Name: Dosage de linduction neurale dans lembryon de poulet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Découvrez le dosage de l'induction neurale dans l'embryon de poulet en utilisant le nœud de Hensen comme organisateur embryonnaire. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de détermination du destin neural in vivo.

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DP est récipiendaire du Prix Ruth Kirschstein 1F32-01A1 DA021977 du National Institute on Drug Abuse. Ce travail a été soutenu par la Fondation Margaret M. Alkek au RHF.

<html> I. Schéma Aperçu: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="Figure 1" width="460" height="384" /> Cette vidéo montre les différentes étapes de test pour l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet. Tout d&#39;abord, l&#39;embryon hôte est explanté dans la culture Nouveaux [NI1]. Ensuite, l&#39;embryon n&#39;est Donnor explantés dans une solution saline et le nœud de Hensen (l &#39;«organisateur» dans chiches) est étiqueté avec fluorescentes DiI colorant [NI2]. Nœud de Hensen est excisé de l&#39;embryon Donnor [NI3] et transplantés dans l&#39;embryon hôte [NI4, NI5]. L&#39;embryon hôte est ensuite mis en culture pendant 22 heures, période après laquelle le tissu Donnor a induit un axe ectopique dans la zone d&#39;accueil opaca [NI6]. Après la culture, l&#39;embryon d&#39;accueil est fixe et traitées pour photooxydation en présence du DAB: Par cette réaction chimique, les cellules dérivées Donnor, qui apparaissent en rouge sous la fluorescence FITC avant photooxydation [NI7], deviennent bruns réaction suivante avec DAB [NI8]. L&#39;embryon est ensuite traitée par hybridation in situ avec un marqueur neuronal [NI8]; tissu hôte dérivés a formé le tissu neural, en présence de la greffe Donnor. Ce tissu apparaît en bleu. 1: Préparation de l&#39;embryon hôte pour la culture néo- <ol><li> Ce protocole induction neurale test commence avec des oeufs qui ont été incubés à la Hamburger &amp; Hamilton étape 3 + (ou HH3 +). Ces œufs ont été incubés mis de leur côté dans un incubateur humide pendant 13 heures. </li><li> Préparer l&#39;embryon hôte pour nouvelle culture (étapes 3.1. À 5,5 9). </li><li> Couvrez la surface de l&#39;embryon hôte avec 200 ul salines. Cela facilitera le transfert tard et le positionnement de la greffe Donnor. </li><li> Enfin, la couverture de l&#39;assemblée avec un Falcon 35 inversé mm boîte de culture. </li></ol> 2: explantation de l&#39;embryon dans une solution saline Donnor <ol><li> Ouvrez l&#39;œuf en tapant sur la coquille avec une pince et enlever des morceaux de la coquille, tout autour de la coquille. Retirer haut de coquille et jetez-les. </li><li> Retirez l&#39;albumine épaisse avec une pince, et de l&#39;inclinaison du sac vitellin avec des pinces grossières pour que l&#39;embryon tournée vers le haut. </li><li> Avec des ciseaux fins, découpez un carré de vitellus autour de l&#39;embryon. Retirez l&#39;embryon du jaune avec une cuillère, et les placer dans un plat contenant du PBS. </li><li> En utilisant des pinces, détacher l&#39;embryon de la zone pellucide Donnor. </li><li> Transfert Donnor embryon à un plat recouvert Sylgard contenant du PBS. </li></ol> 3: L&#39;étiquetage, l&#39;excision et la transplantation de la greffe Donnor <ol><li> Utiliser un extracteur de microélectrodes, tirer 50 pipettes en verre ul microcapillaire. Sous le microscope, couper la pointe de la micropipette l&#39;aide de pinces fines. Micropipette Placer dans un plat de Pétri bordée d&#39;un ruban de plastiline. </li><li> Préparer la solution de teinture qui sera utilisé pour étiqueter le greffon avant la transplantation: carbocyanine colorant DII (1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate): Premièrement, préparer un stock de DiI de 1ml l&#39;éthanol absolu à 0,5%. Ce stock peut être conservé à-20C dans le