Principes fondamentaux de l'élevage et du sevrage

Fundamentals of Breeding and Weaning

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Lab Animal Research

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Fundamentals of Breeding and Weaning

5.2: Basic Care Procedures

5.14: Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest

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13:54 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR ; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Université de Notre Dame, Indiana

Des millions de souris et les rats sont élevées pour une utilisation dans la recherche biomédicale chaque année. Dans le monde entier, il y a plusieurs installations de grand élevage commercial que les souris offre aux laboratoires de recherche, mais de nombreuses installations choisissent de nichent aussi des souris et des rats internes afin de réduire les coûts et augmentera les possibilités de recherche. Reproduction à l’animalerie, les chercheurs sont en mesure de manipuler la génétique des animaux, le temps de la grossesse pour répondre aux besoins de la recherche et travailler avec les embryons et les nouveaux-nés comme l’exige.

Souris et les rats peuvent être élevés dans une variété de régimes et de méthodes. Les procédures techniques, telles que l’utilisation de la cytologie vaginale, visualisation de la zone vaginale et l’observation des bouchons copulateurs, ont été développés afin de faciliter la synchronisation d’élevage pour correspondre aux besoins de recherche. Ce manuscrit est une vue d’ensemble des bases fondamentales de souris et de rat élevage et de procédures techniques utilisées. Des descriptions plus détaillées des régimes de reproduction complexe et la description complète des méthodes pour la cytologie vaginale, sont disponibles dans la liste des références.

Principles

Types courants des souches et des Stocks

Souris et les rats sont couramment élevés comme des actions non consanguines, souches consanguines et souches hybrides. Animaux non consanguins présentent des caractéristiques similaires, mais n’est pas identiques génétiquement. Ils sont élevés au hasard pour maintenir l’hétérozygotie ou variance génétique. En revanche, les animaux consanguins ont été croisés au moins 20 générations de frère-soeur ou mère-progéniture d’accouplement et est génétiquement homozygote. Enfin, les animaux hybrides sont la progéniture de l’accouplement de deux souches consanguines.

Facteurs qui influent sur le comportement reproducteur

Il y a beaucoup de facteurs qui peut influencer les performances de reproduction des souris et des rats. La vigueur des reproducteurs femelles dépend largement du niveau de la consanguinité. Les animaux qui sont tel sont beaucoup plus robustes et plus vigoureux, ainsi, ils produisent des portées plus grandes et plus fortes. Certaines souches couramment utilisées, telles que la souris C57BL/6, affichent des comportements agressifs qui peuvent interférer avec la reproduction. Lorsqu’une souche agressive de reproduction, toutes les portées doivent être étroitement surveillées. Animaux d’une litière contenant chiots agressifs pas doivent être utilisés que pour la reproduction. Température, l’humidité et les variations d’éclairage peuvent causer une diminution dans l’efficacité de la reproduction. Bruits et vibrations dans les salles d’élevage ont démontré également d’entraîner des effets délétères. Contrôle de ces variables dans l’établissement d’élevage réduira certains effets. ¹ les animaux avec des modifications génétiques ont tendance à être moins rustique et fertile, et certaines mutations peuvent entraîner la létalité des petits avant ou peu après la naissance.

Régimes de reproduction

Régimes de reproduction sont semblables pour les souris et les rats. Les systèmes couramment utilisés sont l’accouplement monogame d’une femelle accouplée à un mâle ou polygames accouplement de deux ou plusieurs femelles accouplée à un mâle. La femelle souris et le rat sont polyœstrien et subir un oestrus post-partum environ 20 à 24 heures après l’accouchement. Pendant l’oestrus post-partum, la femelle peut concevoir une litière. Pour les souches de souris ou de rats qui ont une durée de vie courte reproduction due à une mutation génétique, il est courant de laisser le mâle dans la cage avec la femelle afin qu’elle peut concevoir immédiatement une autre litière. Ce système d’élevage intensif peut être stressant pour la femelle, comme elle est continuellement en lactation et en gestation. Un régime extensif consiste à séparer la femelle une fois qu’elle est visiblement enceinte ; elle ne revient pas à la cage du mâle jusqu’à ce que sa portée a été sevrée. Ce système est beaucoup moins exigeant sur la femelle.

Reproduction à des fins de Manipulation génétique

Animaux transgéniques (GEAs) est deux animaux knock-out qui ont eu des gènes retirés de leur génome ou animaux transgéniques qui ont eu des gènes d’une espèce différente, ajouté dans leur génome. Les GEAs sont alors élevés comme une souche consanguine et sont souvent élevés avec autres GEAs pour créer un animal complex, manipulé génétiquement pour projets de recherche très précis. Régimes de reproduction complexes sont utilisés pour créer des souches avec certains gènes enlevés et d’autres ajoutés. Modèles animaux pour de nombreux gènes liés troubles, y compris, mais non limité à, la maladie d’Alzheimer, le cancer, accident vasculaire cérébral et autres troubles sanguins, diabète et rétinienne pigmentos-ont été mis au point par génie génétique des animaux.

La plupart des schémas de reproduction peuvent compter sur la génétique mendélienne pour faire des prédictions sur les ratios de génotype. Lorsqu’une souris de type sauvage est accouplée avec une souris avec un gène modifié (un hétérozygote), les résultats escomptés seraient animaux de type sauvage de 50 % et 50 % hétérozygotes. Une souris de type sauvage croisée avec une souris avec deux gènes modifiés (un homozygote) se traduira par tous les descendants sont hétérozygotes. Lorsque deux animaux hétérozygotes est croisés, tous trois génotypes devraient être présents dans les pourcentages suivants : type sauvage de 25 %, 50 % hétérozygotes et homozygotes de 25 %. Il ressort de ces attentes que des gènes létaux embryonnaires peuvent être détectées (i.e., s’il n’y a aucune progéniture homozygote produites).

