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Analytical Chemistry

Étalon interne

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Internal Standards

3.1: Sample Preparation for Analytical Characterization

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

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09:18 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton – University of Virginia

L’objectif de nombreuses analyses chimiques est une analyse quantitative, où la quantité d’une substance dans un échantillon est déterminée. Afin de calculer avec précision la concentration d’un inconnu dans un échantillon, la préparation minutieuse est clé. Chaque fois qu’un échantillon est manipulé ou transféré, certains de l’échantillon peuvent être perdus. Il y a cependant, stratégies pour minimiser la perte de l’échantillon. Il y a aussi des stratégies pour faire face à la perte de l’échantillon et toujours en faisant des mesures précises de concentration.

Pour minimiser la perte de l’échantillon, l’idéal est de réduire au minimum le nombre d’étapes de manutention et de transfert échantillon. Par exemple, sa masse d’un échantillon solide directement dans une fiole qu’une solution se fera en réduit une étape de transfert. S’il est nécessaire de transférer d’un ballon à l’autre et une dilution est faite, puis triple rincer la verrerie permet de garantir que tout l’échantillon est transféré. Autres stratégies sont plus spécifiques à l’échantillon. Par exemple, les échantillons qui s’adsorber sur verre, comme les protéines, pourraient mieux être manipulés dans des tubes jetables en polypropylène. Les tubes ne sont pas hydrophiles, donc si une petite quantité d’échantillon doit être reversé dans l’eau, il est préférable d’avoir déjà ajouté l’eau dans le tube, donc l’échantillon peut être distribué directement dans le solvant. Il peut être préférable de se concentrer, plutôt que de les sécher complètement un échantillon, en raison de pertes d’insolubilities après réhydratation.

Une autre source de perte d’échantillon est par des manipulations échantillon incomplet. Par exemple, si une procédure de dérivation est utilisée et la dérivation est incomplète, alors la totalité de l’échantillon n’est pas observée. Les erreurs comme celle-ci sont des erreurs systématiques et peuvent être résolus en corrigeant le problème, comme la modification de la procédure de dérivation. Une autre cause de l’erreur systématique des mesures est des effets de matrice. Ceux-ci peuvent interférer avec la mesure de certaines substances et étalonnages performants dans la même matrice que l’échantillon peut réduire cet effet.

L’analyse quantitative est généralement effectuée à l’aide de normes soit externes ou internes. Pour des normes extérieures, une courbe d’étalonnage est faite en mesurant les différentes concentrations connues de l’analyte d’intérêt. Ensuite, l’échantillon est exécutée séparément de la norme. Pour les étalons internes, la norme est dans le même échantillon que l’analyte d’intérêt, ce qui permet la mesure à prendre en même temps. En règle générale, une espèce différente est ajoutée à l’appelé de l’étalon interne et le rapport de la réponse de l’étalon interne et l’analyte est calculé. L’idée est que le ratio de la réponse, appelé le facteur de réponse, est proportionnel à leur concentration. Alors que la méthode doit être en mesure de distinguer entre l’analyte d’intérêt et de l’étalon interne, les pertes d’échantillon qui se produisent après que l’étalon interne est ajouté devraient être similaires pour les deux substances et donc le ratio de la réponse reste la même. Un cas particulier de l’utilisation de normes internes est la méthode des ajouts dosés, où les quantités croissantes de l’analyte sont ajouté à la solution et le montant initial de l’analyte est calculée. Normes internes peuvent être utilisés en chromatographie, électrochimie et la spectroscopie.

Principles

Un étalon interne est une substance ajoutée à un montant constant à un échantillon, vierge et standard dans une analyse. Un étalon interne peut compenser les erreurs systématiques et aléatoires. Par exemple, s’il y a des fluctuations d’instrument qui causent des erreurs aléatoires dans la mesure, ces fluctuations sont censées être les mêmes pour l’étalon interne et l’analyte et donc le rapport entre les signaux ne change pas. Pour les erreurs systématiques, telles que les effets de matrice du solvant, aussi longtemps que l’effet est égal pour la norme et l’analyte, le ratio est à nouveau affecté.