noir. Dans un bain-marie réglé à 42 ° C, le mélange préchauffé 40 ul d&#39;actions DiI à 360μl 0.3M sucrose. La température du bain d&#39;eau est nécessaire afin d&#39;éviter la précipitation du DII et la formation de cristaux insolubles. Centrifuger brièvement la solution sur un Spectrafuge mini (pour les 5-10 secondes). La solution Dii est maintenant prêt à utiliser. </li><li> Utilisant des broches d&#39;insectes, sécuriser l&#39;embryon Donnor sur le fond du plat Sylgard couverts. </li><li> Retour-remplir la micropipette avec DII. En appliquant une légère pression en utilisant un tube aspirateur, d&#39;appliquer un petit bolus d&#39;DiI au nœud de Hensen. Assurez-vous que le nœud de Hensen ensemble est étiqueté. </li><li> En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, couper le nœud de Hensen («organisateur», greffe Donnor). </li><li> Marquer la face ventrale et l&#39;extrémité postérieure de la greffe avec du carmin. Cela permettra d&#39;assurer que la greffe est positionnée avec bonne orientation dorso-ventrale à l&#39;étape 4.3. </li><li> En utilisant une pipette 200 pl Gilson, le transfert de la greffe à l&#39;embryon hôte. </li></ol> 4: Sécurisation de la greffe et la culture de l&#39;embryon hôte <ol><li> Retirer la solution saline de l&#39;embryon hôte, en veillant à la greffe reste positionné à proximité avec le site hôte. </li><li> En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, faire une petite incision (80-100 microns) dans la zone pellucide / aire région frontière opaca, au niveau du nœud de Hensen de l&#39;embryon hôte. </li><li> En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, la position de la greffe de telle sorte que la face ventrale dirigée vers vous et l&#39;extrémité postérieure est parallèle à la région équivalent dans l&#39;embryon hôte. </li><li> Retirer salines restants, et le processus de l&#39;embryon hôte pour nouvelle culture de 81 à 22 h (étapes 6.1 à 6.6 9). </li><li> L&#39;embryon hôte est alors fixé une nuit à 4 ° C (étapes 7.1 à 7.7 9). </li></ol>e &quot;&gt; 5: Photooxidise la greffe en fluorescence <ol><li> Sous une hotte, préparer une solution DAB travaillant dans un tampon Tris: Dissoudre substrat DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine tétrachlorhydrate) dans un tampon Tris (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4) à 500μg/ml; garder solution dans l&#39;obscurité, sur la glace. </li><li> Laver l&#39;embryon à deux reprises dans du PBS pendant 5 mn chacun et une fois dans un tampon Tris pendant 5 mn. </li><li> Transfert de l&#39;embryon à une diapositive cavité en verre contenant 1 ml de tampon Tris. </li><li> Remplacer la solution tampon Tris avec 1,5 ml DAB solution. Eliminer Eppendorf pointe dans un seau contenant une solution javellisée à 10% pour décontaminer DAB. Placer une lamelle sur le dessus de la diapositive cavité. </li><li> Sous FITC (isothiocyanate de fluorescéine) de fluorescence, concentrer l&#39;objectif du microscope sur le greffon (cellules Donnor sera apparaissent en rouge fluorescent) et d&#39;exposer à la fluorescence FITC jusqu&#39;à ce que toutes les cellules fluorescentes rouges sont devenues brunes (ce qui arrive comme un résultat de DII fluorochrome étant photoconverted d&#39;insolubles cristaux bruns, par une exposition à onde d&#39;excitation FITC (488nm), en présence de DAB. Ce processus prend entre 20 mn et 2 heures. </li><li> Après l&#39;achèvement de la réaction de photooxydation, enlever la lamelle à l&#39;aide de pinces fines. Transfert embryon à un flacon à scintillation en verre de 20 ml contenant PBTw (ou PBS avec 0,1% de Tween-20). </li><li> Désactiver DAB à partir lamelle de verre et faites glisser la cavité par une incubation dans une solution javellisée à 10%. </li></ol> 6: Processus de l&#39;embryon pour l&#39;hybridation, la photographie in situ et de sectionnement <ol><li> Procéder