Name: La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour lélectroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Apprenez à isoler des cellules hématopoïétiques primaires de la moelle osseuse murine et à les transfecter par électroporation. Cette méthode permet une différenciation efficace en mastocytes et basophiles avec un rendement d'environ 30%.

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La récolte de moelle osseuse provenant fémurs et tibias <ol><li> La première étape de la procédure est de récolter la moelle osseuse dans le fémur et le tibia d&#39;un 6 - à 12 semaines vieille souris (nous utilisons souris Balb / c, mais vous pouvez faire cette procédure avec toute souche de souris). Pour commencer, euthanasier la souris par inhalation de CO 2 (ne sera pas montré). Fémur et tibias Récolte de la pattes postérieures de chacun. Puis, avec une lame de rasoir, couper chaque extrémité des fémurs d&#39;enlever la hanche et du genou et d&#39;exposer la moelle. </li><li> De la même manière, couper chaque extrémité du tibia pour enlever le genou et la cheville régions adjacentes et d&#39;exposer la moelle. </li><li> Prendre une seringue de 3 ml avec une aiguille de calibre 26 et de le remplir avec RPMI supplémenté avec 10% de FBS, la pénicilline, la streptomycine et le bêta-mercaptoéthanol (BME = 100 UM). En utilisant une pince à épiler, tenez l&#39;os au cours d&#39;une boîte de Petri contenant un milieu RPMI. Insérez l&#39;aiguille de la seringue dans une extrémité de l&#39;os et appuyer sur le piston pour chasser la moelle osseuse. L&#39;aiguille de la seringue peut être déplacé de haut en bas dans l&#39;os pour débusquer la moelle résiduelle. </li><li> Répétez la procédure pour tous les os, puis procéder à l&#39;établissement des cultures. </li></ol> Établir des cultures <ol><li> Pour établir les cultures de moelle osseuse, une pipette de la moelle osseuse rincée de haut en bas plusieurs fois pour briser le tissu dans une suspension cellulaire. </li><li> Placer un filtre de 70 microns au-dessus d&#39;un tube conique de 50 ml, et ajouter la suspension de cellules sur le filtre. </li><li> Rincez les boîtes de Pétri une fois avec du RPMI, puis ajouter l&#39;eau de rinçage à l&#39;filtre 70 microns. </li><li> Utilisation de l&#39;extrémité en caoutchouc d&#39;un plongeur 1 ml seringue, broyer les morceaux de moelle osseuse restent sur le dessus du filtre de 70 microns. </li><li> Lavez le filtre une fois avec du RPMI. </li><li> Après le lavage du filtre, centrifuger les cellules en suspension à 1200 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Laver le culot cellulaire par remise en suspension dans du PBS. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Nous obtiennent généralement ~ 90 millions de cellules à partir des os d&#39;une souris (deux fémurs et deux tibias). Après avoir compté les cellules, les centrifuger à 1200 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Resuspendre les cellules dans une petite quantité de RPMI et aliquot eux dans des flacons de culture de tissus contenant suffisamment de RPMI sorte que la concentration finale est de 1 million de cellules par mL. </li><li> Ajouter des cytokines de promouvoir le développement de votre type de cellule d&#39;intérêt. Dans ce cas, la cytokine interleukine-3 (IL-3 = 10 ng / ml) est ajoutée à promouvoir le développement des basophiles et les mastocytes. Pour acquérir les basophiles, incuber pendant 10 jours. Pour les mastocytes, les incuber pendant 5 semaines. Lors de la génération des mastocytes, les médias et l&#39;IL-3 devrait être changé une fois par semaine. </li><li> Voici un aperçu de la façon dont les mastocytes devrait apparaître juste après placage. Cette image montre la différenciation des cellules de la moelle mât dans les basophiles et les mastocytes 10 jours après l&#39;ajout d&#39;interleukine-3. </li><li> Une fois le type de cellule désiré est obtenu, passez à l&#39;étape électroporation. </li></ol> Cellules électroporation <ol><li> Pour commencer l&#39;étape d&#39;électroporation, déterminer le nombre de cellules dans le flacon de culture. </li><li> Les cellules sont généralement électroporation à une densité de 10 millions par ml, alors le transfert le nombre de cellules nécessaires pour tubes coniques et centrifuger les tubes à 1200 tpm pendant 5 minutes. </li><li> Après centrifugation, aspirer les médias, se laver les cellules avec du PBS 1X et centrifuger à nouveau à 1200 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter de Bio-Rad tampon Gene Pulser électroporation de faire une suspension cellulaire de 10 millions de cellules par mL. </li><li> Après remise en suspension des cellules, ajouter de l&#39;ADN plasmidique désiré à une concentration finale de 10 à 20 microgrammes par ml. </li><li> Aliquoter 150 microlitres de la suspension cellulaire dans des puits de votre choix sur une plaque de 96 puits électroporation. </li><li> Mettez la plaque électroporation dans la chambre de la plaque MXcell et fermer le couvercle. </li><li> Avant de transfection de cellules de mât, un protocole d&#39;électroporation doit être programmé dans le MXcell à moins d&#39;utiliser un protocole prédéfini ou stockées. Grâce à des expériences d&#39;optimisation que nous avons découvert que l&#39;efficacité de la transfection de cellules haute du mât se produisent en utilisant des protocoles carrés onde de pouls. Nous allons modifier les conditions d&#39;électroporation sur la plaque de livrer 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms, et des impulsions d&#39;ondes carrées 350V/10ms au condensateur 2000uF et 1000 ohms. Une fois le protocole a été établi et chargé sur le périphérique, appuyez sur «Pulse» pour électroporer les cellules. </li><li> Après électroporation est terminée, le transfert des cellules sur une plaque de culture de tissus. Nous généralement transférer chaque échantillon de 150 microlitre électroporation à un puits dans une plaque de 48 puits de culture de tissu contenant 300 microlitres RPMI (complété avec 10% de FCS, la pénicilline, la streptomycine et le bêta-mercaptoéthanol) avec 10 nanogrammes par ml d&#39;interleukine-3. Les cellules sont incubées une nuit à 37 ° C, puis dosée 24 heures plus tard, d&#39;expression et de répression. </li></ol> TranRésultats sfection L&#39;image de microscopie à fluorescence des cellules après l&#39;électroporation réussie en utilisant 20 microgrammes par ml GFP plasmide est montré dans la vidéo. Utilisation de l&#39;efficacité MXcell électroporation système de transfection de l&#39;ordre de 30% peut être obtenue. Le système vous permet de varier les conditions afin de maximiser votre efficacité de la transfection, tout en maintenant la viabilité cellulaire.