L’inconvénient des étalons internes, c’est qu’il est difficile de trouver un étalon interne approprié. L’étalon interne doit avoir un signal qui est similaire à l’analyte, mais suffisamment différent pour qu’il se distingue par l’instrument. En outre, l’étalon interne ne devrait pas exister dans la matrice de l’échantillon, afin que l’étalon ajouté est la seule source de la norme. Occasionnellement, un constituant majeur d’un échantillon qui est constant dans la concentration peut être utilisé comme étalon interne au lieu d’un étalon ajouté, mais la concentration doit être connue pour ce composant. L’étalon interne ne devrait pas non plus supprimer ou améliorer le signal de l’analyte.

En chromatographie, une des plus importantes sources d’erreur est souvent l’injection. Si les injections manuelles sont utilisés, on peut erreurs dans la seringue de chargement correctement. Les volumes sont généralement petits (~ 1 µL) donc il existe des incertitudes en injectant reproductibles ce petit un volume, souvent un couple de pourcentage écart-type relatif (RSD). En chromatographie en phase gazeuse (GC), l’échantillon est injecté dans un port chauffé et l’évaporation de la pointe de l’aiguille peut entraîner des variations de volume injecté. Auto-échantillonneurs aident avec l’erreur dans le chargement de la seringue et l’erreur en injectant rapidement pour éviter l’évaporation en GC, mais l’erreur peut être encore 1 ou 2 % RSD. Avec la chromatographie, aire du pic est généralement utilisé au lieu de la hauteur des pics, que les sommets obtenir plus large et plus court avec le temps, mais la surface du pic est constante. Ainsi, pour les étalons internes, les ratios de surfaces de pics sont utilisés en chromatographie au lieu de hauteurs des pics.

Pour un étalonnage avec un étalon interne, un facteur de réponse est calculé. Le facteur de réponse (R) est le rapport entre les sommets par rapport au ratio des concentrations où X est l’analyte et IS est l’étalon interne.

Pour chromatographie sur zone (A) est utilisée. Le facteur de réponse peut être calculé à partir d’une parcelle de calibrage d’un /A_X_IS vs CX/c_IS, où le facteur de réponse est la pente et l’ordonnée à l’origine est supposée pour être 0. Une fois le facteur de réponse est connu pour les normes, puis la réponse de l’inconnu peut être calculée à partir le rapport des surfaces mesurées de l’expérience.

Procedure

1. manipulation des échantillons correct : Faire une Solution

Prenez un bécher propre et masse la quantité correcte de l’échantillon dedans. Enregistrer le réel masse utilisée. Dans cet exemple, une solution de l’adénine est faite dans une fiole jaugée pour utilisation comme étalon interne pour l’analyse suivante. La masse de l’adénine est de 100 mg. Faire pas directement la masse dans une fiole jaugée parce qu’il a un long cou et l’adénine ne peuvent pas être facilement ajoutée ou supprimée.
Ajouter environ 25 mL de solvant (en l’occurrence le diméthylsulfoxyde (DMSO)) pour le bécher et laisser il mélanger pour dissoudre. Dans cet exemple, la solution finale est faite dans une fiole jaugée de 50 mL, ainsi qu’ajouter environ 25 mL donc le gobelet peut être rincé et la solution composée au volume final.
Une fois que le solide est dissout, verser la solution dans la fiole jaugée.
Rincer le becher et bar avec de petites quantités de solvant, environ 10 mL, remuer et verser le rinçage dans la fiole jaugée. Répéter deux fois plus. Cela aide à assurer le transfert de la solution adéquate.

2. préparation d’une courbe de tarage Standard interne

Préparer les échantillons standards souhaités pour l’analyse de la chromatographie en phase gazeuse. Dans cet exemple, caféine est extraite du café à l’aide de l’acétonitrile et puis l’adénine est utilisé comme étalon interne pour mesure.
Pour les échantillons de caféine, peser la quantité d’échantillon nécessaire pour faire l’échantillon de 1 mg/mL. Si vous utilisez une fiole jaugée de 10 mL, qui est de 10 mg.
Peser l’analyte dans un bécher, ajouter quelques mL de solvant (méthanol ici) se dissoudre, puis transvaser quantitativement dans la fiole jaugée à l’aide de 3 rinçages.
Faire 3 normes plus de façon similaire avec 0,2, 0,5 et 2 mg/mL de caféine.
Mettre 1 mL de chaque caféine standard dans un flacon d’échantillonnage.
Ajouter 0,2 mL de l’étalon interne de 2 mg/mL adénine dans chaque flacon d’échantillon.
Exécuter l’expérience de la chromatographie en phase gazeuse avec chaque norme de caféine. Pour chaque chromatogramme, calculer le rapport entre la surface des pics de la caféine contre la norme.
Faire une parcelle de la zone rapport vs le ratio de concentration. La pente de cette courbe est le facteur de réponse.

