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La perte d’échantillon peut se produire chaque fois qu’un échantillon est manipulé ou transféré, ce qui rend difficile le calcul précis de la concentration.
Pour garantir l’exactitude, les effets de la perte d’échantillon doivent être minimisés en préparant soigneusement les échantillons et en limitant le nombre d’étapes de manipulation et de transfert des échantillons. Cependant, la perte d’échantillon peut également se produire en raison d’erreurs systématiques, telles que la manipulation incomplète de l’échantillon, les effets de matrice et les variations dans la procédure analytique.
Ces sources de perte peuvent être expliquées en ajoutant une concentration connue d’une espèce similaire, mais non identique, au composé d’intérêt. C’est ce qu’on appelle une norme interne. Toute perte d’échantillon par rapport à l’étalon interne doit être similaire pour l’analyte, ce qui permet de calculer avec précision la concentration.
Cette vidéo illustre l’utilisation d’un étalon interne et d’une technique de laboratoire appropriée pour tenir compte de la perte d’échantillon lors de la détermination de la concentration d’un inconnu.
Un étalon interne est une substance ajoutée en quantité connue à des étalons, des échantillons et des blancs au cours d’une analyse.
En chromatographie et en spectroscopie, le rapport entre le signal de l’étalon interne et celui de l’analyte est calculé. Ce rapport, appelé facteur de réponse, est proportionnel au rapport entre l’analyte et les concentrations standard.
Le facteur de réponse, R, peut être exprimé par l’équation suivante, où A représente les signaux analytiques de l’échantillon et de l’étalon interne et C représente les concentrations de l’échantillon et de l’étalon interne.
Une norme interne peut compenser à la fois les erreurs systématiques et aléatoires. Par exemple, les erreurs aléatoires, telles que les incohérences lors de la mesure d’un échantillon, seront les mêmes pour l’étalon interne et l’analyte. Par conséquent, le rapport de leurs signaux ne changera pas.
Pour les erreurs systématiques, telles que les effets de matrice en solution, le rapport ne sera pas affecté tant que l’effet de matrice est égal à la fois pour l’étalon et l’analyte.
Bien que les normes internes offrent de grands avantages, il peut être difficile d’en choisir une qui convient. Un étalon interne doit avoir un signal similaire, mais pas identique, à l’analyte. Il ne peut pas non plus affecter la mesure de l’analyte de quelque manière que ce soit.
Enfin, la concentration doit être bien connue. Pour ce faire, il faut s’assurer que l’étalon interne n’est pas présent nativement dans l’échantillon ; Ainsi, la seule source de celui-ci en solution est la concentration connue ajoutée.
Dans l’expérience suivante, la concentration de caféine dans un échantillon inconnu sera déterminée par chromatographie en phase gazeuse.
Ceci est réalisé en créant une courbe d’étalonnage à l’aide de solutions de caféine connues, avec de l’adénine comme étalon interne. La pente de la courbe d’étalonnage est égale au facteur de réponse.
Une fois que le facteur de réponse est connu, la concentration de l’inconnu peut être calculée à partir de son rapport de surface de chromatogramme mesuré.
Maintenant que vous comprenez les bases des normes internes, jetons un coup d’œil à la procédure.
Pour commencer la procédure, pesez avec précision 100 mg de l’étalon interne, l’adénine, dans un bécher propre.
Ensuite, dissolvez-le dans environ 20 ml de sulfoxyde de diméthyle et mélangez la solution.
Une fois l’adénine dissoute, verser la solution dans une fiole jaugée de 50 ml.
Rincez le bécher et le bâton d’agitation avec 10 ml de DMSO et versez le rinçage dans le ballon. Répétez ce rinçage deux fois, pour assurer un bon transfert de solution. Remplir jusqu’à la marque d’étalonnage, ce qui permet d’obtenir un étalon interne d’une concentration de 2 mg/mL.
Ensuite, pesez 100 mg de caféine dans un bécher pour préparer une solution mère. Dissoudre la caféine avec une petite quantité de méthanol. Ensuite, utilisez 3 rinçages pour transférer cette solution dans une fiole jaugée fraîche de 25 ml. Il s’agit de la solution mère à 4 mg/mL. Utilisez-le pour créer 3 normes de caféine.