Comme plus d&#39;informations génomiques émerge et de nouveaux outils tels que siARN sont développés, l&#39;utilisation de cellules physiologiquement pertinente est devenue de plus en plus important d&#39;approfondir notre compréhension des voies de la maladie, interactions protéine-protéine, et la transduction du signal. Les cellules primaires sont obtenues directement à partir de tissus ou les liquides et cultivées in vitro. Ces cellules peuvent être manipulés dans un certain nombre de façons, notamment par l&#39;introduction de matériel génétique exogène. Il est de plus en plus évident que la façon la plus efficace pour introduire de l&#39;ADN plasmidique ou siRNA dans des cellules primaires est l&#39;électroporation. L&#39;électroporation expose les cellules à des impulsions électriques de manière à transitoirement augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire, permettant ainsi aux acides nucléiques exogènes pour entrer dans la cellule. Cette méthode de transfection peut être optimisée pour accueillir les différences entre les différents types de cellules / lignes et, par conséquent, peuvent être utilisés pour transfecter des cellules de mât ainsi que tout autre os de cellules dérivées de la moelle. Par ailleurs, contrairement virale médiée par transfection, l&#39;électroporation n&#39;impose pas de limites sur la taille de l&#39;ADN transfecté, ni exiger une préparation importante. Contrairement aux lipides transfection médiée, l&#39;électroporation peut être moins toxique et n&#39;entraîne pas de piégeage de l&#39;acide endosomal transfectées nucléiques. Bio-Rad a développé le système d&#39;électroporation MXcell spécifiquement pour ces cellules. l&#39;MXcell vous permet de varier les conditions afin de maximiser votre efficacité de la transfection et la viabilité cellulaire. Afin d&#39;optimiser l&#39;efficacité de transfection et de minimiser la mort cellulaire, une multitude de paramètres, y compris l&#39;électroporation de tension, capacité, résistance et durée d&#39;impulsion peut être réglée et évalués.