3. préparation d’un véritable échantillon avec étalon interne pour chromatographie en phase gazeuse

Préparer l’échantillon souhaité pour l’analyse de chromatographie en phase gazeuse. Dans cet exemple, la caféine est extraite de café à l’aide d’acetrontrile.
Pour l’échantillon de café, masse avec 2 g de café dans un bécher de 100 mL. Noter le poids exact du café.
Ajouter 20 mL d’acétonitrile dans le bécher.
Laisser reposer pendant 20 min, en remuant fréquemment.
Filtrer le Marc de café à l’aide d’un papier filtre dans un entonnoir.
Rincer le filtre en papier x 3 avec de petites quantités d’acétonitrile (5 mL).
Mesurer le volume final du filtrat. Il devrait être d’environ 35 mL.

4. exécuter l’échantillon et calculer la Concentration

Prélever 1 mL de l’échantillon d’extrait de café et ajouter 0,2 mL de l’étalon interne dans un flacon. Placer la fiole dans support échantillonneur automatique.
Exécuter une analyse de GC de l’échantillon. S’assurer que les conditions de GC sont tels que la caféine et l’adénine se séparent. Dans cet exemple, isothermes séparations sont effectuées à 200 ° C.
Après l’analyse, calculer l’aire du pic pour les PIC de l’étalon interne et le pic de l’analyte. En utilisant leurs ratios, calculer la quantité de caféine dans l’échantillon.

5. résultats : Analyse de GC de caféine avec étalon interne

Analyse de GC de la caféine est illustré à la Figure 1. Adénine est utilisé comme étalon interne. Le rapport entre la surface des pics peut être mesuré et comploté contre le rapport des concentrations. La pente de la courbe est le facteur de réponse (en l’occurrence 1,8).
La figure 2 illustre un chromatogramme d’un échantillon de café avec étalon interne d’adénine. Le rapport entre la surface du pic est 1,78. En utilisant le facteur de réponse et la concentration de l’adénine (0,33 mg/mL), la concentration de caféine dans l’échantillon inconnu est calculée à 0,33 mg/mL.

Figure 1. Terrain de calibrage à l’aide d’un étalon interne. Une parcelle des ratios de concentration vs zone rapports pour 3 échantillons standards de caféine (1, 0,5 et 0,2 mg/mL) avec étalon interne de 0,33 mg/mL adénine ajouté à chacune. La pente de la droite est de 1,8, qui est le facteur de réponse.

Figure 2. Chromatogramme de café avec étalon interne adénine. Une parcelle de la réponse du détecteur FID aux échantillons. Les trois principaux sommets sont l’adénine (IS), la caféine et l’acide palmitique.

Perte d’échantillon peut se produire chaque fois qu’un échantillon est manipulé ou transféré, ce qui rend les calculs précis de concentration difficile.

Pour assurer l’exactitude, les effets de la perte de l’échantillon doivent être minimisés en utilisant la préparation minutieuse et en limitant le nombre d’étapes de manutention et de transfert échantillon. Cependant, perte de l’échantillon peut également se produire en raison d’erreurs systématiques, telles que les variations dans la procédure analytique, effets matriciels et manipulation de l’échantillon incomplet.

Ces sources de perte peuvent être expliquer en ajoutant une concentration connue d’une espèce similaire, mais non identique à celle du composé d’intérêt. C’est ce qu’on appelle un étalon interne. Les pertes d’échantillon qui se produisent à l’étalon interne devraient être similaires pour l’analyte, permettant la concentration être calculée avec précision.

Cette vidéo illustre l’utilisation d’une technique interne laboratoire standard et correct pour tenir compte de la perte de l’échantillon lors de la détermination de la concentration d’un inconnu.

Un étalon interne est une substance ajoutée dans une quantité connue de normes, échantillons, ainsi que les blancs au cours de l’analyse.

En spectroscopie et chromatographie, le rapport du signal de l’étalon interne et l’analyte est calculé. Ce ratio, appelé le facteur de réponse, est proportionnel au rapport de l’analyte et la concentration standard.

Facteur de réponse, R, peut être exprimée par l’équation suivante, où A représente les signaux analytiques de l’échantillon et l’étalon interne et la C représente la concentration de l’échantillon et l’étalon interne.