Ensuite, ajoutez 0,2 mL de l’étalon interne, l’adénine, dans chaque flacon. Remplissez chacun jusqu’au volume final avec du méthanol. Transférez chaque solution dans un flacon d’échantillon.
Passez chaque étalon de caféine dans un chromatographe en phase gazeuse. Calculez le rapport entre les surfaces de pic de caféine et l’adénine standard.
Tout d’abord, pesez 2 g de café dans un bécher de 100 ml et notez le poids.
Ensuite, ajoutez 20 ml de méthanol pour extraire la caféine du café. Laisser la solution remuer pendant 20 min.
À l’aide d’un entonnoir B ?chner, filtrez le marc de café. Rincez le bécher avec une petite quantité de méthanol et versez ce rinçage dans l’entonnoir. Répétez le rinçage deux fois.
Mesurer le volume final du filtrat ; il doit être d’environ 35 ml.
Pour préparer l’échantillon à l’analyse, ajoutez 1 mL d’extrait de café dans un flacon d’échantillon. Ensuite, ajoutez 0,2 ml de l’étalon interne d’adénine et placez le flacon dans le support de l’échantillonneur automatique de l’instrument.
Effectuez une analyse par chromatographie en phase gazeuse de l’échantillon, en vous assurant que les conditions sont telles que la caféine et l’adénine sont séparées.
Une fois l’analyse terminée, calculez l’aire du pic pour l’étalon interne et l’analyte.
Une fois que tous les échantillons ont été analysés, la courbe d’étalonnage standard peut être déterminée pour les solutions de caféine/adénine en traçant les rapports des zones de pics en fonction des rapports des concentrations. La pente de cette droite, qui représente le facteur de réponse, était de 1,8.
Ensuite, les données GC de l’échantillon de café extrait sont analysées. Le rapport des zones de pointe a été calculé à 1,78. À l’aide du facteur de réponse et de la concentration connue de l’étalon interne, l’adénine, la concentration de caféine dans l’échantillon inconnu a été calculée à 0,33 mg/mL.
De nombreux types de réactions différents, chez divers disciples scientifiques, utilisent des normes internes pour minimiser les effets des erreurs et de la perte d’échantillons.
Les effets de la perte d’échantillon rencontrée lors de la préparation de l’échantillon peuvent être minimisés à l’aide d’étalons internes, en maintenant leur rapport de concentration presque constant.
Dans cet exemple, des lipides bioactifs ont été extraits de cellules lysées à l’aide d’un procédé d’extraction liquide-liquide. Des étalons internes d’isotopes stables ont été ajoutés au début de l’extraction pour tenir compte des erreurs lors de la préparation de l’échantillon.
Les étalons internes étaient non seulement essentiels pour la préparation des lipides bioactifs, mais aussi pour l’analyse. Les lipides ont été séparés à l’aide d’une chromatographie liquide à haute performance et analysés par spectrométrie de masse.
En spectroscopie, les étalons internes peuvent aider à corriger les erreurs aléatoires dues aux changements d’intensité de la source lumineuse. Si une lampe ou une autre source lumineuse a une puissance variable, cela affectera l’absorption et, par conséquent, l’émission d’un échantillon. Cependant, le rapport entre un étalon interne et un analyte restera constant, même si la source lumineuse ne le fait pas.
En chromatographie, l’une des plus grandes sources d’erreur est l’injection. Les échantillonneurs automatiques aident à minimiser cela, mais l’erreur peut toujours être de 1?2 % d’écart-type relatif.
Dans cet exemple, des étalons de vapeur contenant un étalon interne ont été analysés à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse pour établir une courbe d’étalonnage. Une fois cette opération terminée, l’échantillon inconnu a pu être mesuré et les pertes dues à la volatilité de l’échantillon ont été prises en compte.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE aux normes internes. Vous devez maintenant comprendre les meilleures pratiques pour minimiser la perte d’échantillons, les normes internes et les facteurs de réponse.
Merci d’avoir regardé !