<table><tbody><tr><td>Système d'électroporation Gene Pulser MXcell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Buffer d'électroporation Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

la préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Il est de plus en plus évident que l&#39;électroporation est le moyen le plus efficace pour introduire de l&#39;ADN plasmidique ou siRNA dans des cellules primaires. Le système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell et tampon d&#39;électroporation Gene Pulser ont été spécifiquement développés pour transfecter des acides nucléiques dans les cellules de mammifères et difficiles à transfecter des cellules, telles que la vidéo cells.This primaires et la tige montre comment mettre en place des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris , puis les préparer pour l&#39;électroporation dans le système MXcell. Nous commençons par isoler le fémur et le tibia. La moelle osseuse des deux fémur et le tibia sont ensuite récoltées et les cultures sont établies. Des cultures de cellules de moelle osseuse sont ensuite transfectées et analysées.

Cette procédure décrit comment établir des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris et est suivie par transfection en utilisant le système d&#39;électroporation Gene Pulser MXCell.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

Il devient de plus en plus évident que l'électroporation est la méthode la plus efficace pour introduire de l'ADN plasmidique ou des siRNA dans des cellules primaires. Le Gene Pulser ...

Cette procédure commence par la récolte des fémurs et des tibias de souris. Après l'élimination des articulations de la hanche, du genou et de la cheville, la moelle est isolée par injection de milieu RPMI dans l'extrémité ouverte de l'os. Après obtention d'une suspension monocellulaire, les cellules de la moelle osseuse sont différenciées en mastocytes, chargées dans des plaques d'électroporation à 96 puits, puis transfectées.Utilisation du système d'électroporation de cellules gene pulse ou MX. En utilisant des protocoles d'impulsions en onde carrée, des efficacités de transfection d'environ 30 % peuvent être obtenues. La première étape de la procédure consiste à prélever la moelle osseuse à partir du fémur et de la tubérosité tibiale d'une souris âgée de six à douze semaines.Pour commencer, euthanasier la souris par inhalation de CO2, puis prélever le fémur et le tibia de chaque membre postérieur. Ensuite, à l’aide de la lame de rasoir, couper chaque extrémité du fémur afin de retirer les articulations de la hanche et du genou et exposer ainsi la moelle de manière similaire. Couper chaque extrémité du tibia pour enlever les régions adjacentes au genou et à la cheville et exposer la moelle.Ensuite, prenez une seringue équipée d'une aiguille de calibre 26 et demie et déposez du RPMI supplémenté avec 10 % de FBS, de la pénicilline, de la streptomycine, du beamer, de l'éthanol capita et de la L-glutamine. À l'aide de pinces, maintenez l'os au-dessus d'une boîte de Pétri contenant le milieu RPMI. Insérez l'aiguille de la seringue dans une extrémité de l'os et appuyez sur le piston pour chasser la moelle osseuse.L'aiguille de la seringue peut être déplacée vers le haut et vers le bas à l'intérieur de l'os pour éliminer la moelle résiduelle. Répétez la procédure pour tous les os, puis passez à la mise en place des cultures. Pour établir les cultures de moelle osseuse, aspirez la moelle osseuse éliminée plusieurs fois de haut en bas afin de fragmenter le tissu en une suspension cellulaire.Ensuite, placez un filtre de 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres et ajoutez la suspension cellulaire sur le filtre. Rincez ensuite la boîte de Pétri une fois avec du RPMI. Puis ajoutez le rinçage sur le filtre de 70 microns à l’aide de l’extrémité en caoutchouc du piston d’une seringue de un millilitre pour broyer les fragments de moelle osseuse restants sur le filtre de 70 microns.Lavez le filtre une fois avec du RPMI après avoir lavé le filtre. Centrifugez la suspension cellulaire à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Lavez le culot cellulaire en le resuspendant dans du PBS.Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Nous obtenons généralement environ 90 millions de cellules à partir des os d'une souris, soit deux fémurs et deux tibias. Après le comptage des cellules, les centrifuger à nouveau à 1200 tr/min pendant cinq minutes.Ressuspendez les cellules dans une petite quantité de RPMI et répartissez-les dans des flacons de culture tissulaire, contenant suffisamment de RPMI pour obtenir une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre. Ajoutez ensuite des cytokines afin de favoriser le développement du type cellulaire désiré. Dans ce cas, la cytokine interleukine-3 est ajoutée pour favoriser le développement des basophiles et des mastocytes : pour obtenir des basophiles, incubez pendant 10 jours ; pour les mastocytes, incubez pendant cinq semaines lors de la génération de mastocytes.Le milieu et l'IL-3 doivent être changés une fois par semaine. Voici à quoi devraient ressembler les cellules de la moelle osseuse juste après leur mise en culture. Cette image montre la différenciation des cellules de la moelle osseuse en basophiles et en mastocytes 10 jours après l'ajout d'interleukine 3.Une fois le type cellulaire souhaité obtenu, passez à l'étape de l'électroporation. Pour commencer l'étape d'électroporation, déterminez le nombre de cellules dans la culture. Les cellules en flacon sont généralement électroporées à une densité de 10 millions par millilitre.Transférez donc le nombre requis de cellules dans des tubes coniques et centrifugez les tubes à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez le milieu, lavez les cellules avec un volume de PBS 1X et centrifugez à nouveau à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez du tampon d'électroporation BioRad Gene Pulser pour obtenir une suspension cellulaire contenant 10 millions de cellules par millilitre.Après avoir resuspendu les cellules, ajoutez l'ADN plasmidique souhaité à une concentration finale de 10 à 20 microgrammes par millilitre. Mélangez délicatement la solution cellulaire et transférez 150 microlitres de la suspension cellulaire dans les puits de votre choix d'une plaque d'électroporation 96 puits. Ensuite, placez la plaque d'électroporation dans la chambre de la plaque MXL et fermez le couvercle avant la transfection des cellules de la moelle osseuse et l'électroporation.Le protocole doit être programmé dans le MXL, sauf si l'on utilise un protocole prédéfini ou enregistré. À travers des expériences d'optimisation, nous avons découvert que les rendements de transfection les plus élevés pour les cellules de moelle osseuse s'obtiennent avec des protocoles d'impulsions carrées. Nous allons modifier les conditions d'électroporation sur la plaque afin d'appliquer des impulsions carrées à 2000 micro phs dans une résistance de mille ohms. Une fois le protocole défini et chargé sur l'appareil, appuyez sur « pulse » pour électroporer les cellules. Après l'électroporation, transférez les cellules dans une plaque de culture tissulaire.Nous transférons généralement chaque échantillon d'électroporation de 150 microlitres dans un puits d'une plaque de culture tissulaire 48 puits contenant 300 microlitres de RPMI avec 10 nanogrammes par millilitre. Les cellules Interleukin three sont incubées toute la nuit à 37 degrés Celsius, puis analysées 24 heures plus tard pour l'expression et la suppression. Il s'agit d'une image de microscopie fluorescente des cellules.Après une électroporation réussie à l'aide d'un plasmide GFP à 20 microgrammes par millilitre, en utilisant le système d'électroporation de cellules MX, des rendements de transfection d'environ 30 % peuvent être obtenus. Le système permet de faire varier les conditions afin d'optimiser l'efficacité de la transfection tout en maintenant la viabilité cellulaire. Le système MX est particulièrement utile pour les cellules primaires de mammifères, telles que ces cellules hématopoïétiques murines.Nous venons de vous montrer comment isoler des cellules de moelle osseuse chez la souris et transfecter des mastocytes différenciés à l'aide du système d'électroporation cellulaire MX. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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