Figure 1. Croisements possibles et des résultats basée sur la génétique mendélienne. Animaux de type sauvage ne sont pas génétiquement modifiés et sont désignés comme (+ / +). Animaux hétérozygotes ont une copie d’un gène modifié et sont désignés comme (-/ +) ; les animaux homozygotes ont deux copies d’un gène modifié et sont désignés comme (- / -).

Des millions de souris et les rats sont élevées pour une utilisation dans la recherche biomédicale chaque année, et de nombreuses institutions choisissent à cette interne réduire les coûts et augmenter les options de recherche. Les avantages de l’élevage interne sont, 1) chercheurs sont capables de manipuler la génétique des animaux par le biais de la reproduction sélective 2) ils peuvent temps grossesses pour répondre aux besoins de la recherche, et 3) ils peuvent travailler avec les embryons et les nouveaux-nés si nécessaire. Toutefois, pour configurer un système de reproduction réussie, il faut comprendre le œstrus tous les rongeurs. En outre, ils doivent avoir des connaissances sur les différents systèmes d’accouplements, les facteurs influant sur le comportement de reproduction rongeur et les considérations sevrage… qui seront abordés dans cette vidéo de présentation.

Commençons par l’examen du cycle oestral rongeur. Souris et les rats femelles sont polyœstrien, ce qui signifie qu’ils ont plus d’un oestrus cycle dans un an ou une saison de reproduction. Chaque cycle dure 4-5 jours et peut être divisé en 4 étapes : métoestrus, dioestrus, pro-oestrus et l’oestrus. Oestrus est la phase ovulatoire, ce qui signifie que, si la femelle est dans le pro-oestrus ou la phase d’oestrus, elle est prête à concevoir.

Déterminer la phase du cycle oestral consiste en un examen visuel. Manuellement de retenir l’animal par la queue et les pattes de devant se reposer sur un couvercle de cage et inspecter soigneusement la taille de l’orifice vaginal et le tissu environnant. Au cours de la phase du proestrus, l’ouverture du vagin est large et se caractérise par un gonflement du tissu environnant, qui est de couleur rose et très humide. Il y a souvent des rides ou des stries le long des arêtes ventrales et dorsales de l’ouverture. Au cours de le œstrus, le gonflement autour de que l’orifice vaginal est réduite et les tissus ne sont pas aussi humide et rose. Pendant le métoestrus, l’ouverture du vagin est minime et il n’y a enflure négligeable. Au cours de strus, il n’y a pas de gonflement des tissus autour de la zone vaginale et l’ouverture est petite ou fermé.

Une autre approche plus précise pour déterminer la phase du cycle oestral est la cytologie vaginale pour la cellule, les échantillons sont prélevés par lavage ou écouvillonnage. Pour le lavage, placer une ampoule de latex à l’extrémité d’une pointe stérile 200-microlitre et établit par environ 100 microlitres de l’eau bidistillée stérile dans la pipette. Ensuite, soulevez la souris hors de la cage et la placent sur le dessus de cage métallique bar avec sa queue vers vous. Saisir la queue fermement et élever l’arrière-train de la souris tels qu’uniquement les pattes avant sont saisir le couvercle. Placer l’extrémité de la pointe remplie lors de l’ouverture du canal vaginal sans pénétrer l’orifice. Appuyer légèrement sur l’ampoule pour expulser environ 25 à 50 microlitres d’eau lors de l’ouverture vaginale. Le liquide va spontanément aspirer dans le canal sans insertion de pointe. Relâcher lentement la pression exercée sur l’ampoule et le fluide se retirera vers la pointe. Répétez 4 à 5 fois en utilisant la même astuce, ampoule et fluide pour obtenir un nombre suffisant de cellules dans un seul échantillon. Placer le liquide sur lame de verre et laisser le frottis à sécher à température ambiante. Une fois sec, ces frottis de œstrus peuvent être stockés pour une utilisation ultérieure, ou ils peuvent être soit traités immédiatement à l’aide de la coloration de Wright-Giemsa, qui est une tache en une seule étape et ne nécessitant pas de fixation. La diapositive est placée dans la tache pendant 45 à 60 secondes.

En revanche, pour le pistonnage, mouiller un 2 mm coton-tige avec du sérum physiologique. Insérez l’extrémité de l’applicateur dans le vagin de la souris sobre et tournez doucement et rouler la pointe contre la paroi vaginale. Puis retirer l’écouvillon avec précaution et transférer les cellules à une lame de verre sèche en faisant rouler l’écouvillon sur la diapositive. Cette procédure est considéré comme stressante et peut causer des dommages si elle n’est pas produite doucement, avec retenue appropriée, ainsi qu’avec les écouvillons en coton de taille correcte. Comme le lavage, une fois que la lame est sèche, il peut être coloré avec la tache Wright-Giemsa. Après coloration, les lames peuvent être examinés au microscope.