Un étalon interne peut compenser les erreurs systématiques et aléatoires. Par exemple, des erreurs aléatoires, tels que les incohérences lors de la mesure d’un échantillon de—seront les mêmes pour l’étalon interne et l’analyte. Par conséquent, le ratio de leurs signaux ne changera pas.

Pour les erreurs systématiques, telles que les effets de matrice en solution, le ratio ne seront pas affecté tant que l’effet de matrice est égale à la norme et de l’analyte.

Normes internes offrent un grand avantage, il peut être difficile de choisir celui qui convient. Un étalon interne doit avoir un signal qui est similaire, mais non identique à celle de l’analyte. Il ne peut pas concerner la mesure de l’analyte en quelque sorte.

Enfin, la concentration doit être connue. Ce résultat est obtenu en veillant à ce que l’étalon interne n’est pas nativement présente dans l’échantillon ; ainsi, la seule source de celui-ci dans la solution est la concentration sera ajoutée.

Dans l’expérience suivante, la concentration de caféine dans un échantillon inconnu déterminera par chromatographie en phase gazeuse.

Ceci est réalisé en créant une courbe d’étalonnage à l’aide de solutions de caféine connu, avec l’adénine comme étalon interne. La pente de la courbe d’étalonnage est égale au facteur de réponse.

Une fois que le facteur de réponse est connu, la concentration de l’inconnu peut être calculée de son rapport des surfaces mesurées chromatogramme.

Maintenant que vous comprenez les bases des normes internes, nous allons jeter un oeil à la procédure.

Pour commencer la procédure, peser 100 mg de l’adénine standard, interne, dans un bécher propre.

Ensuite, dissoudre dans à peu près 20 mL du diméthylsulfoxyde et mélanger la solution.

Une fois que l’adénine est dissout, verser la solution dans une fiole jaugée de 50 mL.

Rincer le becher et remuez bar avec 10 mL de DMSO et versez le rinçage dans la fiole. Répétez ce rinçage à deux reprises, afin d’assurer le transfert de la solution adéquate. Remplir jusqu’au repère d’étalonnage, ce qui entraîne un étalon interne avec une concentration de 2 mg/mL.

Ensuite, peser 100 mg de caféine dans un bécher de préparer une solution-mère. Dissoudre la caféine avec une petite quantité de méthanol. Ensuite, utilisez 3 rinçages pour transférer cette solution dans une fiole jaugée de frais 25 mL. Il s’agit de la solution mère de 4 mg/mL. Utilisez-le pour créer 3 normes de caféine.

Ensuite, ajouter 0,2 mL de l’adénine standard, interne, dans chaque fiole. Remplissez chacune au volume final avec du méthanol. Transférer chaque solution dans un flacon d’échantillonnage.

Chaque norme de caféine, traversent un chromatographe en phase gazeuse. Calculer le ratio de la surface des pics de la caféine par rapport à l’adénine standard.

Tout d’abord, environ 2 g de café dans un bécher de 100 mL et noter le poids.

Ensuite, ajoutez 20 mL de méthanol pour extraire la caféine du café. Laisser la solution de remuer pendant 20 min.

À l’aide d’un entonnoir Büchner, filtrer le Marc de café. Rincer le becher avec une petite quantité de méthanol et versez Ce rinçage dans l’entonnoir. Répéter deux fois le rinçage.

Mesurer le volume final du filtrat ; Il devrait être d’environ 35 mL.

Pour la préparation des échantillons pour analyse, ajouter 1 mL de l’extrait de café dans un flacon d’échantillonnage. Ensuite, ajouter 0,2 mL de l’étalon interne de l’adénine et placer le flacon dans rack échantillonneur automatique de l’instrument.

Exécuter une analyse de chromatographie en phase gazeuse de l’échantillon, en veillant à ce que les conditions sont telles que la caféine et l’adénine sont séparés.

À l’issue de l’analyse, calculer la surface du pic de l’étalon interne tant de l’analyte.

Une fois que tous les échantillons ont été analysés, la courbe de tarage standard peut être déterminée pour les solutions de caféine/adénine en traçant les ratios de la surface des pics versus les ratios des concentrations. La pente de cette ligne, qui représente le facteur de réponse, était de 1,8.

Ensuite, les données de GC de l’échantillon d’extrait de café sont analysées. Le ratio de la surface des pics a été évaluée à 1,78. En utilisant le facteur de réponse et la concentration de l’adénine standard, interne, la concentration de caféine dans l’échantillon inconnu a été évaluée à 0,33 mg/mL.

