Dosage de l'induction neurale dans l'embryon de poulet

Ce vidéo montre les différentes étapes du test d'induction neuronale chez l'embryon de poulet. Tout d'abord, l'embryon hôte est mis en culture. L'embryon donneur est ensuite mis en culture dans du sérum physiologique et le nœud de Hensen est marqué avec un colorant fluorescent. Le nœud de Hensen est excisé de l'embryon donneur et transplanté dans l'embryon hôte.

L'embryon hôte est cultivé pendant 24 heures, fixé et traité pour l'oxydation photochimique sous fluorescence fey. Avec dab. L'embryon est ensuite traité pour une hybridation in situ avec un marqueur neural.

Bonjour, je suis Delphine du laboratoire Fennell au Centre de médecine environnementale et génomique de l'Université Texas A&M à Houston. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réaliser des tests d'induction neuronale chez l'embryon de poulet. Nous utilisons cette procédure au laboratoire pour étudier les effets des médicaments anticonvulsivants sur les propriétés inductrices neuronales du nœud de Hensen.

Commençons donc. Pour le test d'induction neuronale, il est nécessaire de préparer les œufs. Ces œufs doivent être incubés sur le côté dans un incubateur humide pendant 13 heures jusqu'au stade trois plus de Hamburger et Hamilton, ou HH trois plus.

Ensuite, préparez l'embryon hôte en utilisant la nouvelle méthode de culture, qui a été décrite précédemment. Dans JoVE, recouvrez la surface de l'embryon hôte avec 200 microlitres de solution saline. Cela facilitera ultérieurement le transfert et le positionnement de la greffe donneur.

Enfin, recouvrez l'assemblage avec une boîte de culture Falcon de 35 millimètres retournée. Pour épiler l'embryon donneur, ouvrez l'œuf en tapotant sur la coquille avec une pince. Retirez le dessus de la coquille et jetez-le.

Retirer l'albumen épais à l'aide de pinces et incliner la poche vitelline avec des pinces épaisses afin que l'embryon soit orienté vers le haut. Après avoir retiré l'albumen, utiliser de fines ciseaux pour découper un carré de poche vitelline autour de l'embryon. Prélever l'embryon de la poche vitelline à l'aide d'une cuillère et le placer dans une boîte contenant du PBS.

Ensuite, utilisez une pince pour détacher l'embryon donneur du vitellus et de la zone lucida. Une fois détaché, transférez l'embryon donneur dans une boîte de Pétri munie d'une garde SIL contenant du PBS afin de marquer et de transplanter la greffe. Utilisez un tireur d'électrodes microfines pour étirer des pipettes capillaires en verre de 50 microlitres sous microscope.

Coupez l'extrémité de la micropipette à l'aide de fines pinces. Placez la micropipette dans une boîte de Pétri tapissée d'un ruban d'argile à modeler. Ensuite, préparez la solution de colorant, qui servira à marquer la greffe avant la transplantation.

Préparez d'abord un stock de colorant à 0,5 % dans un millilitre d'éthanol absolu. Ce stock peut être conservé à moins 20 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Ensuite, dans un bloc chauffant réglé à 45 degrés Celsius, mélangez 10 microlitres du stock de colorant préalablement réchauffé avec 90 microlitres de saccharose 0,3 molaire. Cette température est nécessaire afin d'éviter la précipitation du colorant et la formation de cristaux insolubles.

Faire tourner brièvement la solution dans une microcentrifugeuse SPECT pendant cinq à dix secondes. La solution DAI est désormais prête à l'emploi ; fixer l'embryon donneur sur le fond de la boîte recouverte de garde-fosse, côté dorsal vers le haut, à l’aide d’épingles à insectes. Une fois l’embryon fixé, remplir à nouveau la micropipette avec de l’œil D en appliquant une pression douce.

À l’aide d’un embout d’aspiration. Appliquez une petite bolus de dai sur le nœud de Henson. Répétez l’opération en veillant à ce que l’ensemble du nœud de Henson soit marqué ensuite.

À l’aide d’une pipette capillaire ou d’un couteau de dissection microscopique, couper le nœud de Hensen ; le côté dorsal du nœud peut être distingué du côté ventral car il forme un sillon, tandis que le côté ventral du nœud est plat. Si nécessaire, marquer le côté dorsal du greffon avec de la poudre de carmin. Cela garantira que le greffon est positionné avec l’orientation dorso-ventrale appropriée.