Si la femelle est dans le pro-oestrus, les cellules sont considérés comme amas de ronde, bien formée, nucléées avec un noyau qui taches plus foncées que le cytoplasme des cellules épithéliales. Si elle est en phase d’oestrus, la plupart des cellules est des cellules épithéliales squameuses cornéocytaire qui n’ont pas un noyau. Ils sont angulaires en apparence et en grappes denses. Si la femelle est en métoestrus, les cellules sont typiquement globules blancs, notamment des neutrophiles, avec quelques cellules épithéliales squameuses cornéocytaire présents. Au cours de strus, les cellules présentes sont normalement globules blancs avec la présence de quelques cellules épithéliales nucléées.

Maintenant que vous avez une compréhension du cycle oestral rongeur, nous allons discuter de comment l’accouplement de Set-up. Première étape est la détermination du sexe, qui se fait en comparant la distance ano-génitales. Chez les femelles, la distance entre l’anus et les organes génitaux externes est plus courte que ce soit pour les mâles. Basé sur les besoins de la recherche et l’efficacité de reproduction de la souche, le schéma d’accouplement peut être monogame–lorsqu’une femelle est élevé pour un mâle ou polygame–où deux ou plusieurs femelles sont élevées à un mâle.

En termes de calendrier, étant donné que le cycle oestral rongeur est court seulement 4-5 jours long-un peut mettre en place l’accouplement au hasard. Ou ils peuvent mettre en place « timed accouplement », qui consiste à introduire la femelle à l’armature de l’accouplement quand elle est au point de réceptivité maximale et de la fertilité-c’est durant le pro-oestrus ou la phase d’oestrus. Dans les deux cas, l’accouplement doit être configuré à la fin d’une journée, comme les rongeurs sont des animaux nocturnes et ont tendance à s’accoupler pendant la nuit. Le lendemain matin, la femelle est examinée d’un bouchon copulatoire – une masse blanchâtre constitué de sécrétions vaginales et le sperme qui persiste pendant la copulation après 12 à 24 heures. Si le bouchon copulatoire n’est pas visuellement évident, insérez doucement l’extrémité d’une sonde émoussée dans l’orifice vaginal. La présence d’un bouchon copulatoire n’entravera l’avancement de la sonde à 0,5 cm de l’orifice vaginal. Dans le cas d’un accouplement aléatoire, bouchon copulatoire apparence prend généralement trois jours. La présence d’un bouchon confirme l’accouplement ne garantit pas que la femelle est enceinte.

Dès qu’une fiche de copulation est constatée, la femelle doit être surveillée pour des signes de grossesse comme le gain de poids. Si la femelle branchée est enceinte, puis le jour de la fiche a été trouvée est embryonnaire jour zéro ou E0 et le lendemain est considéré comme le premier jour de la gestation, ou E1, et ainsi de suite jusqu’à la parturition-c’est-à-dire donnant naissance-ce qui est entre 19 à 21 jours. Environ 20 à 24 heures après l’accouchement, les souris et les rats femelles subissent un oestrus et peuvent concevoir à nouveau.

Dans un schéma de l’élevage intensif, qui est couramment utilisé pour les animaux ayant une durée de vie courte reproduction due à une mutation génétique, les animaux mâles sont laissés dans la cage avec la femelle et les petits, alors que la femelle peut concevoir une autre litière immédiatement. Ce régime peut être stressant pour la femelle, comme elle est continuellement en lactation et en gestation. Au contraire, le système d’élevage non intensif, consiste à séparer la femelle une fois qu’elle est visiblement enceinte et pas son retour à la cage du mâle, jusqu’à ce que sa portée a été sevrée, ce qui en fait un moins exigeant régime de reproduction.

Il y a beaucoup de facteurs qui peut influencer les performances de reproduction des souris et des rats. Nous allons examiner certains d’entre eux, qui montent plus fréquemment. La vigueur des reproducteurs femelles dépend largement du niveau de la consanguinité. Les animaux qui sont tel sont beaucoup plus robustes et vigoureux, ainsi, ils produisent des portées plus grandes et plus fortes. Un autre facteur qui peut affecter les performances de reproduction est un comportement agressif. Certaines souches couramment utilisés, comme les souris C57BL/6, ont tendance à afficher l’agression, qui peut interférer avec la reproduction. Lorsqu’une souche agressive de reproduction, toutes les portées doivent être étroitement surveillées. Animaux d’une litière contenant chiots agressifs pas doivent être utilisés que pour la reproduction. Température, l’humidité et les variations d’éclairage peuvent causer une diminution dans l’efficacité de la reproduction. Bruits et vibrations dans les salles d’élevage ont démontré également d’entraîner des effets délétères. Animaux sous réserve de modifications génétiques ont tendance à être moins rustique et fertile, et certaines mutations peuvent entraîner la létalité des petits avant ou peu après la naissance.

Maintenant nous allons passer brièvement en revue comment sevrer les petits de ces animaux de laboratoire. Le moment de commencer le sevrage diffère selon le système de reproduction. Dans le cas d’élevage non intensif, les jeunes peuvent être sevrés à l’âge de 21 à 28 jours. Mais dans le cas de l’élevage intensif, les chiots de chaque portée sont sevrés à petits jour 20 pour empêcher les plus âgés d’être présent lors de la prochaine portée en né. Étant donné que les rongeurs peuvent commencer dès l’âge de 8 semaines d’accouplement, mâles et femelles est séparées au moment du sevrage. Lorsque cela est possible, récemment sevrés ne doivent pas être logés séparément.

