mélange. Ces informations peuvent aider à élucider la production, la régulation et les fonctions de nombreuses biomolécules importantes.
La chromatographie flash est une variante de la chromatographie sur colonne dans laquelle la phase mobile se déplace à travers la colonne sous la pression de l’air ou du gaz plutôt que par l’écoulement gravitaire seul.
Cela crée un débit plus rapide, minimisant la diffusion pour une meilleure séparation. Le composé souhaité est collecté en quelques fractions pures et concentrées, comme le montre la chromatographie sur couche mince, ce qui permet d’obtenir un excellent rendement et une excellente pureté après purification.
L’appareil à colonne habituel n’est pas approprié pour séparer de petits volumes, mais certains mélanges ne sont pas compatibles avec des techniques spécialisées telles que l’HPLC. La purification à petite échelle est réalisée à l’aide de colonnes de pipette en verre, avec une poire de pipette utilisée pour la chromatographie flash à petite échelle. Ceci est particulièrement utile lors de la préparation d’un échantillon pour des techniques de purification spécialisées ou comme étape finale après une purification à grande échelle.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la chromatographie sur colonne. Vous devriez maintenant être familiarisé avec les principes de la chromatographie sur colonne, une procédure pour la chromatographie sur colonne sur gel de silice et certaines applications de la technique.
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Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.