à l&#39;hybridation in situ (étapes 03.07 à 06.05 9), l&#39;incubation de l&#39;embryon pour seulement DIG sonde marquée. </li><li> Procéder à photographier (étape 8.2 9) et de sectionnement (étapes 8.3 et 8.4 9). </li></ol> Les résultats représentatifs Dans l&#39;exemple suivant de dosage induction neurale, la greffe est indiquée Donnor induire l&#39;expression de l&#39;Anourie marqueur de neurones à partir de tissus de l&#39;hôte dérivés. Dans cet exemple particulier, nous avons évalué l&#39;acquisition de la capacité de provoquer neurones des régions embryonnaires qui normalement n&#39;ont pas «organisateur» des capacités: la greffe Donnor provient d&#39;un embryon dans lequel l &#39;«organisateur» région a été enlevée chirurgicalement de l&#39;embryon au stade Donnor 3 +. Après l&#39;ablation, l&#39;embryon Donnor on laisse se développer dans la nouvelle culture, jusqu&#39;à ce que le trou a guéri et une structure ressemblant à nœud de Hensen a formé. Cette structure est ensuite étiqueté avec DII, excisés de l&#39;embryon Donnor et greffé à la zone pellucide / zone de la frontière opaca d&#39;un embryon hôte. Suite à la nouvelle culture, un axe miniature est formé à côté de l&#39;embryon hôte: cet axe miniatures se compose d&#39;une tige de globules rouges (Donnor dérivés) et une structure de tête de type (hôte dérivés): Dans (A), Donnor dérivés DiI étiquetés cellules sont présentés avant la fixation sous microscopie à fluorescence FITC. Ces cellules Donnor dérivés ont proliféré pour former une miniature notochorde, qui apparaît comme la tige de globules rouges. (B) photoconversion suite de DII, ces cellules dérivées Donnor apparaissent brun. La greffe a Donnor induit la formation de tissu neural de l&#39;hôte: ce tissu est constitué de précurseurs pour le cerveau, tel que révélé par leur expression dans les cas suivants marqueur Anourie hybridation in situ [tiré à part de 6]. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="Figure 2" width="230" height="154" /> Remarque: Dans cette procédure, nous avons utilisé des cellules DiI étiquetés afin de différencier les tissus neuraux induisant Donnor (rouge / marron) de l&#39;hôte dérivés &quot;neurones&quot; tissu (bleu). Au lieu d&#39;utiliser un poussin dérivés, Dii greffons étiquetés Donnor, certains auteurs utilisent aussi des tissus provenant d&#39;embryons Donnor cailles au lieu d&#39;chiches [par exemple, 6]. Cette méthode alternative permet également de différencier Donnor du tissu hôte. Dans ce cas, la greffe (tissu Donnor) provient d&#39;oeufs de caille au lieu d&#39;œufs de poule. Après l&#39;étape 4.5, l&#39;hôte est transformé pour l&#39;immunohistochimie monter l&#39;ensemble avec un anticorps spécifique à la caille des tissus (QCP1) et les étapes 3.1 à 3.4 et 5.1 à 5.7 sont omises de ce protocole. Un exemple de cette procédure alternative est indiqué ci-dessous: Dans ce cas, nous avons utilisé la même procédure expérimentale que dans A, B, mais nous avons utilisé la caille dérivées des tissus Donnor (comme indiqué par l&#39;expression d&#39;anticorps QCPN [brun]): Le régénérée noeud provenant d&#39;embryons de caille a induit l&#39;expression de marqueurs pan-neuronal Sox2 dans l&#39;hôte [tiré à part de 6]: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="Figure 3" width="154" height="230" />

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

Cette vidéo montre les différentes étapes à effectuer un essai pour l&#39;induction neurale; Ce dosage est essentiellement utilisé pour la caractérisation de molécules induisant putatifs neurale chez le poulet, et peut donc être utilisé pour une large variété d&#39;applications, allant de micromanipulations embryologique 1-4; 6 à démêler nouvelles cascades de signalisation 7,8, toutes visant à la compréhension de l&#39;étape initiale de la formation du cerveau et du reste du système nerveux.