Si une litière contient seulement un chiot d’un sexe donné, tentatives devraient être faites pour abriter ce chiot avec chiots du même sexe d’une autre litière. Les options de logement possible pour le sevrage des chiots sont répertoriées dans le manuscrit ci-dessous. Rats et les souris sevrés doivent vérifier quotidiennement pour s’assurer qu’ils sont en plein essor. Pour la production alimentaire, une petite quantité de nourriture, une pastille par souris, devrait figurer sur le plancher de la cage pour les premières 7-10 jours, avec de la nourriture supplémentaire sur le dessus de la cage. Cela encouragera les animaux à la transition pour avoir chow rongeur comme leur seule source d’alimentation. Pour l’approvisionnement en eau, une bouteille doit être ajoutée, même si les animaux sont logés sur les paniers avec système d’arrosage automatique. Il s’agit pour prévenir la déshydratation.

Enfin, nous allons voir comment les scientifiques utilisent la démarche de sélection interne à leur avantage. Une des applications plus courantes de mise en place d’accouplement est de développer des souris atteintes de génotype altéré. Pour étudier la fonction d’un gène, les chercheurs perturbent souvent son code génétique. Cependant, ces animaux comme les humains est diploïdes et donc avoir deux copies du même gène. Donc, afin de perturber le gène complètement, les souris modifiées doivent être élevés pour produire un animal avec les deux copies dysfonctionnels, en d’autres termes un masquage homozygote. Souris avec une copie dysfonctionnelle sont appelés hétérozygotes ou hets.

L’autre avantage de la mise en place d’un accouplement interne est de tester l’effet de l’exposition prénatale aux composés d’essai. Par exemple, ici les chercheurs a fourni femelle gravide une diète liquide contenant de l’alcool de E7 à E13. Puis sur E13, ils disséqué la femelle gravide, obtient le cerveau foetal et eux découpé en tranches minces. Enfin, la coloration des lames a révélé que l’exposition prénatale à l’alcool ont augmenté de mort des cellules dans le tissu neural.

Enfin, élevage interne permet également l’étude des post grossesse troubles comme la dépression post-partum. Dans cette étude, les scientifiques d’abord déplacé la litière loin du barrage durant la période de lactation. Puis, 60 minutes plus tard, réintroduit les chiots au barrage. Et pour induire un stress chez la femelle, a ajouté un nouvel intrus mâle à la cage. Ensuite, les chercheurs ont observé le barrage pour agression maternelle, qui comprend les attaquer et mordre le mâle intrus ainsi que pour les comportements différents soins à la mère comme le chiot toilettage et soins infirmiers. Les données obtenues ont révélé que le stress a un effet significatif sur l’agression maternelle après l’accouchement et de soins.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur les fondements de la reproduction et sevrage des souris et des rats en laboratoire. Vous devriez maintenant avoir une meilleure compréhension du cycle oestral rongeurs et également savoir comment déterminer l’étape de cycle et comment s’en servir pour régimes accouplement réussi de Set-up. Nous avons également examiné les facteurs qui peuvent affecter le comportement de reproduction, et explique comment et quand sevrer souris et rat chiots. Comme toujours, Merci pour regarder !

Procedure

1. renseignements requis lors de l’appariement des animaux comprennent souche/stock de l’animal en utilisant la nomenclature appropriée, dates de naissance pour l’éleveur mâle et femelle ainsi que la date d’installation. Tenue de dossiers précis est impératif avec les colonies reproductrices.

2. sex determination des souris et des rats est faite en comparant les distances ano-génitales. Chez les femelles, la distance entre l’anus et les organes génitaux externes est plus courte que c’est pour les hommes. La présence d’un sac scrotal chez les animaux mâles est un autre indicateur de sexe.

3. sélection et mise en place le système d’accouplement

Remarque : Il existe deux régimes d’accouplements qui peuvent être utilisés.

Pro-oestrus/oestrus chronométré accouplement : cette méthode s’appuie sur éplucher les femmes avec les hommes au point de réceptivité maximale et de la fertilité.
1. Le cycle oestral doivent être surveillé chez les femelles, soit par examen visuel des organes génitaux externes pour les modifications qui sont indicatifs du proestrus et œstrus, soit par la cytologie des sécrétions vaginales (voir ci-dessous).
2. Quand une femme est considérée comme en pro-oestrus ou oestrus, elle est jumelé avec un mâle à la fin de la journée, car les animaux s’accouplent généralement pendant la nuit.
3. Le lendemain matin, la femelle est examinée d’un bouchon copulatoire (voir ci-dessous). Si aucune fiche n’est présent, la femelle peut rester avec le mâle pendant la journée et vérifié d’un bouchon copulatoire à la fin de la journée. Par ailleurs, s’il est établi qu’elle n’est plus dans le pro-oestrus ou oestrus, elle est supprimée de la cage de reproduction.
Random chronométré accouplement : cette méthode est basée sur le fait, le cycle oestral de rongeurs est très court, longue de 4-5 jours.
1. Pour cette méthode, accouplements peuvent être mis en place en tout temps, et les femelles sont ensuite vérifiées pour bouchons copulateurs chaque matin et soir jusqu’à ce qu’une fiche est observée.
2. Une femelle est appariée avec un mâle dans la soirée.
3. Elle est vérifiée pour un bouchon copulatoire au début et à la fin de chaque jour jusqu’à ce qu’une fiche est observée. Il faut généralement 3 jours ou plus d’une fiche à considérer lors de l’utilisation de cette méthode.