Beaucoup de différents types de réactions, à travers divers disciples scientifiques, utilise des normes internes afin de minimiser les effets des erreurs et de perte d’échantillon.

Les effets de la perte d’échantillon rencontrées au cours de la préparation de l’échantillon peuvent être minimisés en utilisant des étalons internes, gardant leur ratio de concentration presque constante.

Dans cet exemple, les lipides bioactifs ont été extraites des cellules lysées par un procédé d’extraction liquide-liquide. Isotope stable de normes internes ont été ajoutés au début de l’extraction pour tenir compte des erreurs au cours de la préparation de l’échantillon.

Normes internes ne sont pas seulement essentiels pour la préparation des lipides bioactifs, mais aussi pour l’analyse. Les lipides sont séparées de chromatographie en phase liquide à haute performance et analysé par spectrométrie de masse.

En spectroscopie, normes internes peuvent aider correct pour des erreurs aléatoires en raison de changements dans l’intensité de la source lumineuse. Si une lampe ou autre source lumineuse a une puissance variable, il affectera l’absorption et par conséquent, l’émission d’un échantillon. Toutefois, le ratio d’un étalon interne d’analyte reste constant, même si la source lumineuse n’est pas.

En chromatographie, une des plus importantes sources d’erreur est l’injection. Auto-échantillonneurs minimiser cela, mais erreur peut encore être écart-type relatif de 1 à 2 %.

Dans cet exemple, normes de vapeur contenant un étalon interne ont été analysés par chromatographie gazeuse pour établir une courbe d’étalonnage. Une fois cela terminé, l’échantillon inconnu pourrait alors être mesuré et les pertes en raison de la volatilité de l’échantillon ont représenté.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE aux normes internes. Vous devez maintenant comprendre les pratiques exemplaires pour réduire perte d’échantillon, normes internes et les facteurs de réponse.

Merci de regarder !

Applications and Summary

Normes internes sont utilisés dans de nombreux domaines, y compris la spectroscopie et chromatographie. En spectroscopie, normes internes peuvent aider correct pour des erreurs aléatoires en raison de changements dans l’intensité de la source lumineuse. Si une lampe ou autre source lumineuse a une puissance variable, il affectera l’absorption et par conséquent, l’émission d’un échantillon. Toutefois, le ratio d’un étalon interne d’analyte reste constant, même si la source lumineuse n’est pas. Un exemple de ceci est à l’aide de lithium (Li) comme étalon interne pour l’analyse du sodium dans un échantillon de sang par spectrométrie de flamme. Li est chimiquement semblable au sodium, mais ne se trouve pas en mode natif dans le sang.

Pour la chromatographie, les étalons internes sont souvent utilisés en chromatographie en phase gazeuse et en chromatographie en phase liquide. Pour les applications à la spectrométrie de masse comme détecteur, l’étalon interne peut être un analyte isotopiquement étiquetés, afin que le poids moléculaire (MW) sera différent de celle de l’analyte d’intérêt. Normes internes sont couramment utilisés dans les analyses pharmaceutiques ou environnementales.

Transcript

Sample loss can occur every time a sample is handled or transferred, thereby making accurate calculations of concentration difficult.

To ensure accuracy, the effects of sample loss must be minimized using careful sample preparation and by limiting the number of sample handling and transfer steps. However, sample loss can also occur due to systematic errors, such as incomplete sample manipulation, matrix effects, and variations in analytic procedure.

These sources of loss can be accounted for by adding a known concentration of a species similar, but not identical, to the compound of interest. This is called an internal standard. Any sample losses that occur to the internal standard should be similar for the analyte, allowing for the concentration to be accurately calculated.

This video will illustrate the use of an internal standard and proper lab technique to account for sample loss when determining the concentration of an unknown.

An internal standard is a substance added in a known amount to standards, samples, and blanks during an analysis.

In chromatography and spectroscopy, the ratio of the signal for the internal standard and the analyte is calculated. This ratio, called the response factor, is proportional to the ratio of the analyte and standard concentrations.

Response factor, R, can be expressed by the following equation, where A represents the analytical signals of the sample and internal standard and C represents the concentrations of the sample and internal standard.

An internal standard can compensate for both systematic and random errors. For example, random errors—such as inconsistencies when measuring a sample—will be the same for both the internal standard and the analyte. Therefore, the ratio of their signals will not change.