<table><tbody><tr><td>Œufs</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Fertile de qualité supérieure</td><td>Fécondés, HH3+ (14 h)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9,5 ou similaire</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur d'hybridation</td><td>Équipement</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>Utiliser avec une coupelle Pyrex inversée et 500 ml d’eau désionisée&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;le bécher</td></tr><tr><td>Incubateur automatique Marsh</td><td>Équipement</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>plat Pyrex </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horloger&amp;rsquo;verre de 50 mm</td><td>Outil</td><td>VWR international</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>Anneaux de verre</td><td>Outil</td><td>Installation de maintenance physique</td><td></td><td>découper des sections de tube en verre de 4 mm d'épaisseur (27 mm de diamètre extérieur, 25 mm de diamètre intérieur). Ne pas polir finement.</td></tr><tr><td>Pinces courbes (1)</td><td>Outil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Pinces (2)</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>à bouts émoussés à l'aide d'une pierre à aiguiser et de 100 µl d'huile minérale</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Plaques en plastique</td><td>Outil</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Poire en caoutchouc</td><td>Outil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble du tube d'aspiration</td><td>Outil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;tireur d'électrodes</td><td>Équipement</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette</td><td></td></tr><tr><td>Pipette capillaire Pasteur</td><td>Outil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>bord arrondi sous la flamme</td></tr><tr><td>Chambre de culture</td><td>Outil</td><td>Pioneer Plastics</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>Tube microcapillaire</td><td>Outil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Couteau de microdissection</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Utiliser pour percer les cavités avant l'hybridation in situ</td></tr><tr><td>Épingles Minuten de 0,2 mm de diamètre</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Mélanger 1 part d'agent de durcissement avec 9 parts de base ; incuber O/N à 37 °C</td></tr><tr><td>Diéthylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Réactif</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Agent de réticulation et base d'élastomère de silicone Sylgard 184</td><td></td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>Mélanger 1 part d'agent de durcissement avec 9 parts de base ; incuber O/N à 37 °C</td></tr><tr><td>Diéthylpyrocarbonate (DEPC)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>Ajouter 1 ml de DEPC à 1 l de PBS ; agiter ; stériliser à l'autoclave</td></tr><tr><td>16 % PFA</td><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

L&#39;embryon de poulet est un outil précieux dans l&#39;étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l&#39;accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier la formation et la structuration initiale du système nerveux. Cette vidéo montre comment tissu organisateur du greffon dans un hôte, une méthode par laquelle le nœud de Hensen s (l&#39;organisateur de l&#39;embryon de poulet) est greffé à un ectoderme compétente d&#39;accueil. La greffe organisateur instruit recouvrant na avez tissus d&#39;adopter un sort via des signaux neuronaux induisant neurones. Ce mécanisme est appelé l&#39;induction neurale, et constitue la première étape dans la formation du cerveau et la moelle épinière chez les amniotes. Cette méthode est essentiellement utilisée pour la caractérisation des molécules induisant putatifs neurale chez le poulet. Cette vidéo montre les différentes étapes de l&#39;essai pour l&#39;induction neurale; d&#39;abord, l&#39;embryon n&#39;est Donnor explantés et épinglé sur un plat. Ensuite, l&#39;embryon d&#39;accueil est préparé pour une nouvelle culture. Le greffon est excisée et transplanté à la marge d&#39;hôte zone pellucide. L&#39;hôte est cultivée pendant 18 à 22 heures. L&#39;ensemble est fixé et traitées pour d&#39;autres applications (par exemple, hybridation in situ). Cette méthode a été initialement conçu par Waddington<sup&gt; 1,2</sup&gt; Et Gallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

L&#39;induction neurale est la première étape dans la formation du cerveau. C&#39;est un mécanisme par lequel le nœud de Hensen (organisateur), instruit les tissus adjacents à adopter un destin neuronal, c&#39;est à dire de donner naissance au système nerveux. Cette vidéo montre un essai pour l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

L'embryon de poulet est un outil précieux pour l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, son accessibilité et sa facilité de manipulation en font un...