4. prédiction de grossesse

Étant donné que la palpation des chiots est difficile jusqu’à ce que plus tard au cours de la grossesse, autour de jour 10-12, systèmes à ultrasons commercial pour rongeurs ont été développés ; Cependant, peu d’installations de recherche sur les animaux ont cette technologie. Par conséquent, visualisation des bouchons copulateurs, observation des changements vaginaux ou cytologie vaginale sont utilisées pour aider à prédire quand une femme a conçu une litière (voir ci-dessous). Toutefois, aucune de ces méthodes sont en mesure de confirmer la grossesse. Dès qu’une fiche de copulation est constatée, la femelle doit être surveillée pour des signes de la grossesse, tels que prise de poids.

5. déterminer la phase du cycle oestral

Inspection visuelle
Remarque : Pour enfichage chronométré des souris et des rats, l’observation visuelle du vagin pour les modifications qui sont révélateurs du proestrus et oestrus est la méthode la plus rapide pour déterminer le stade du cycle oestral et ne nécessite aucun équipement spécial.
1. Lors de l’évaluation du cycle oestral utilisant la méthode visuelle, il est important de procéder à l’inspection visuelle dans la même région en ce qui concerne l’éclairage de la pièce, comme la source de lumière peut changer la couleur perçue des tissus vaginaux et compliquent l’évaluation. Par exemple, la teinte pourpre fondues par lumières LED rend plus difficile la détection visuelle.
2. Pour évaluer la phase du cycle oestral par observation visuelle, chaque souris doivent être maintenue manuellement par la queue, avec les pattes de devant se reposer sur un couvercle de cage.
3. L’ouverture du vagin de chaque femme est évaluée selon la condition du tissu qui entoure la zone vaginale et la taille de l’orifice vaginal. ²
  1. Au cours du proestrus, l’ouverture du vagin est large et se caractérise par un gonflement du tissu environnant. Le tissu est de couleur rose et très humide. Il y a souvent des rides ou des stries le long des arêtes ventrales et dorsales de l’ouverture.
  2. Pendant le œstrus, le gonflement des tissus entourant l’orifice vaginal est réduit, et les tissus ne sont pas aussi humide et rose.
  3. Au cours du métoestrus l’orifice vaginal est minime et il n’y a enflure négligeable.
  4. Au cours de strus, il n’y a pas de gonflement des tissus autour de la zone vaginale, et l’ouverture du vagin est petit et fermé.
Cytologie vaginale
Comme les souris et les rats sont polyœstrien, la longueur du cycle oestral est très courte, allant de 4 à 5 jours. Il est parfois nécessaire d’identifier les quatre stades de œstrus : pro-oestrus, oestrus, métoestrus et dioestrus. La cytologie vaginale est une méthode très précise pour déterminer ces étapes. Il y a également deux méthodes de prélèvement d’échantillons : la méthode non invasive de lavage vaginal et la méthode invasive d’écouvillonnage du canal vaginal.
1. Lavage vaginal
  1. Matériaux nécessaires sont stériles 200 µl pipettes conseils, ampoules latex, stérile double distillée (ddH₂0) et nettoyer les lames de verre.
  2. Placer une ampoule de latex à l’extrémité d’une pointe 200 µl stérile. Aspirer environ 100 µl de ddH stérile₂O dans la pipette.
  3. Soulever la souris hors de la cage et lui mettre sur le dessus de cage métallique bar avec sa queue vers vous.
  4. Saisir la queue fermement et élever l’arrière-train de la souris. La souris auront désormais uniquement les pattes avant, saisir le couvercle.
  5. Si la souris urine, attendez que la miction s’arrête. Si l’on urine à gauche à l’entrée du canal vaginal, l’ouverture peut être rincé avec une petite giclée de ddH₂O. changement la pointe qui a été utilisée pour le rinçage.
  6. Placer l’extrémité de la pointe de rempli d’O₂ddH lors de l’ouverture du canal vaginal sans pénétrer l’orifice.
  7. Appuyer légèrement sur l’ampoule pour expulser un quart à la moitié du volume d’eau (environ 25-50 µl) lors de l’ouverture du canal vaginal. Le liquide va spontanément aspirer dans le canal sans insertion de pointe. Relâcher lentement la pression exercée sur l’ampoule. Le fluide se retirera vers la pointe.
  8. Éviter de libérer la pression trop vite pour éviter l’aspiration de liquide dans l’ampoule. Une astuce filtrée peut être utile à cette fin.
  9. Répétez l’étape précédente 4 – 5 fois en utilisant la même astuce, ampoule et fluide pour obtenir un nombre suffisant de cellules dans un seul échantillon.
  10. Placer le liquide sur lame de verre et laisser le frottis à sécher à température ambiante.
  11. Utiliser une pipette de nouveau pour chaque souris.
  12. Une fois sec, ces frottis de œstrus peuvent être souillés immédiatement ou stockés et colorées à une date ultérieure. Coloration de Wright-Giemsa est plus couramment utilisée pour colorer les diapositives. Cette tache est disponible dans le commerce comme une tache d’une étape qui ne nécessite pas de fixation de la lame pour empêcher les cellules de lavage pendant le processus de coloration. La diapositive est placée dans la tache pendant 45 à 60 secondes, selon les instructions du fabricant.
  13. Les diapositives sont alors examiné sous un microscope et les cellules vus correspondent à la phase du cycle : 1) si la femelle est dans le pro-oestrus, les cellules sont considérés comme des grappes de ronde, bien formée nucléées des cellules épithéliales avec un noyau qui taches plus foncées que le cytoplasme ; 2) si la femelle est en oestrus, la plupart des cellules est des cellules épithéliales squameuses cornéocytaire qui n’ont pas un noyau, sont angulaires en apparence et apparaissent en grappes denses ; 3) si la femelle est dans métoestrus, les cellules sont typiquement globules blancs (spécifiquement neutrophiles avec quelques cellules épithéliales squameuses cornéocytaire présents) avec coloration sombre des noyaux qui sont formés comme les deux saucisses reliés entre eux ; 4) durant le dioestrus, les cellules présentes sont normalement globules blancs avec la présence de quelques cellules épithéliales nucléées…
2. Vaginal pistonnage
  1. Matériaux nécessaires sont stériles cotons-tiges avec une pointe de diamètre 2 mm, lames de microscope de verre propre et stérile de sérum physiologique.
  2. Mouillez un coton-tige avec du sérum physiologique.
  3. Insérez l’extrémité de l’applicateur dans le vagin de la souris sobre.
  4. Doucement tourner et rouler la pointe contre la paroi vaginale. Retirer délicatement l’écouvillon.
  5. Cellules sont transférées à une lame de verre sèche en faisant rouler l’écouvillon sur la diapositive.
  6. Une fois que la lame est sèche, il peut être coloré avec tache Wright-Giemsa.
    Pistonnage est considéré comme une procédure stressante, et -quand a souligné-souris peuvent avoir perturbé cycles oestraux. Stimulation vaginale et cervicale causée par écouvillonnage peut induire la Pseudo-grossesse. Des prélèvements répétés de la muqueuse vaginale peuvent causer des dommages si elle n’est pas effectuée doucement, avec retenue appropriée et avec les tampons de coton taille corriger. ^{3, 4}