For systematic errors, such as matrix effects in solution, the ratio will be unaffected as long as the matrix effect is equal for both the standard and the analyte.

While internal standards provide great benefit, it can be difficult to choose one that is suitable. An internal standard must have a signal that is similar, but not identical, to the analyte. It also cannot affect the measurement of the analyte in any way.

Finally, the concentration must be well known. This is achieved by ensuring that the internal standard is not natively present in the sample; thus, the only source of it in solution is the known concentration added.

In the following experiment, the concentration of caffeine in an unknown sample will be determined by gas chromatography.

This is achieved by creating a calibration curve using known caffeine solutions, with adenine as the internal standard. The slope of the calibration curve is equal to the response factor.

Once the response factor is known, the concentration of the unknown can be calculated from its measured chromatogram area ratio.

Now that you understand the basics of internal standards, let’s take a look at the procedure.

To begin the procedure, accurately weigh 100 mg of the internal standard, adenine, into a clean beaker.

Next, dissolve it in roughly 20 mL of dimethyl sulfoxide, and mix the solution.

Once the adenine has dissolved, pour the solution into a 50-mL volumetric flask.

Rinse the beaker and stir bar with 10 mL of DMSO, and pour the rinse into the flask. Repeat this rinse twice, to ensure proper solution transfer. Fill to the calibration mark, resulting in an internal standard with a concentration of 2 mg/mL.

Next, weigh 100 mg of caffeine into a beaker to prepare a stock solution. Dissolve the caffeine with a small amount of methanol. Then, use 3 rinses to transfer this solution to a fresh 25 mL volumetric flask. This is the 4 mg/mL stock solution. Use it to create 3 caffeine standards.

Next, add 0.2 mL of the internal standard, adenine, to each flask. Fill each to the final volume with methanol. Transfer each solution to a sample vial.

Run each caffeine standard through a gas chromatograph. Calculate the ratio of peak areas for the caffeine versus the adenine standard.

First, weigh 2 g of coffee into a 100-mL beaker, and record the weight.

Next, add 20 mL of methanol to extract the caffeine from the coffee. Allow the solution to stir for 20 min.

Using a Büchner funnel, filter out the coffee grounds. Rinse the beaker with a small amount of methanol, and pour this rinse into the funnel. Repeat the rinse twice.

Measure the final volume of the filtrate; it should be approximately 35 mL.

To prepare the sample for analysis, add 1 mL of the coffee extract to a sample vial. Then, add 0.2 mL of the adenine internal standard, and place the vial into the instrument’s auto-sampler rack.

Run a gas chromatography analysis of the sample, ensuring that the conditions are such that the caffeine and adenine are separate.

After completing the analysis, compute the peak area for both the internal standard and the analyte.

Once all the samples have been analyzed, the standard calibration curve can be determined for the caffeine/adenine solutions by plotting the ratios of the peak areas versus the ratios of the concentrations. The slope of this line, which represents the response factor, was 1.8.

Next, the GC data from the extracted coffee sample is analyzed. The ratio of the peak areas was calculated to be 1.78. Using the response factor and the known concentration of the internal standard, adenine, the concentration of caffeine in the unknown sample was calculated to be 0.33 mg/mL.

Many different types of reactions, across various scientific disciples, utilize internal standards to minimize the effects of errors and sample loss.

The effects of sample loss encountered during sample preparation can be minimized using internal standards, keeping their concentration ratio nearly constant.

In this example, bioactive lipids were extracted from lysed cells using a liquid-liquid extraction process. Stable isotope internal standards were added at the beginning of extraction to account for errors during sample preparation.

Internal standards were not only critical for the preparation of the bioactive lipids, but also for the analysis. The lipids were separated using high-performance liquid chromatography, and analyzed via mass spectrometry.

In spectroscopy, internal standards can help correct for random errors due to changes in light source intensity. If a lamp or other light source has variable power, it will affect the absorption and consequently, emission of a sample. However, the ratio of an internal standard to analyte will stay constant, even if the light source does not.

In chromatography, one of the largest sources of error is the injection. Auto-samplers help minimize this, but error can still be 1–2% relative standard deviation.

In this example, vapor standards containing an internal standard were analyzed using gas chromatography to establish a calibration curve. Once this was complete, the unknown sample could then be measured and the losses due to volatility of the sample accounted for.

You’ve just watched JoVE’s introduction to internal standards. You should now understand best practices for minimizing sample loss, internal standards, and response factors.

Thanks for watching!