Ce vidéo montre les différentes étapes du test d'induction neuronale chez l'embryon de poulet. Tout d'abord, l'embryon hôte est mis en culture. L'embryon donneur est ensuite mis en culture dans du sérum physiologique et le nœud de Hensen est marqué avec un colorant fluorescent. Le nœud de Hensen est excisé de l'embryon donneur et transplanté dans l'embryon hôte.L'embryon hôte est cultivé pendant 24 heures, fixé et traité pour l'oxydation photochimique sous fluorescence fey. Avec dab. L'embryon est ensuite traité pour une hybridation in situ avec un marqueur neural.Bonjour, je suis Delphine du laboratoire Fennell au Centre de médecine environnementale et génomique de l'Université Texas A&M à Houston. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réaliser des tests d'induction neuronale chez l'embryon de poulet. Nous utilisons cette procédure au laboratoire pour étudier les effets des médicaments anticonvulsivants sur les propriétés inductrices neuronales du nœud de Hensen.Commençons donc. Pour le test d'induction neuronale, il est nécessaire de préparer les œufs. Ces œufs doivent être incubés sur le côté dans un incubateur humide pendant 13 heures jusqu'au stade trois plus de Hamburger et Hamilton, ou HH trois plus.Ensuite, préparez l'embryon hôte en utilisant la nouvelle méthode de culture, qui a été décrite précédemment. Dans JoVE, recouvrez la surface de l'embryon hôte avec 200 microlitres de solution saline. Cela facilitera ultérieurement le transfert et le positionnement de la greffe donneur.Enfin, recouvrez l'assemblage avec une boîte de culture Falcon de 35 millimètres retournée. Pour épiler l'embryon donneur, ouvrez l'œuf en tapotant sur la coquille avec une pince. Retirez le dessus de la coquille et jetez-le.Retirer l'albumen épais à l'aide de pinces et incliner la poche vitelline avec des pinces épaisses afin que l'embryon soit orienté vers le haut. Après avoir retiré l'albumen, utiliser de fines ciseaux pour découper un carré de poche vitelline autour de l'embryon. Prélever l'embryon de la poche vitelline à l'aide d'une cuillère et le placer dans une boîte contenant du PBS.Ensuite, utilisez une pince pour détacher l'embryon donneur du vitellus et de la zone lucida. Une fois détaché, transférez l'embryon donneur dans une boîte de Pétri munie d'une garde SIL contenant du PBS afin de marquer et de transplanter la greffe. Utilisez un tireur d'électrodes microfines pour étirer des pipettes capillaires en verre de 50 microlitres sous microscope.Coupez l'extrémité de la micropipette à l'aide de fines pinces. Placez la micropipette dans une boîte de Pétri tapissée d'un ruban d'argile à modeler. Ensuite, préparez la solution de colorant, qui servira à marquer la greffe avant la transplantation.Préparez d'abord un stock de colorant à 0,5 % dans un millilitre d'éthanol absolu. Ce stock peut être conservé à moins 20 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Ensuite, dans un bloc chauffant réglé à 45 degrés Celsius, mélangez 10 microlitres du stock de colorant préalablement réchauffé avec 90 microlitres de saccharose 0,3 molaire. Cette température est nécessaire afin d'éviter la précipitation du colorant et la formation de cristaux insolubles.Faire tourner brièvement la solution dans une microcentrifugeuse SPECT pendant cinq à dix secondes. La solution DAI est désormais prête à l'emploi ; fixer l'embryon donneur sur le fond de la boîte recouverte de garde-fosse, côté dorsal vers le haut, à l’aide d’épingles à insectes. Une fois l’embryon fixé, remplir à nouveau la micropipette avec de l’œil D en appliquant une pression douce.À l’aide d’un embout d’aspiration. Appliquez une petite bolus de dai sur le nœud de Henson. Répétez l’opération en veillant à ce que l’ensemble du nœud de Henson soit marqué ensuite.À l’aide d’une pipette capillaire ou d’un couteau de dissection microscopique, couper le nœud de Hensen ; le côté dorsal du nœud peut être distingué du côté ventral car il forme un sillon, tandis que le côté ventral du nœud est plat. Si nécessaire, marquer le côté dorsal du greffon avec de la poudre de carmin. Cela garantira que le greffon est positionné avec l’orientation dorso-ventrale appropriée.