La figure 2. La cytologie vaginale–cycle de différentes étapes de l’oestrus rongeurs

6. visualiser un bouchon copulatoire

Cette fiche se compose de sperme et les sécrétions vaginales et persiste dans le vagin pour postcopulation de 12 à 24 heures. La présence du bouchon confirme l’accouplement, mais ne garantit pas que la femelle est enceinte. Si la femelle branchée est enceinte, le premier jour de la gestation est considéré comme étant le jour après que le bouchon se trouve.

Soulever la souris hors de la cage et la placent sur le dessus de cage métallique bar avec sa queue vers vous.
Position de la souris en appuyant juste au-dessus de la queue se cambrer le dos pour permettre la meilleure présentation de l’orifice vaginal.
Observer son ouverture vaginale pour une masse blanchâtre. Le bouchon copulatoire ne peut être visuellement évident mais peut être confirmé par l’utilisation d’une sonde émoussée.
À l’aide de la pointe de la sonde, l’insérer doucement dans l’orifice vaginal. La présence d’un bouchon copulatoire n’entravera l’avancement de la sonde à 0,5 cm de l’orifice vaginal.
La sonde doit être désinfectée avec de l’alcool et sécher complètement avant chaque utilisation.

La femelle ayant des portées, la date de naissance, la taille de la portée, le nombre né, le nombre de sevrés, le rapport de masculinité chiots, et le ratio des génotypes devrait tous être enregistré. Si les génotypes au sein d’une portée ne correspondent pas à des génotypes des parents, un nouvel essai doit être fait pour vérifier le génotype vrai.

7. le sevrage

Gestation pour souris et rats est d’environ 21 jours. Les jeunes sont sevrés à l’âge de 21 à 28 jours. Les souris et les rats peuvent se reproduire dès l’âge de 8 semaines, donc il est impératif que les chiots sont séparés par sexe à un âge précoce. Élevage intensif nécessite que les chiots de chaque portée être sevré au jour 20 pour empêcher les chiots plus âgés d’être présent lors de la prochaine portée est né. Pour l’élevage extensif, les chiots peuvent être laissés avec sa mère depuis 20 jours, souvent jusqu’à 28 jours d’âge. Cela peut être très bénéfique pour les nombreuses souches génétiquement modifiés, car les chiots n’est peut-être pas aussi vigoureux comme des animaux de type sauvage ou.

Mâles et femelles est séparées au moment du sevrage. Lorsque cela est possible, récemment sevrés ne doivent pas être logés séparément. Si une litière contient seulement un chiot d’un sexe donné, tentatives devraient être faites pour abriter ce chiot avec d’autres personnes du même sexe. Options de logement possibles sont : 1) un seul chiot femelle peut-être rester avec la mère, sinon dans une cage d’élevage intensif ; 2) un seul petit de sexe féminin ou masculin peut être placé avec les autres programmes potentiellement indésirables de même-sexe dans une litière différente du même âge ; 3) si les parents sont un couple monogame, la femelle peut être enlevée de la cage pour permettre à un seul petit mâle être logé avec le père ; et 4) un chiot mâle unique peut-être être hébergé avec les frères et sœurs femelles vers le haut à l’âge de 5 semaines. Le sexe des chiots devrait être vérifié une semaine après le sevrage pour éviter les portées non désirées de chiots mal distincts.

Rats et les souris sevrés doivent vérifier quotidiennement pour s’assurer qu’ils sont en plein essor. Bien que la Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire⁵ affirme qu’aliments doivent être présentés aux animaux de manière à éviter qu’il ne soit souillé par les excréments et l’urine, souris nouvellement sevrés devraient bénéficier d’une petite quantité de nourriture (un granulés par la souris) placé dans un plat en verre (Pétri) sur le plancher de la cage. Cela encouragera les animaux à la transition pour avoir chow rongeur comme leur seule source d’alimentation. Même pour les animaux qui sont trouvent sur des étagères qui fournissent de l’eau pour les cages à travers un système d’arrosage automatique, une bouteille d’eau peuvent être ajoutée à la cage si les souris semblent être déshydraté.