À l’aide d’une pipette Gilson de 10 microlitres, transférez la greffe vers l’embryon hôte en utilisant une pipette capillaire microscopique. Rapprochez la greffe de la région lucita, zone à frontière opaque au niveau du nœud de Henson de l’embryon hôte. Ensuite, utilisez une pipette capillaire microscopique ou un couteau microchirurgical pour pratiquer une petite incision de 80 à 100 micromètres dans la région.

Limite opaque de la zone lucita au niveau du nœud de Hensen de l'embryon hôte. À l’aide d’une micropipette capillaire ou d’un couteau de microdissection. Positionner la greffe de manière à ce que la face ventrale soit orientée vers vous et que l’extrémité postérieure soit parallèle à la région équivalente de l’embryon hôte O. Une fois en place, retirer le liquide physiologique de l’embryon hôte, en veillant à ce que la greffe reste bien positionnée à proximité immédiate du site hôte, puis traiter l’embryon hôte en culture nouvelle pendant 18 à 22 heures, comme décrit dans notre soumission précédente.

Après 24 heures de culture, l'embryon est retiré de l'incubateur et fixé dans une boîte en forme de cigare. Le P-B-S-P-B-S est éliminé et remplacé par du paraformaldéhyde à 4 %. L'embryon est ensuite fixé pendant 24 heures.

Jetez le fixateur dans un récipient approprié pour déchets dangereux et ajoutez du PBS dans la boîte de fixation. Retirez les épingles à insectes à l’aide de pinces après que les épingles aient été enlevées. Utilisez une pipette Pasteur à extrémité émoussée pour transférer l’embryon dans un flacon de scintillation contenant du PBS.

Laver l'embryon deux fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune, puis une fois dans du tampon de décapage pendant cinq minutes après le lavage ; transférer l'embryon sur une lame creuse en verre contenant 0,1 millilitre de tampon Tris. Remplacer la solution de tampon Tris par 0,1 millilitre de solution DAB. Jeter la pointe einor dans un seau contenant une solution d'eau de Javel.

Pour décontaminer le DAB, placez une lame couvre-objet sur la lame creuse sous le foyer de fluorescence au fluorescéine isothiocyanate FEI. L'objectif du microscope sur les cellules donneuses de greffe apparaîtra rouge fluorescent et sera exposé à la fluorescence FEI jusqu'à ce que toutes les cellules rouges fluorescentes deviennent brunes. Ce phénomène résulte de la conversion photochimique du fluorochrome en cristaux bruns insolubles par exposition à la longueur d'onde d'excitation FEI.

4 88 nanomètres en présence de dab. Ce processus prend entre 20 minutes et deux heures. Une fois la réaction de photo-oxydation terminée, retirez le couvre-objet à l’aide de fines pinces.

Transférez l'embryon dans un flacon de scintillation de 20 millilitres contenant du PBTW ou du PBS avec 0,1 % de Tween 20. Désactivez enfin le DAB à partir du couvre-objet et de la cavité en verre. Faites glisser en incubant une solution d'eau de Javel pour traiter l'embryon en vue de sa visualisation.

Procédez à l'hybridation in situ en incubant l'embryon uniquement avec la sonde marquée au DIG. Ensuite, commencez à prendre des photographies et à réaliser les coupes comme décrit dans la vidéo JoVE deux. Voici un exemple de test d'induction neuronale.

Au départ, la greffe est positionnée à la limite entre la région lucita et la région alpaca de l'embryon hôte. Les embryons donneur et hôte sont tous deux au stade trois plus. Après neuf heures en culture, la greffe commence à se différencier et induit ce qui apparaît comme une miniature de tête au stade huit moins.

Après 24 heures en culture, l'induction neuronale est terminée après la fixation. L'embryon est traité pour l'oxydation photochimique. Au départ, les cellules marquées au colorant oculaire provenant du donneur se sont révélées proliférées, formant un mini-Noor, comme observé ici en rouge.

Après l'oxydation photochimique, ces cellules apparaissent brunes. L'embryon est ensuite traité par hybridation in situ sur coupe entière pour le marqueur neural. O otx two développé dans le laboratoire du Dr. Bonelli.

Le greffon donneur induit l'expression de OTX deux à partir du tissu issu de l'hôte. Nous venons de vous montrer comment réaliser un test d'induction neuronale dans l'embryon de joue. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'éliminer tout liquide présent dans la zone entourant la greffe après la transplantation, à l'aide d'une pipette.

Cela permettra de s'assurer que la greffe est correctement positionnée et qu'elle ne se déplacera pas par rapport à l'embryon hôte pendant la culture. Voilà, c'est tout. Merci. Bon visionnage et bonne chance avec vos expériences.