À l’aide d’une pipette Gilson de 10 microlitres, transférez la greffe vers l’embryon hôte en utilisant une pipette capillaire microscopique. Rapprochez la greffe de la région lucita, zone à frontière opaque au niveau du nœud de Henson de l’embryon hôte. Ensuite, utilisez une pipette capillaire microscopique ou un couteau microchirurgical pour pratiquer une petite incision de 80 à 100 micromètres dans la région.Limite opaque de la zone lucita au niveau du nœud de Hensen de l'embryon hôte. À l’aide d’une micropipette capillaire ou d’un couteau de microdissection. Positionner la greffe de manière à ce que la face ventrale soit orientée vers vous et que l’extrémité postérieure soit parallèle à la région équivalente de l’embryon hôte O. Une fois en place, retirer le liquide physiologique de l’embryon hôte, en veillant à ce que la greffe reste bien positionnée à proximité immédiate du site hôte, puis traiter l’embryon hôte en culture nouvelle pendant 18 à 22 heures, comme décrit dans notre soumission précédente.Après 24 heures de culture, l'embryon est retiré de l'incubateur et fixé dans une boîte en forme de cigare. Le P-B-S-P-B-S est éliminé et remplacé par du paraformaldéhyde à 4 %. L'embryon est ensuite fixé pendant 24 heures.Jetez le fixateur dans un récipient approprié pour déchets dangereux et ajoutez du PBS dans la boîte de fixation. Retirez les épingles à insectes à l’aide de pinces après que les épingles aient été enlevées. Utilisez une pipette Pasteur à extrémité émoussée pour transférer l’embryon dans un flacon de scintillation contenant du PBS.Laver l'embryon deux fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune, puis une fois dans du tampon de décapage pendant cinq minutes après le lavage ; transférer l'embryon sur une lame creuse en verre contenant 0,1 millilitre de tampon Tris. Remplacer la solution de tampon Tris par 0,1 millilitre de solution DAB. Jeter la pointe einor dans un seau contenant une solution d'eau de Javel.Pour décontaminer le DAB, placez une lame couvre-objet sur la lame creuse sous le foyer de fluorescence au fluorescéine isothiocyanate FEI. L'objectif du microscope sur les cellules donneuses de greffe apparaîtra rouge fluorescent et sera exposé à la fluorescence FEI jusqu'à ce que toutes les cellules rouges fluorescentes deviennent brunes. Ce phénomène résulte de la conversion photochimique du fluorochrome en cristaux bruns insolubles par exposition à la longueur d'onde d'excitation FEI.4 88 nanomètres en présence de dab. Ce processus prend entre 20 minutes et deux heures. Une fois la réaction de photo-oxydation terminée, retirez le couvre-objet à l’aide de fines pinces. Transférez l'embryon dans un flacon de scintillation de 20 millilitres contenant du PBTW ou du PBS avec 0,1 % de Tween 20. Désactivez enfin le DAB à partir du couvre-objet et de la cavité en verre. Faites glisser en incubant une solution d'eau de Javel pour traiter l'embryon en vue de sa visualisation.Procédez à l'hybridation in situ en incubant l'embryon uniquement avec la sonde marquée au DIG. Ensuite, commencez à prendre des photographies et à réaliser les coupes comme décrit dans la vidéo JoVE deux. Voici un exemple de test d'induction neuronale.Au départ, la greffe est positionnée à la limite entre la région lucita et la région alpaca de l'embryon hôte. Les embryons donneur et hôte sont tous deux au stade trois plus. Après neuf heures en culture, la greffe commence à se différencier et induit ce qui apparaît comme une miniature de tête au stade huit moins.Après 24 heures en culture, l'induction neuronale est terminée après la fixation. L'embryon est traité pour l'oxydation photochimique. Au départ, les cellules marquées au colorant oculaire provenant du donneur se sont révélées proliférées, formant un mini-Noor, comme observé ici en rouge.Après l'oxydation photochimique, ces cellules apparaissent brunes. L'embryon est ensuite traité par hybridation in situ sur coupe entière pour le marqueur neural. O otx two développé dans le laboratoire du Dr. Bonelli.Le greffon donneur induit l'expression de OTX deux à partir du tissu issu de l'hôte. Nous venons de vous montrer comment réaliser un test d'induction neuronale dans l'embryon de joue. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'éliminer tout liquide présent dans la zone entourant la greffe après la transplantation, à l'aide d'une pipette.Cela permettra de s'assurer que la greffe est correctement positionnée et qu'elle ne se déplacera pas par rapport à l'embryon hôte pendant la culture. Voilà, c'est tout. Merci. Bon visionnage et bonne chance avec vos expériences.

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