Nom	Type de colonie	Description
IC	Tel	Albino
Swiss-Webster	Tel	Albino
BALB/c	Consanguines	Albino
FVB	Consanguines	Albino
C57BL/6	Consanguines	Couleur de la robe noire
C₃H	Consanguines	Couleur de la robe brun
S/N/2	Consanguines	Couleur de la robe marron/gris
Athymiques nus (nu/nu)	Consanguines	Sans poils
SCID	Consanguines	Sévère combinée immunodéficientes souris-différentes couleurs

Le tableau 1. Couramment utilisé des souris taches et des stocks.

Nom	Type de colonie	Description
Sprague-Dawley	Tel	Albino
Wistar	Tel	Albino
Fisher 344	Consanguines	Albino
Lewis	Consanguines	Albino
Long Evans	Consanguines	Capuchon, noir et blanc

Le tableau 2. Les stocks et les souches de rats couramment utilisés

Applications and Summary

Colonies nicheuses interne offrent une flexibilité à la recherche, notamment avec les projets qui utilisent les embryons ou les nouveau-nés. Utilisant des techniques telles que chronométré s’accouplant avec fiches copulateurs et cytologie vaginale, la date de conception et de la gestation peut plus prévoir avec exactitude. Cela permet aux chercheurs de planifier plus soigneusement leurs expériences. Contrôler les facteurs environnementaux tels que les cycles de lumière, température, humidité et vibrations permettra d’optimiser les résultats de la reproduction.

References

Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8^th ed. Washington (DC): National Academies Press.

Transcript

Millions of mice and rats are bred for use in biomedical research every year, and many institutions choose to this in-house to reduce costs and increase research options. The advantages of in-house breeding are, 1) researchers are able to manipulate the genetics of the animals through selective breeding 2) they can time pregnancies to meet research needs, and 3) they can work with embryos and neonates as necessary. However, to setup a successful breeding scheme, one should understand the rodent estrous cycle. In addition, they should have knowledge about the different mating schemes, the factors affecting rodent breeding behavior and the weaning considerations…all of which will be discussed in this video presentation.

Let’s begin with review of the rodent estrous cycle. Both female rats and mice are polyestrous, meaning they have more than one estrus cycle in a year or a breeding season. Each cycle lasts for 4-5 days and can be divided into 4 stages: metestrus, diestrus, proestrus, and estrus. Estrus is the ovulatory phase, which means that if the female is in the proestrus or the estrus phase, she is ready to conceive.

One way to determine the estrous cycle stage is by visual examination. Manually restrain the animal by the tail and with the forepaws resting on a cage lid and carefully inspect the size of the vaginal opening and the surrounding tissue. During the proestrus phase, the vaginal opening is wide and is characterized by swelling of the surrounding tissue, which is pink in color and very moist. Often there are wrinkles or striations along the dorsal and ventral edges of the opening. During the estrus, the swelling surrounding the vaginal opening is reduced and the tissues are not as moist and pink. During the metestrus, the vaginal opening is minimal and there is negligible swelling. During diestrus, there is no swelling of the tissues around the vaginal area and the opening is small or closed.

Another, more accurate approach for determining the estrous cycle stage is vaginal cytology for which cell samples are collected by either lavage or swabbing. For lavage, place a latex bulb on the end of a sterile 200-microliter tip and draw up approximately 100 microliters of sterile double distilled water into the pipette. Next, lift the mouse out of the cage and place her on the wire bar cage top with her tail towards you. Firmly grasp the tail and elevate the hindquarters of the mouse such that only the front paws are grasping the lid. Place the end of the filled tip at the opening of the vaginal canal without penetrating the orifice. Gently depress the bulb to expel approximately 25-50 microliters of water at the vaginal opening. The liquid will spontaneously aspirate into the canal without tip insertion. Slowly release the pressure exerted on the bulb and the fluid will withdraw back into the tip. Repeat 4-5 times using the same tip, bulb, and fluid to obtain a sufficient number of cells in a single sample. Place the fluid on glass slide, and allow the smear to completely dry at room temperature. Once dry, these estrous smears can be stored for later use, or they can be stained immediately using the Wright-Giemsa stain, which is a one-step stain and does not requiring fixation. The slide is placed in the stain for 45 to 60 seconds.

On the other hand, for swabbing, wet a 2 mm cotton-tipped applicator with saline. Insert the tip of the applicator into the vagina of the restrained mouse and gently turn and roll the tip against the vaginal wall. Then remove the swab carefully and transfer the cells to a dry glass slide by rolling the swab across the slide. This procedure is considered stressful and can cause damage if not performed gently, with proper restraint, and with the correct sized cotton swabs. Like lavage, once the slide is dry, it can be stained with the Wright-Giemsa stain. Following staining, the slides can be examined under a microscope.

If the female is in proestrus, the cells are seen as clusters of round, well-formed, nucleated epithelial cells with a nucleus that stains darker than the cytoplasm. If she is in estrus phase, the majority of the cells are cornified squamous epithelial cells that lack a nucleus. They are angular in appearance and are in densely packed clusters. If the female is in metestrus, the cells are typically white blood cells, specifically neutrophils, with some cornified squamous epithelial cells present. During diestrus, the cells present are normally white blood cells with the occurrence of a few nucleated epithelial cells.

Now that you have an understanding of the rodent estrous cycle, let’s discuss how to set-up mating. First step is determination of the sex, which is done by comparing the anogenital distances. In females, the distance between the anus and the external genitalia is shorter than it is for the males. Based on research needs and the strain’s breeding efficiency, the mating scheme can be monogamous — where one female is bred to one male OR polygamous — where two or more females are bred to one male.

In terms of timing, given that the rodent estrous cycle is short-only 4-5 days long-one can set up mating randomly. Or they can set up “timed mating”, which involves introducing female to the mating cage when she is at the point of maximum receptivity and fertility-that is during the proestrus or the estrus phase. In either case, the mating should be set up at the end of a day, as rodents are nocturnal and tend to mate at night. The following morning, the female is examined for a copulatory plug – a whitish mass consisting of vaginal fluid and semen that persists for 12-24 hours post-copulation. If the copulatory plug is not visually obvious, gently insert the tip of a blunt probe into the vaginal opening. The presence of a copulatory plug will impede the advancement of the probe within 0.5 cm of the vaginal opening. In case of random mating, copulatory plug appearance commonly takes three days. The presence of a plug confirms mating does not guarantee that the female is pregnant.

Once a copulatory plug is observed, the female should be monitored for signs of pregnancy such as weight gain. If the plugged female is pregnant, then the day the plug was found is embryonic day zero or E0 and the next day is considered as the first day of gestation, or E1, and so on right up to parturition-that is giving birth-which is between 19 to 21 days. Approximately 20-24 hours post partum, both female rats and mice undergo an estrus and can conceive again.

In an intensive breeding scheme, which is commonly used for animals with a short breeding life span due to a genetic mutation, the male animals are left in the cage with the female and pups, so that the female can conceive another litter immediately. This scheme can be stressful to the female as she is continually lactating and gestating. On the contrary, the non-intensive breeding scheme, involves separating the female once she is visibly pregnant, and not returning her to the male’s cage until her litter has been weaned, making this a less demanding breeding scheme.

There are many factors that can influence the breeding performance of mice and rats. Let’s review some of them, which come up more frequently. The vigor of female breeders largely depends on the level of inbreeding. Animals that are outbred are much more hardy and vigorous, thus they produce larger and stronger litters. Another factor that can affect breeding performance is aggressive behavior. Some commonly used strains, such as C57BL/6 mice, have a tendency to display aggression, which can interfere with breeding. When breeding an aggressive strain, all litters should be closely watched. Animals from a litter containing aggressive pups should not be used for breeding. Temperature, humidity, and lighting fluctuations can cause decreases in breeding efficiency. Noise and vibrations within the breeding rooms have also been shown to cause deleterious effects. Animals with genetic modifications tend to be less hardy and fertile, and some of the mutations may result in lethality of the pups before or soon after birth.

Now let’s briefly review how to wean pups of these lab animals. The time to start weaning differs with the breeding scheme. In case of non-intensive breeding, the young may be weaned at 21-28 days of age. But in case of intensive breeding, the pups of each litter are weaned at day 20 to prevent the older pups from being present when the next litter in born. Since rodents can begin mating as young as 8 weeks, male and female pups are separated at weaning. Whenever possible, newly weaned pups should not be housed singly.

If a litter contains only one pup of a given sex, attempts should be made to house this pup with pups of the same gender from another litter. The possible housing options for weaning pups are listed in the manuscript below. Weanling mice and rats should be checked daily to assure that they are thriving. For food supply, a small amount of food, one pellet per mouse, should be placed on the cage floor for the first 7-10 days, with additional food in the cage top. This will encourage the animals to transition to having rodent chow as their sole food source. For water supply, a bottle should be added even if the animals are housed on racks with automatic watering system. This is to prevent dehydration.

Lastly, let’s see how scientists are using the in-house breeding approach to their advantage. One of the most common applications of setting up mating is to develop mice with altered genotype. To study a gene’s function, researchers often disrupt its genetic code. However, these animals like humans are diploid and thus have two copies of the same gene. Therefore, in order to disrupt the gene completely, the altered mice need to be bred to produce an animal with both copies dysfunctional, in other words a homozygous knockout. Mice with one copy dysfunctional are called heterozygous or hets.

The other advantage of setting up in-house mating is testing the effect of prenatal exposure to test compounds. For example, here researchers provided pregnant female a liquid diet containing alcohol from E7 to E13. Then on E13, they dissected the pregnant female, obtained fetal brains, and sliced them into thin sections. Lastly, staining of the slides revealed that prenatal alcohol exposure increased cell death in the neural tissue.

Finally, in-house breeding also allows for the study of post pregnancy disorders like postpartum depression. In this study, scientists first moved the litter away from the dam during the lactating period. Then, 60 minutes later, reintroduced the pups to the dam. And to induce stress in the female, added a novel male intruder to the cage. Then, the researchers observed the dam for maternal aggression, which includes attacking and biting of the intruder male as well as for different maternal care behaviors like pup grooming, and nursing. The data obtained revealed that stress has a significant effect on both postpartum maternal aggression and care.

You’ve just watched JoVE’s video on fundamentals of breeding and weaning mice and rats in the laboratory. You should now have a better understanding of the rodent estrus cycle and also know how to determine the cycle stage and how to use it to set-up successful mating schemes. We also reviewed the factors that can affect the breeding behavior, and explained how and when to wean mice and rat pups. As always, thanks for watching!

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